Tiểu luận: Phương pháp PCR và ứng dụng

Chia sẻ: Cao Thị Dung | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

301
lượt xem 56
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được nghiên cứu nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về các nguyên tắc, chỉ tiêu ảnh hưởng, ứng dụng và hạn chế của phương pháp PCR. Từ đó người viết có những kiến thức cơ bản phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài của luận văn cũng như việc tiến hành các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm sau này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiểu luận: Phương pháp PCR và ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HA NỘI KHOA SINH HỌC BÀI TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Lý luận và phương pháp dạy học Sinh học Người hướng dẫn: GS.TS. Nguyễn Thành Đạt PGS.TS. Đặng Hữu Lanh Sinh viên thực hiện: Cao Thị Dung L ớp: Sinh CHK24 1
Hà Nội2015 2
3
4
MỞ ĐẦU Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) do Kary Mullis phát hiện ra năm 1985. Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn AND nào đó, có độ nhạy rất cao mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế. Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các tính chất của quá trình tái bản AND. Nhưng nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việc tách dòng và thao tác với AND dễ dàng và hiệu quả hơn. PCR là kỹ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử. Việc sử dụng kỹ thuật PCR trong lĩnh vực AND tái tổ hợp đã tạo ra một bước tiến mang tính cách mạng đối với di truyền học phân tử nói riêng cũng như với sinh học phân tử nói chung, nhờ việc cho phép phân lập, xác định các gene và đi sâu nghiên cứu chức năng cũng như biểu hiện của gen trong quá trình phát triển, hoặc phản ứng của gen đối với các điều kiện môi trường. Nó cho phép ta tiến hành những nghiên cứu mà trước đây không có khả năng thực hiện. Kỹ thuật này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di truyền ở người, di truyền quần thể, phân tích pháp y, … Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại về số lượng vật chất di truyền cần có. Các phương pháp tạo dòng invitro đã biết tuy giải quyết được vấn đề về số lượng nhưng lại đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian dài. Sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại invitro có chọn lọc, trong số đó nổi tiếng nhất phải kể đến phương pháp PCR đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo dòng cổ điển, mở ra những triển vọng ứng dụng to lớn. Chính vì vậy tôi đã quyết định nghiên cứu đề tài “Phương pháp PCR và ứng dụng”. Đề tài được nghiên cứu nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về các nguyên tắc, chỉ tiêu ảnh hưởng, ứng dụng và hạn chế của phương pháp PCR. Từ đó có những kiến thức cơ bản phục vụ cho việc nghiên cứu đề tài của luận văn cũng như việc tiến hành các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm sau này. 1
Để đạt được điều đó, đề tài đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu như phương pháp thu thập, xử lý thông tin, phương pháp phân tích, tổng hợp, hệ thống hóa thông tin… Ngoài phần Mở đầu, Kết luận, bài tiểu luận bao gồm những nội dung sau: 1. Sự phát hiện ra phương pháp PCR. 2. Phương pháp PCR và ứng dụng. 2
1. SỰ RA ĐỜI CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR 1.1. Khái niệm PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được gọi là “phản ứng chuỗi trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen”. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men [7]. Một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn [3]. Điều đó xảy ra trong phản ứng tổng hợp invitro sử dụng DNA polymerase và các oligonucleotide (các mồi – primers). Đó chính là kết quả tuyệt vời của phản ứng PCR. Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn mạch DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mồi oligo tạo liên kết với từng sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA invitro nhờ enzyme DNA polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA ban đầu làm khuôn rất nhỏ (cỡ 103μg) [3]. Như vậy, PCR là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của hai mồi oligonucleotide gắn vào hai sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. 1.2. Lịch sử của phương pháp PCR Vào năm 1985, trong một đêm trăng sáng ở tiểu bang California, trên đường lái xe dọc theo bờ 3
biển, một ý tưởng chợt xuất hiện trong đầu của một nhà sinh hóa học rất bình thường, làm việc cũng tại một phòng thí nghiệm rất bình thường. Ý tưởng này khi trở thành hiện thực, chính là thử nghiệm PCR, đã làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử và đã đưa tác giả của nó, K.B Mullis, đến giải Nobel danh giá. Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase [7]. DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (invitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 °C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR. Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110 °C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA [7]. Từ đó, không cần phải thêm DNApolymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn. Một trong những DNApolymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được 4
phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA. PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base = 1000 cặp base). Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thước lên đến 40kb, ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào Eukaryote (ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỷ cặp base) [6]. 1.3. Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử 1.3.1. Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tiến đầu tiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn. Nhờ sự sử dụng các men polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích được đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn. Cho đến nay đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện và tổng hợp ra. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu). Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng hợp từ các vi khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vaent (exo). Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3’5’ exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu. Nh ờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sử dụng cho đúng mục đích của mình. 5
Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus 1.3.2. Máy chu kỳ nhiệt Trước đây khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng cách liên tục chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy cách thủy có nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Sau đó công việc bằng tay nhàm chán va nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt bao gồm các bộ phận chính như sau: + Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện. + Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đến buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện. 6
+ Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua sự điều khiển của bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Để làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ, có hai phương pháp: (1) Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạnh. Với phương pháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạt động âm thanh cũng khá ồn ào. (2) Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu quả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử. 2. PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG CỦA NÓ 2.1. Sự khác nhau giữa tái bản DNA trong tế bào và trong invitro Trong tế bào, DNA được tái bản dựa theo nguyên tắc bảo tồn, tức là mỗi phân tử con được hình thành từ một mạch cũ và một mạch mới, ở mạch ra chậm 5’→3’ theo nguyên tắc nửa gián đoạn là hình thành các đoạn okazaki, và theo nguyên tắc bổ sung AT, GC. Qúa trình nhân đôi mở đầu nhờ enzyme tháo xoắn. Sự tái bản bắt đầu bằng sự tổng hợp mồi RNA. Qúa trình tái bản DNA trong tế bào diễn ra trong điều kiện nhiệt độ thường, mang tính chất chính xác rất cao. 7
Còn tái bản DNA trong invitro lại diễn ra như sau: Phải đun nóng DNA khuôn đến gần 1000C và phải dùng DNApolymerase ưa nhiệt (chịu nhiệt) để tác động đến mạch 5’→3’ ở 32800C, tốc độ 150Nu/s. Hơn nữa cần có đoạn mồi ngắn chặn hai đầu của đoạn nhân lên, cả hai mạch đều có thể dùng làm khuôn nếu đoạn mồi được cung cấp cho cả hai mạch. Sau n phản ứng, về lý thuyết sẽ được 2n bản sao DNA nằm giữa hai đoạn mồi. Tái bản xáy ra kém chính xác hơn trong tế bào, sai sót khoảng 10 4 do Taq polymerase. 2.2. Nguyên tắc và các giai đoạn của phương pháp PCR Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nú ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: (1) Giai đoạn biến tính (denaturation): Nhiệt độ tăng lên 9496°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để 8
đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 12 phút [7]. Một số chú ý trong giai đoạn này: + Việc tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian biến tính có thẻ làm tăng tính đặc hiệu của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase. + Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độ biến tính 95980C. Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến tính ngắn trước từng chu kỳ nhiệt. + Đối với các genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến 5 phút. Để làm giảm ảnh hưởng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA polymerase sau khi biến tính ban đầu. + Khi đã tối ưu PCR thì cần giảm tối thểu thời gian biến tính mỗi chu kỳ để tăng lượng sản phẩm, thông thường từ 1030s. + Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt (PCR machine, thermocylcer) là khác nhau, phụ thuộc hãng sản xuất. (2) Giai đoạn bắt cặp (anealation) : Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (4560°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 12 phút. Một số chú ý trong giai đoạn này: + Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất +30C. + Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng gradient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0,50C). 9
+ Đối với các cặp Tm cao hoặc tự bắt cặp, có loop thì có thể khắc phục bằng PCR hai bước (950C và 680C). (3) Giai đoạn kéo dài chuỗi (elongation): DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNApolymerase. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào cả DNApolymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại, như một quy tắc 1000bp/1 phút. Những chú ý trong giai đoạn kéo dài: + Nhiệt độ kéo dài thường ở 720C, tuy nhiên hoạt tính 5’3’ DNA polymerase vẫn xảy ra ở nhiệt độ 680C. + Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. Đối với DNA đồng chất (plamid, lambda hoặc BAC DNA) thì tốc độ có thể đạt tới 15 s/kb; đối với DNA genome lớn, phức tạp thì tốc độ thường 30s1min/kb. Cuối cùng sau một số chu kỳ, số lượng sợi DNA có kích thước duy nhất chiếm ưu thế tuyệt đối trong phản ứng. N = (2n – 2n). x .Trong đó: n: Số chu kỳ. 2n: Số phân tử có chiều dài không xác định. x: Số phân tử khuôn ban đầu. N: Số sợi tổng hợp được trong phản ứng. 2n: Số phân tử có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai mồi. 10
Hình 1: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ. (1) Nóng chảy ở 96°C. (2)Gắn mồi ở 68°C. (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase). (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ. 11
Hình 2: Các chu kỳ của kỹ thuật PCR 2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose Điện di agarose thường được sử dụng để xác định sản phẩm PCR dựa trên khả năng phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau khi sản phẩm PCR di chuyển qua mạng lưới các vi lỗ có trong gel agarose. Do phân tử DNA tích điện âm cao, khi phân tử DNA được đặt dưới một điện trường xác định, những phân tử DNA tích đện âm này sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Trong trường hợp điện di agarose, chúng sẽ di chuyển qua gel agarose được đặt trong dung dịch đệm điện di. Các phân tử càng nhỏ có khả năng di chuyển càng nhanh trong gel agarose về phía cực dương so với các phân tử DNA lớn hơn. Nguyên tắc này cho phép kỹ thuật điện di phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Hình 3: Bộ sản phẩm điện di Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch đặt mẫu (loading gel) chuyển vào các giếng trên gel agarose để thực hiện phân tách dưới tác động của điện trường. Gel agarose có chứa sẵn Ethidium bromid, vì thế khi DNA di chuyển trong gel agarose sẽ tạo liên kết với Ethidium bromide. Dung dịch đặt mẫu (loading gel) chứa chất có tỷ trọng nặng (như đường sucrose hoặc glycerol) để lôi cuốn DNA xuống đáy giếng trên bản gel agarose và ngăn cản không cho DNA khuếch tán vào dung dịch đệm điện di. Ngoài ra, trong 12
dung dịch đặt mẫu còn chứa chất chỉ thị tích điện âm. Chất chỉ thị di chuyển cùng với DNA giúp cho dễ dàng ước lượng sự di chuyển của DNA trong bản gel. Chất chỉ thị thường dùng là Xylene cyanol và Bromophenol blue. Chúng di chuyển cùng với những phân tử DNA có chiều dài tương ứng lần lượt là 5000bp và 300bp. Đệm điện di: Đệm điện di giúp ổn định các điều kiện môi trường, cho phép quá trình di chuyển của DNA được ổn định trong suốt quá trình điện di. Có một vài loại đệm điện di thường dùng trong phân tích điện di agarose như: Tris acetate EDTA (TAE), Tris/Borate/EDTA (TBE). Khả năng đệm của dung dịch đệm TAE thấp hơn so với TBE. Tuy nhiên, TAE lại cho phép phân tách tốt đối với những đoạn DNA lớn hơn. Điều này đồng nghĩa với việc phải dùng điện thế thấp hơn và mất thời gian điện di nhiều hơn. Kết thúc quá trình điện di, bản gel sẽ được đặt dưới tác động của tia UV, các đoạn DNA sản phẩm PCR sau khi phân tách theo kích thước sẽ được hiển thị dưới dạng băng vạch màu vàng sáng tại những vị trí khác nhau tương ứng với kích thước chiều dài của chúng. Hình 4: Phân tích sản phẩm sau khi chụp UV Ethidium brommide có sẵn trong bản gel sẽ chèn vào giữa các base nitơ của phân tử DNA dẫn đến chúng bám vào phần trung tâm của phân tử DNA. Sự 13
phát sáng là do phức hợp DNAEthidium bromide phát ra khi chịu tác động của tia UV. 2.4. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR Một phản ứng PCR điển hình bao gồm các thành phần sau: + DNA (0,010,1μg) + Mồi 1 (20pmol) + Mồi 2 (2pmol) + TrisHCl (20Mm; Ph 8,0) + MgCl2 (2mM) + KCl (25mM) hoặc KCl (10mM) và (NH4)2SO4 (10mM) + Deoxynucleotide triphosphat (50μg mỗi loại dATP, dGTP, dCTP, dTTP) + DNA polymerase chịu nhiệt (2 đơn vị) + Tổng thể tích phản ứng 50100μl 2.4.1. DNA khuôn Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1μg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn. Gần như bất kỳ loại DNA nào, dù là mạch thẳng, mạch vòng, DNA plasmid, DNA hệ gen, cDNA,… đều có thể làm khuôn cho phản ứng PCR. DNA láy từ nguồn nào không quan trọng, yêu cầu duy nhất là vị trí gắn các mồi và trình tự giữa chúng còn nguyên vẹn. Đã có những mẫu DNA mà tuổi đến hơn 7000 năm vẫn được sử dụng rất thành công trong các phản ứng PCR. 2.4.2. Mồi và nhiệt độ lai Đoạn mồi là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (1830), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi này biens tính thành sợi đơn. Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính: Một là quyết định nên tính đặc 14
hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp trên chuỗi DNA khác thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. Vai trò thứ hai là khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là primer set, trong đó có một mồi lên gọi là upstream primer và một mồi xuống gọi là downsteam primer. Cặp mồi này quyết định kích thước của sản phẩm PCR. Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu. Vệc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một số quy tắc sau [5]. Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng bới các trình tự lặp lại trên gen. 2.4.3. Enzyme Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Vì đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lại thấp khiến sự ký sinh rất cao...). Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này – Taq polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. 15
Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. VentTM DNA polymerase cô lập từ Thermococcus litoralis – một vi khuẩn cổ tìm thấy ở dưới đáy đại dương tại nhiệt độ đạt tới 980C. Enzyme này có tính chịu nhiệt cao hơn Taq DNA polymerase, coa khả năng nhân bản các sản phẩm có kích thước lên đến 13kb. Tính trung thực trong nhân bản của VentTM DNA polymerase cao do enzyme có thêm hoạt tính sửa sai 3’5’ exonuclease. Pfu DNA polymerase được cô lập từ vi khuẩn cổ đại dương Pyrocccus furiosus hay Ultma DNA polymerase (từ Thermotoga maritima) cũng có tính trung thực cao nhờ hoạt tính tương tự. Tth polymerase là một enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn++; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. 2.4.4. Một số yếu tố khác Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ 20200 μΜ/mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase [1]. Trong môi trường, một số ion có ảnh hưởng đến PCR. Chẳng hạn như, nồng độ ion Mg++ qúa thấp sẽ làm giảm hieuj quả nhân bản, còn quá cao sẽ tạo sản phẩm không đặc hiệu. Nếu Mg++ kích thích phản ứng tổng hợp DNA thì KCl lại ức chế quá trình khuếch đại đoạn DNA dài [3]. Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer (dung dịch đệm) được sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo. Dung dịch đệm thường chứa muối đệm Tris HCl 10mM, KCl 50mM và MgCl2 21,5mM. Ngoài ra còn có thể chứa 0,001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide [6]. 16