Bài giảng Các thử nghiệm miễn dịch immunoassay - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:32

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Các thử nghiệm miễn dịch (Immunoassay) trình bày nguyên lý, phân loại và ứng dụng của các kỹ thuật miễn dịch định tính và định lượng, như ELISA, RIA, FIA và các xét nghiệm nhanh. Bài giảng giúp sinh viên nắm vững cơ sở khoa học và cách ứng dụng các phương pháp immunoassay trong chẩn đoán, nghiên cứu và theo dõi điều trị trong y học và dược học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Các thử nghiệm miễn dịch immunoassay - ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương

“CÁC THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH” IMMUNOASSAY ThS. Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn 1
Nội dung 1. Mục tiêu, nguyên lý 2. Một số kỹ thuật thông dụng: ➢ Immumoprecipitation, flow cytometry ➢ Western blot ➢ ELISA ➢ Lateral Flow Immunoassay Systems ➢ Immunohistochemistry (IHC)/Immunocytochemistry (ICC) 2
Tài liệu tham khảo [1] David Wild (2013). The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques (4th ed.). Elsevier Science 3
Mục tiêu – nguyên lý Phát hiện một protein/kháng thể bằng một kháng thể/protein nhờ tương tác kháng nguyên – kháng thể. Nguyên lý các kỹ thuật xuất phát từ ba đặc tính quan trọng của kháng thể: - Linh hoạt - Đặc hiệu - Nhạy 4
5
6
Mục tiêu – nguyên lý Thành phần: - Kháng nguyên: tính đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào kích thước và cấu trúc của kháng nguyên - Kháng thể: + Sản xuất kháng thể: đa dòng, đơn dòng, tái tổ hợp + Các loại: kháng thể bắt giữ (capture Ab); kháng thể sơ cấp (primary Ab); kháng thể thứ cấp(secondary conjugate Ab) 7
8
Các kiểu đánh dấu Đánh dấu phóng xạ I- Cộng hợp enzyme Cộng hợp huỳnh quang Cộng hợp hạt nano 125 - Nhạy, dễ, an - Rất nhạy, dễ, an - Nhạy, đặc hiệu, - Nhanh, dễ, an - Rất nhạy, ổn định, toàn toàn nhiều màu, dễ toàn, giá thấp, giữ lâu - Phải đọc tín hiệu - Cần máy đọc tự động thấy bằng mắt - Nguy hiểm nhanh - Cần máy đọc thường - Độ nhạy và đặc hiệu thấp 9
Các kỹ thuật thông dụng Tạm chia thành các nhóm: - Bắt giữ trong pha lỏng: kết tủa miễn dịch (immunoprecipitation, IP); flow cytometry - Bắt giữ trên giá thể: Western blot, ELISA, Lateral Flow Immunoassay Systems - Bắt giữ trên mô/tế bào: IHC, ICC 10
Kết tủa miễn dịch Bài toán: Xác định protein X tương tác với protein nào trong số các protein Y, Z, W,… X = Pak1-PBD gắn đuôi HA Y = Rac1 11
Kết tủa miễn dịch Bài toán: Muốn thu nhận protein mục tiêu trong một hỗn hợp 12
Western blot Mục tiêu: Phát hiện/định lượng tương đối protein mục tiêu Phân tách hỗn hợp protein theo Phát hiện vạch protein Chuyển thẩm mục tiêu bằng cách lai với kích thước phân tử bằng SDS- lên màng lai kháng thể đặc hiệu PAGE 13
Chuyển thẩm lên màng lai 14
Lai và phát hiện Stain with Ponceau 15
Kết quả ví dụ Câu hỏi: Trong điều kiện nuôi cấy bổ sung selenite, chủng HT22 có tăng cường sản xuất PGC-1α và NRF1 không? 16
ELISA 4 dạng ELISA: - Trực tiếp - Gián tiếp - Sandwich - Cạnh tranh Advantages Disadvantages Faster than other ELISA – the Antigen immobilization is not specific - may cause higher technique has fewer steps background noise than indirect ELISA. Mainly because all proteins in the sample, including the target protein, will bind to the plate Less prone to error – as less reagents Less flexible - each target protein needs a specific conjugated and fewer steps are required primary antibody No signal amplification - reduces assay sensitivity Best for: when analyzing the immune response to an antigen. 17
Advantages Disadvantages High sensitivity - more than one labeled secondary Possibility of background noise - secondary antibody can bind the primary antibody antibody may be cross-reactive Economical - fewer labeled antibodies are needed Longer procedure than direct ELISA technique - Greater flexibility - different primary antibodies can additional incubation step for secondary antibody be used with a single labeled secondary antibody needed Best for: determining total antibody concentration in samples. 18
19
Sandwich ELISA Advantages Disadvantages High sensitivity - 2-5 times more sensitive than direct or indirect ELISA Antibody optimization can be difficult - cross-reactivity may occur between the High specificity - two antibodies are capture and detection antibodies. involved in capture and detection Needs a standardized ELISA kit or tested Flexibility - both direct and indirect antibody pair. detection can be used Best for: analysis of complex samples, since the antigen does not need to be purified prior to measurement. 20