Bài giảng: Thực hành vi sinh ứng dụng

B GIÁO D C & ĐÀO T O

Ộ

Ụ

Ạ

TR

ƯỜ

NG Đ I H C K THU T CÔNG NGH TP.HCM Ậ

Ạ Ọ

Ỹ

Ệ

KHOA MÔI TR

NG & CÔNG NGH SINH H C

ƯỜ

Ọ

Ệ

BÀI GI NGẢ

TH C HÀNH

Ự

VI SINH NG D NG Ứ

Ụ

TS. Nguy n Hoài H ng

Biên so n: ạ

ươ

ễ

1

- 2009 -

2

Gi

i thi u môn h c

ớ

ọ

ệ

Môn th c hành vi sinh ng d ng nh m giúp sinh viên làm quen v i các ph ằ ự ứ ụ ớ ươ ậ ng pháp phân l p,

kh o sát các vi sinh v t đ c ng d ng trong x lý môi tr ng, công ngh lên men . Các vi sinh ậ ượ ứ ử ụ ả ườ ệ

ng đ c phân l p t môi tr ng t ứ ng d ng th ụ ườ ượ ậ ừ ườ ự ơ ấ nhiên, chúng có kh năng s d ng các c ch t ử ụ ả

khác nhau, chuy n hóa v t ch t trong t nhiên. Ngu n phân l p chúng có th t đ t, n ể ậ ấ ự ể ừ ấ ậ ồ ướ ộ c, đ ng

v t, th c v t hay th c ph m. Phân l p, xác đ nh ch c năng, đ nh danh chúng là b ậ ự ự ứ ậ ẩ ậ ị ị ướ ư c đ u đ a ầ

chúng vào ng d ng. ứ ụ

Trong khuôn kh bài th c hành môn vi sinh ng d ng sinh viên phân l p vi sinh v t ch y u t ủ ế ừ ự ứ ụ ậ ậ ổ

môi tr ng đ t. Đ t là m t trong nh ng c ch t thu n l ườ ơ ấ ậ ợ ữ ấ ấ ộ ạ i nh t đ i v i s phát tri n c a các lo i ấ ố ớ ự ể ủ

vi sinh v t khác nhau. S l ng vi sinh trong 1 g đ t có t i hàng trăm tri u, th m chí hàng t t ố ượ ậ ấ ớ ỉ ế ệ ậ

bào. Ho t đ ng s ng c a vi sinh v t đ t có liên quan đ n nhi u quá trình x y ra trong đ t, tr ậ ấ ạ ộ ủ ế ề ả ấ ố ướ c

nhiên nh chu trình carbon, chu trình nit h t là các vòng tu n hoàn c a v t ch t trong t ế ủ ầ ậ ấ ự ư ơ ,

phospho và l u huỳnh. ư

Các b c chung c a bài th c hành là ướ ủ ự

1. Phát hi n các nhóm vi sinh v t trong m u đ t bao g m đ i di n c a m t s nhóm phân ệ ủ ộ ố ệ ậ ẫ ấ ạ ồ

lo iạ

2. Nghiên c u m t s đ c đi m sinh tr ng và hình thái t bào h c t ộ ố ặ ứ ể ưở ế ọ ế ệ bào c a các đ i di n ủ ạ

thu c vi sinh v t phân l p đ c. ậ ượ ậ ộ

N I DUNG TH C HÀNH

Ộ

Ự

BÀI 1: VI KHU N AMÔN HÓA Ẩ

BÀI 2: VI KHU N NITRAT HÓA Ẩ

BÀI 3: VI KHU N PH N NITRAT HÓA Ẩ Ả

BÀI 4: VI KHU N C Đ NH NIT Ẩ Ố Ị Ơ

BÀI 5: VI SINH V T PHÂN GI I CELLULOSE Ậ Ả

3

BÀI 1: VI KHU N AMÔN HÓA Ẩ

I. Lý thuy tế

Quá trình amôn hóa là quá trình phân gi i protein và các h p ch t h u c khác có ch a nit ả ấ ữ ơ ứ ợ ơ

t o thành amoniac. Các vi sinh v t có kh năng amôn hóa bao g m nhi u loài sinh bào t ạ ề ậ ả ồ ử ặ ho c

không sinh bào t ử ề , có kh năng s d ng nhi u ngu n v t ch t khác nhau. Ngoài ra còn nhi u ậ ử ụ ề ả ấ ồ

lo i x khu n và n m khu n ty. Tuy v y, nh ng vi sinh v t ch s d ng riêng m t lo i protein ỉ ử ụ ạ ạ ữ ạ ẩ ấ ẩ ậ ậ ộ

thì không nhi u. ề

Các vi sinh v t này có kh năng ti t men phân gi i protein vào môi tr ng, th y phân thành ậ ả ế ả ườ ủ

các amino acid. Khi đó, chúng s d ng các amino acid này trong quá trình d hóa và đ ng hóa. Các ử ụ ổ ị

3 và H2S.

i protein là NH s n ph m đ c tr ng c a quá trình phân gi ả ư ủ ẩ ặ ả

Quá trình phân gi ả ề i protein có th x y ra trong các đi u ki n hi u khí và k khí. Trong đi u ể ả ề ệ ế ỵ

ki n hi u khí, các h p ch t h u c có ch a nit c phân gi i b i các loài trong gi ng Bacillus ấ ữ ơ ứ ệ ế ợ đ ơ ượ ả ở ố

và Pseudomonas, các đ i di n trong h ọ Enterobacteriaceae, các x khu n và n m khu n ty. ạ ệ ẩ ạ ẩ ấ

Trong đó, vai trò quan tr ng và ch y u nh t là gi ng Bacillus. Trong đi u ki n k khí thì các ủ ế ấ ọ ố ề ệ ỵ

Clostridium tham gia quá trình chuy n hóa này. Còn trong đi u ki n thông khí loài trong gi ng ố ể ề ệ

h n ch , quá trình amôn hóa đ ạ ế ượ c th c hi n b i các loài vi khu n và tr c khu n k khí tùy nghi. ẩ ự ự ệ ẩ ớ ỵ

II. Th c hành ự

ng các vi sinh v t amôn hóa đ Vi c phát hi n và xác đ nh ệ ệ ị s l ố ượ ậ ượ ấ c th c hi n b ng cách c y ằ ự ệ

các m u phân tích vào môi tr ng l ng và r n canh th t-peptone. ẫ ườ ắ ỏ ị

Vi c c y lên môi tr c ti n ệ ấ ườ ng th ch đ ạ ượ ế hành b ng d ch huy n phù đã thanh trùng Pasteur ề ằ ị

nh m tiêu di t các t bào sinh d i bào t ằ ệ ế ưỡ ng và ch còn gi ỉ l ữ ạ ử ủ ố c a các đ i di n thu c gi ng ệ ạ ộ

Bacillus – gi ng đ c tr ng nh t cho quá trình amôn hóa. ư ặ ấ ố

ng th ch cho phép nh n đ nh đ Ngoài ra, vi c c y lên môi tr ệ ấ ườ ạ ậ ị ượ ủ c các đ c tính khác nhau c a ặ

khu n l c các vi khu n khác nhau này. ẩ ạ ẩ

1. Môi tr ngườ - hóa ch tấ

Môi tr ườ ng canh th t- peptone: ị

5g Cao th t ị

Peptone 10g

1000ml N cướ

Môi tr ườ ng th ch: ạ

4

Tr n vào môi tr ộ ườ ng l ng 2 ỏ % th ch.ạ

Dung d ch pha loãng m u c mu i sinh lý ti t trùng. ẫ : dung d ch n ị ị ướ ố ệ

Gi y l c lo i th m acetate chì ấ ọ ạ ấ

Gi y quỳ đ ỏ ấ

Các lo i thu c nhu m quan sát vi sinh v t: thu c nhu m Gram và thu c nhu m bào t , ạ ậ ố ộ ố ộ ố ộ ử

Thu c th Nessler ử ố

2. D ng cụ ụ

Các d ng c pha ch môi tr ng ụ ụ ế ườ

Các d ng c c y, kh trùng ụ ấ ụ ử

Kinh hi n vi ể

3. Ti n hành thí nghi m ế ệ

ng: Chu n b môi tr ị ẩ ườ

Môi tr c phân vào kho ng 1/3 chi u cao ng nghi m ườ ng canh th t-peptone đ ị ượ ệ , khử ề ả ố

trùng 1 atm, 15 min. ở

c cho vào đĩa petri, h p kh trùng 0,5 Các d iả gi y quỳ và gi y l c th m acetat chì đ ấ ọ ấ ấ ượ ử ấ ở

atm.

Môi tr ng th ch canh th t-peptone: sau khi h p kh trùng đ c phân vào các đĩa petri, ườ ử ạ ấ ị ượ

OC

gi 30 ữ ở

Chu n b m u: ị ẫ ẩ

M u đ t đ c pha v i n c đ thu d ch huy n phù ấ ượ ẫ ớ ướ ể ề ị

• Ủ vi sinh v t trên môi tr ậ ườ ng l ng: ỏ

5 – 1010

C y t các d ch pha loãng n ng đ 10 ấ ừ ồ ộ ị

L y 1ml d ch pha loãng c y vào ng nghi m có ch a môi tr ng canh th t-peptone đã kh ứ ệ ấ ấ ố ị ườ ị ử

trùng trên ở

Dùng k p l y các d i ẹ ấ ố ả gi y quỳ và gi y l c th m acetatechì gài vào gi a nút bông và ng ấ ọ ữ ấ ấ

nghi mệ

OC trong 3 ngày đêm.

nhi t đ 28-30 Ủ ở ệ ộ

• Ủ vi sinh v t trên môi tr ậ ườ ng th ch: ạ

2 – 105

C y t các d ch pha loãng n ng đ 10 ấ ừ ồ ộ ị

L y 0,5ml d ch pha loãng cho vào các đĩa petri có ch a môi tr trên ứ ấ ị ườ ng đã kh trùng ử ở

Dùng que trang tr i đ u lên b m t th ch ả ề ề ặ ạ

OC trong 3 ngày đêm.

nhi t đ 28-30 Ủ ở ệ ộ

5

M i môi tr ng ti n hành thêm 1 m u đ i ch ng ỗ ườ ứ ế ẫ ố

4. Quan sát và ghi nh n k t qu ế ậ ả

Đ i v i môi tr ng l ng, quan sát: ố ớ ườ ỏ

S đ c môi tr ng ự ụ ườ

S t o bông, k t c n ế ạ ự ạ

N i váng trên b m t ề ặ ổ

Ph n ng sinh hóa: ả ứ

Màu k t t a v i thu c th Nessler: t thu c th Nessler lên đĩa s tr ng, thêm ế ủ ớ ử ố Nh m t gi ỏ ộ ọ ứ ắ ử ố

n trong peptone broth. Quan sát màu k t t a: m t que c y đ y đ t v ấ ấ ườ ủ ầ ộ ế ủ

Màu vàng nh t – ít ammoniac ạ

Vàng s m – nhi u ammoniac ề ậ

Nâu – r t nhi u ammoniac ề ấ

3 làm gi y quỳ hóa xanh

S sinh NH ự ấ

2S làm gi y l c th m acetate chì hóa đen.

S sinh H ự ấ ọ ấ

ệ . So sánh đ i ch ng và thí nghi m ứ ố

Đ pha Đ c môi T o bông Sinh NH3 Sinh H2S ộ ụ ạ T o c n ạ ặ

loãng tr ng ườ

Nh n xét m c đ , t l xu t hi n cao nh t trong 1g m u ậ ứ ộ ỷ ệ ệ ấ ấ ẫ

Ch n m t đ pha loãng có t vi sinh v t cao nh t làm tiêu b n ộ ộ ọ l ỷ ệ ả và soi kính hi n vi ể ậ ấ

Trên môi tr ngườ th ch, ghi nh n: ạ ậ

S l ng khu n l c trên 1 đĩa m i đ pha loãng ố ượ ẩ ạ ở ỗ ộ

S khu n l c đ c tr ng ẩ ạ ặ ư ố

Quan sát hình thái khu n l c, mô t , ghi nh n vào b ng ẩ ạ ả ả ậ

Đ pha S S Hình thái Kh năng di ộ ố ẩ khu n ố ẩ khu n ệ Xu t hi n ấ ả

loãng l cạ l c ạ ặ đ c khu n l c ẩ ạ bào tử đ ngộ

tr ngư

Ch n m t đĩa có nhi u khu n l c đ c tr ng nh t làm tiêu b n và soi kính hi n vi ư ẩ ạ ặ ể ề ấ ả ọ ộ

So sánh hình thái quan sát đ môi tr ng l ng và môi tr ng th ch c ượ gi a tiêu b n t ả ừ ữ ườ ỏ ườ ạ

6

BÀI 2: VI KHU N NITRAT HÓA Ẩ

I. Lý thuy tế

2. H u h t các vi sinh v t t

Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung c p năng l ấ ượ ạ ng cho vi sinh v t ho t ậ

đ ng. Quá trình oxi hóa này x y ra cùng v i quá trình đ ng hóa CO ộ ả ớ ồ ậ ự ế ầ

d ng hóa năng vô c thu c lo i hi u khí b t bu c đ u có kh năng th c hi n quá trình này. ưỡ ộ ề ự ế ệ ạ ắ ả ơ ộ

Nitrat hóa qua 2 giai đo n:ạ

3 thành nitrit b i m t s đ i di n thu c nhóm vi khu n nitrit ệ

Đ u tiên là giai đo n oxi hóa NH ầ ạ ộ ố ạ ẩ ở ộ

hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...T t c chúng đ u gi ng nhau v ấ ả ề ố ề

m t sinh lý, sinh hóa, ch khác nhau v m t hình thái h c và c u trúc t bào. ề ặ ặ ấ ọ ỉ ế

Các đ i di n c a gi ng ệ ủ ố Nitrosomonas không sinh n i bào t ạ ộ , t ử ế ụ bào nh bé hình b u d c. ầ ỏ

Trên môi tr ườ ng l ng, ỏ ệ Nitrosomonas tr i qua m t s pha, phát tri n tùy thu c m t s đi u ki n. ộ ố ề ộ ố ể ả ộ

Hai pha ch y u là pha di đ ng- t bào có 1 hay chùm tiên mao và pha t p đoàn khu n keo-các t ủ ế ộ ế ậ ẩ ế

bào không di đ ng.ộ

ẩ Giai đo n 2 c a quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat b i m t s vi khu n: ộ ố ủ ạ ở

Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.

T bào đ c tr ng c a ủ Nitrobacter trong d ch nuôi th ư ế ặ ị ườ ạ ng có d ng hình que tròn, hình h t ạ

i chúng đ u, ho c hình tr ng, có th di đ ng ho c không di đ ng. Khi đi u ki n không thu n l ậ ậ ợ ứ ể ề ệ ặ ặ ộ ộ

có th hình thành nh ng t p đoàn khu n keo. Nitrospina gracilis là nh ng tr c khu n th ng, ữ ể ậ ẩ ữ ự ẳ ẩ

ậ m nh d , th nh tho ng có d ng hình c u, không di đ ng, và có đ tr ng là hình thành nh ng t p ặ ư ữ ẻ ả ả ạ ầ ộ ỉ

đoàn khu n keo. Nitrococcus mobilis thì có d ng hình tròn, có tiên mao. ẩ ạ

ẽ ố ớ Vi khu n nitrat hóa không s d ng các ch t h u c và chuy n hóa m t cách ch t ch đ i v i ấ ữ ơ ử ụ ể ẩ ặ ộ

3 và nitrit

vi c oxi hóa c ch t-NH ơ ấ ệ

II. Th c hành ự

Vi c phát hi n và xác đ nh s l đ c th c hi n b ng cách c y d ch ố ượ ệ ệ ị ng vi khu n nitrat hóa ẩ ượ ự ệ ấ ằ ị

huy n phù c n phân tích lên môi tr ng ch n l c vô c Winogradski. Ngu n C duy nh t trong ề ầ ườ ọ ọ ấ ơ ồ

2 có trong không khí và trong thành ph n c a CaCO

môi tr ng này là CO 3. Nguyên li u năng ườ ủ ầ ệ

3 và mu iố

ng và ngu n N cho các vi khu n gây ra giai đo n đ u c a quá trình nitrat hóa là NH l ượ ầ ủ ẩ ạ ồ

amon, còn đ i v i vi khu n gây ra giai đo n hai là nitrit. ố ớ ẩ ạ

Đi u ki n c n thi ệ ề ầ ế ố ớ ự t đ i v i s phát tri n c a vi khu n nitrat hóa là vi c thông khí đ y đ ẩ ủ ể ệ ầ ủ

vào môi tr ng vi khu n nitrat hóa đ c xác đ nh b ng ph ng pháp pha ngườ nuôi c y. S l ố ượ ấ ẩ ượ ằ ị ươ

loãng t i h n. ớ ạ

7

1. Môi tr ườ ng- hóa ch t ấ

ng Winogradski: Thành ph n môi tr ầ ườ

2 g/l (NH4)2SO4

1 g/l K2HPO4

MgSO4 0,5 g/l

FeSO4 0,4 g/l

NaCl 2 g/l

3. H p kh trùng

Chia vào các bình th y tinh 50ml, cho vào m i bình m t ít CaCO 1 atm ủ ộ ỗ ử ấ ở

Dung d ch pha loãng m u ẫ ị

Các lo i thu c nhu m quan sát vi sinh v t ậ ạ ộ ố

Tinh th diphenylamin ể

H2SO4 đ m đ c ặ ậ

2. Ti n hành thí nghi m ế ệ

ng: Môi tr ng đã h p kh trùng đ c phân vào các ng nghi m Chu n b môi tr ị ẩ ườ ườ ử ấ ượ ệ ố

Xác đ nh vi sinh v t trên môi tr ậ ị ườ ng l ng: ỏ

2 - 105

Pha loãng m u 10 ẫ

ng đ kh trùng M i đ pha loãng l y 1ml m u c y vào ng nghi m có ch a môi tr ấ ỗ ộ ứ ệ ẫ ấ ố ườ ử ả ở

trên

OC trong 2-3 tu nầ

28-30 Ủ ở

Làm 1 ng nghi m đ i ch ng ứ ệ ố ố

3. Quan sát và ghi nh n k t qu : ả ậ ế

m i đ pha loãng, ghi nh n s thay đ i môi tr Ở ỗ ộ ậ ự ổ ườ ng trong ng nghi m ố ệ

Nh ng ng nghi m nào ghi nh n có vi khu n phát tri n, c n ti n hành th nghi m đ nh tính. ữ ố ử ệ ể ế ệ ậ ẩ ầ ị

2SO4 đ m đ c. Sau

Ph n ng đ nh tính nitrat: L y vài tinh th diphenylamin hòa tan trong 1 gi t H ả ứ ể ấ ị ọ ặ ậ

đó thêm 1 gi ọ ị t d ch c n ki m tra. Ti n hành trên b n s tr ng s th y xu t hi n màu xanh th m. ả ứ ắ ẽ ấ ế ể ệ ẩ ầ ấ

Ghi nh n k t qu vào b ng ế ậ ả ả

Đ pha loãng Ố ệ ng nghi m ộ

số

102 NO2- NO3- 103 NO2- NO3- NO3- NO3- 104 NO2- 105 NO2-

8

ng tính làm tiêu b n quan sát d i kính hi n vi. C n l u ý Ch n ng nghi m có k t qu d ệ ọ ố ả ươ ế ả ướ ầ ư ể

3, vì xung quanh h t này, t

c c nh ng h t CaCO vi khu n là cao nh t. Miêu t , so ch n đ ọ ượ ả ữ ạ ạ l ỷ ệ ẩ ấ ả

sánh hình thái các t ế bào vi khu n quan sát đ ẩ ượ ạ ậ c (hình d ng, kh năng di đ ng, kh năng t o t p ạ ả ả ộ

đoàn khu n keo). Nh n xét loài nào chi m u th nh t. ế ư ế ẩ ậ ấ

9

BÀI 3. VI KHU N PH N NITRAT HÓA

Ả

Ẩ

I. Lý thuy tế

Ph n nitrat hóa là quá trình vi sinh v t th c hi n vi c kh nitrat thành nitrogen phân t ử ự ệ ệ ậ ả ử ồ , đ ng

th i oxi hóa các ch t h u c nh đ ng, r u, axit h u co thành CO ấ ữ ơ ư ườ ờ ượ ữ ệ 2 và H2O v i ch t nh n đi n ậ ấ ớ

3. Năng l

cu i cùng là NO ng sinh ra khi oxi hóa c ch t đ t ử ố ượ ấ ượ ơ c vi sinh v t s d ng trong quá ậ ử ụ

trình ho t đ ng s ng c a mình. ạ ộ ủ ố

Quá trình ph n nitrat hóa có th x y ra trong đi u ki n hi u khí l n k khí, nh ng đ c bi ể ả ư ệ ề ế ặ ẫ ả ỵ ệ t

m nh trong đi u ki n k khí. ề ệ ạ ỵ

Các vi sinh v t th c hi n quá trình này phân b r t r ng rãi trong t ố ấ ộ ự ệ ậ ự nhiên. Ph n l n chúng ầ ớ

thu c lo i d d ng hóa năng h u c , k khí tùy nghi g m m t s gi ng Pseudomonas, ị ưỡ ạ ộ ộ ố ữ ố ồ ơ ỵ

Achromobacter, Micrococcus …

II. Th c hành ự

ng c a chúng đ Vi c phát hi n vi khu n ph n nitrat hóa và xác đ nh s l ả ố ượ ệ ệ ẩ ị ủ ượ ệ c th c hi n ự

ng pháp c y m u lên môi tr ng ch a h p ch t C b ng ph ằ ươ ấ ẫ ườ ứ ợ ấ ở ạ ợ d ng oxi hóa, có nitrat và các h p

ch t khác c n cho quá trình sinh t ng h p c a t ợ ủ ế ấ ầ ổ ẩ bào. Khi đó, đáng chú ý là m t s vi khu n ộ ố

nitrat s d ng nitrat nh ngu n năng l ử ụ ư ồ ượ ấ ng ch y u ho c duy nh t, t c dùng chúng làm ch t ấ ứ ủ ế ặ

nh n electron nh ng không dùng làm ngu n N trong trao đ i ki n t o, vì không th kh NH3 ể ử ế ạ ư ậ ồ ổ

thành NH4+. Vì v y, trong môi tr i ta cho thêm ậ ườ ng nuôi c y vi khu n ph n nitrat hóa, ng ẩ ấ ả ườ

peptone, asparagin ho c mu i amon và h n ch l u khí trong quá trình nuôi c y. ạ ế ư ấ ặ ố

S l ng vi khu n đ c xác đ nh b ng ph ng pháp pha loãng t i h n. ố ượ ẩ ượ ằ ị ươ ớ ạ

1. Môi tr ườ ng- hóa ch t ấ

Môi tr ng Giltay: ườ

Dung d ch A: ị

Asparagine: 1g

1g KNO3:

N c máy: 0.25l ướ

Dung d ch B: ị

8,5g KNO3:

1g K2HPO4:

1g MgSO4:

CaCl2: 0,2g

10

FeCl2: v tế

N c máy: 0,25l ướ

Hòa 0,25l dung d ch A và 0,25l dung d ch B, sau đó thêm n c máy đ n 1L dung d ch môi ị ị ướ ế ị

tr ng Giltay hoàn t t. ườ ấ

2. Ti n hành thí nghi m ế ệ

ng: môi tr ng Giltei v i thành ph n nh trên đ Chu n b môi tr ị ẩ ườ ườ ư ầ ớ ượ ệ c phân vào các ng nghi m, ố

h p kh trùng 0,5 atm ấ ử

Xác đ nh vi sinh v t trên môi tr ậ ị ườ ng l ng: ỏ

3- 108

Pha loãng m u 10 ẫ

L y 1ml m u c y sâu vào đáy ng nghi m có ch a môi tr trên ẫ ấ ứ ệ ấ ố ườ ng đã kh trùng ử ở

OC trong 7 ngày đêm

28-30 Ủ ở

Làm 1 ng nghi m đ i ch ng ứ ệ ố ố

3. Quan sát và ghi nh n k t qu ậ ế ả

ả D u hi u ch y u nh t cho s phát tri n c a vi khu n nitrat hóa là s sinh khí, làm đ c và gi m ể ủ ủ ế ự ự ụ ệ ấ ấ ẩ

pH c a môi tr ng ủ ườ

các đ pha loãng khác nhau và ghi nh n vào b ng Quan sát các ng nghi m ố ệ ở ậ ả ộ

-

ng b ng ph n ng sinh hóa v i diphenylamin Ki m tra vi c kh nitrat trong môi tr ử ể ệ ườ ả ứ ằ ớ

Đ pha loãng môi Sinh khí pH môi tr ng NO3 ộ Đ c ụ ườ

tr ng ườ

103 105 107 109

t nh t làm tiêu b n, quan sát kính hi n vi và ghi nh n hình Ch n 1 ng nghi m cho k t qu t ệ ả ố ế ọ ố ể ậ ấ ả

thái h c c a các vi khu n ph n nitrat hóa phân l p đ c. ọ ủ ậ ượ ẩ ả

ng b ng ph n ng sinh hóa v i diphenylamin: Ki m tra vi c kh nitrat trong môi tr ử ể ệ ườ ả ứ ằ ớ

L y vài tinh th diphenylamine hòa tan vào m t gi t H2SO 4 đ c, sau đó thêm vào m t gi t d ch ể ấ ộ ọ ặ ộ ọ ị

nghiên c u. N u có m t nitrate s xu t hi n màu xanh th m. ứ ế ẽ ệ ấ ặ ẫ

11

BÀI 4. VI SINH V T C Đ NH NIT

Ậ Ố Ị

Ơ

I. Lý thuy tế

C đ nh N là kh năng đ ng hóa N phân t ố ị ả ồ ử ủ ế c a m t s vi sinh v t và dùng làm ngu n ki n ộ ố ậ ồ

bào. Các vi sinh v t c đ nh N s ng t do, có nhi u trong đ t, n c g m m t s loài t o t ạ ế ậ ố ị ố ự ề ấ ướ ộ ố ồ

, vi khu n quan năng, vi thu c ộ gi ng Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter ố ẩ

các khu n sinh metan, vi khu n kh sulfat, n m, t o lam… Ngoài ra kh năng c đ nh N còn có ả ố ị ử ẩ ẩ ấ ả ở

ệ vi khu n n t s n s ng c ng sinh trong r các cây h đ u. Chúng có ý nghĩa quan trong trong vi c ố ầ ố ọ ậ ễ ẩ ộ

chuy n N vô c thành N h u c , đ c bi ơ ặ ữ ể ơ ệ ố t là vai trò c a vi khu n n t s n, các loài trong gi ng ố ầ ủ ẩ

Clostridium và Azotobacter.

II. Th c hành ự

Các loài Azotobacter thu c loài vi sinh v t c đ nh nitrogen ho t đ ng nh t. M t s loài đ ậ ố ị ạ ộ ộ ố ấ ộ ượ c

nghiên c u h n c là ứ ả ơ Az. Chroococum-đ c tr ng trên đ t đ ng c , ư ấ ồ ỏ Az. Agilis và Az. Vinelandii ặ

trong ao h . Các loài này khác nhau v đ c đi m sinh tr ng trên môi tr ng đ c, kích th ề ặ ể ồ ưở ườ ặ ướ c,

hình thái t bào và m t s đ c đi m sinh lý khác. ế ộ ố ặ ể ầ Az. Chroococum t o nh ng khu n l c nh y, ẩ ạ ữ ạ

i ho c lan, lúc đ u không màu, sau chuy n thành màu nâu t i ho c đen nh ng không lan màu l ồ ể ặ ầ ố ư ặ

sang môi tr ng. Az. Agilis và Az. Vinelandii thì có khu n l c trong, nh y, sinh s c t huỳnh ườ ẩ ạ ắ ố ầ

ng. Khi còn non, t bào quang màu vàng l c ho c lam l c, và có s khu ch tán vào môi tr ụ ụ ự ế ặ ườ ế

Azotobacter hình que đ u tròn đ ng riêng l ho c x p thành t ng đôi ch ng ch t, t ứ ầ ẽ ấ ế ừ ế ặ ồ ấ bào ch t

nhu m màu đ ng đ u, có kh năng di đ ng nh chu mao. Chi u dài t bào thay đ i 2-3 đ m 4-6 ề ề ả ộ ồ ộ ờ ế ế ổ

μm, trong đó l n nh t là t bào c a bào hình que chuy n thành hình ấ ớ ế ủ Az. Agilis. D n d n, các t ầ ầ ế ể

ng kính 4 μm, hình d ng không c đ nh. Khi đó tiên mao r ng đi c u ho c hình b u d c v i đ ầ ụ ớ ườ ặ ầ ố ị ụ ạ

và t bào tr nên b t đ ng, b c bao nh y, t bào ch t xu t hi n d ng h t v i nhi u ch t dinh ế ấ ộ ầ ở ọ ế ạ ớ ệ ề ấ ấ ấ ạ

d ng m , glycogen… bào Az. Chroococcum và Az. Vinelandii các t bào tròn có th ph ưỡ ỡ t Ở ế ế ể ủ

bào và chu kỳ bi n đ i c a l p v nh y và chuy n thành kén. Hình d ng t ớ ể ầ ạ ỏ ế ổ ủ Azotobacter phụ ế

thu c tu i c a gi ng và đi u ki n phát tri n. ổ ủ ề ệ ể ộ ố

T t c các loài ấ ả Azotobacter đ u s ng d d ề ị ưỡ ố ng, dùng nhi u ngu n cacbon khác nhau, ồ ề

monosacharit, disacharit, polysacharit (dextrin, tinh b t), nhi u r ề ượ ộ ấ u và acid h u c , các h p ch t ữ ơ ợ

th m…Ngu n nitrogen có th là Nitrogen phân t ể ơ ồ ử , cũng có th là mu i amon, nitrate, nitrit, ố ể

ng mà quá trình c aminoaxit. Tùy thu c n ng đ các h p ch t có nitrogen này trong môi tr ợ ấ ộ ồ ộ ườ ố

s b c ch nhi u hay ít. Đ ng th i đ nh nitrogen phân t ị ử ẽ ị ứ ố ớ ờ Azotobacter có nhu c u l n đ i v i P ầ ớ ế ề ồ

12

2 và

và Ca. Azotobacter nh n đ c năng l ng t ậ ượ ượ ừ quá trình oxi hóa các h p ch t h u c thành CO ợ ấ ữ ơ

H2O.

Ph n l n các loài ầ ớ Azotobacter ch phát tri n đ ỉ ể c ượ ở ặ pH l n h n 6, vì v y h u nh không g p ậ ư ầ ơ ớ

chúng đ t chua. Đ i v i đ t chua, đ c tr ng là loài Az. Indicum có th phát tri n trong môi ở ấ ố ớ ấ ư ể ể ặ

tr ườ ng v i pH 3. ớ

Azotobacter c n đ m cao h n so v i nhi u vi khu n khác nên cũng ít g p chúng ộ ẩ ề ầ ặ ẩ ớ ơ ở ấ các vùng đ t

khô h n.ạ

Vi c phát hi n c th c hi n trên môi tr ng ch n l c Thompson-Sherman ệ Azotobacter đ ệ ượ ự ệ ườ ọ ọ

không ch a nitrogen h p ch t, trong đi u ki n hi u khí và đ m cao. ộ ẩ ứ ệ ế ề ấ ợ

1. Môi tr ườ ng- hóa ch t ấ

2-free glucose) tăng sinh

ng Thompson-Sherman (N Thành ph n môi tr ầ ườ

1g K2HPO4:

0,2g MgSO4:

0,2g FeSO4:

0,1g CaCl2:

Na2MoO4: 0,001g

Glucose: 10g

N c máy: 1000ml ướ

2-free glucose) phân l p ậ

ng Thompson-Sherman (N Thành ph n môi tr ầ ườ

1g K2HPO4:

0,2g MgSO4:

0,1g CaCl2:

Na2MoO4: 0,001g

Glucose: 10g

N c máy: 1000ml ướ

Agar: 3% th tích môi tr ng ể ườ

OC trong

ng Thompson-Sherman v i thành ph n nh trên, h p kh trùng 121 Chu n b môi tr ị ẩ ườ ử ư ấ ầ ớ ở

15 phút 1 atm.

2. Ti n hành thí nghi m ệ ế

ng Thompson-Sherman tăng sinh - Giai đo n tăng sinh: Cân 1g đ t cho vào erlen có 50ml môi tr ấ ạ ườ

OC.

đã h p kh trùng v i thành ph n nh trên. 4-7 ngày 30 ử ư ấ ầ ớ Ủ

13

- Giai đo n sau tăng sinh: Ki m tra hình d ng, kích th bào vi khu n có trong sinh kh i đã ể ạ ạ c t ướ ế ẩ ố

tăng sinh d i kính hi n vi quang h c. N u có đúng hình thái khu n l c, chuy n sang môi tr ướ ẩ ạ ể ể ế ọ ườ ng

phân l p.ậ

- Giai đo n phân l p: C y sinh kh i vi khu n vào môi tr ng Thompson-Sherman phân l p đã ạ ấ ậ ẩ ố ườ ậ

OC.

phân vào đĩa petri và h p kh trùng. 3-5 ngày, 30 ử ấ Ủ

3. Quan sát ghi nh n k t qu ế ậ ả

Quan sát và ghi nh n hình thái vi khu n đ c tr ng sau giai đo n tăng sinh. ẩ ư ặ ậ ạ

Hình Có roi Bao Hình Bào tử Kích S s pự ắ Di đ ngộ

th d ngạ cướ x p tế ế nh yầ v tẽ ế

bào bào bàoế t Lo i 1ạ

Lo i 2ạ

Ghi nh n các lo i khu n l c khác nhau xu t hi n sau giai đo n phân l p. Mô t ẩ ạ ệ ậ ạ ạ ấ ậ ả ẩ ạ các khu n l c

đó

Hình B m t Huỳnh S l Khu nẩ ề ặ Đ trong ộ Màu s cắ Khu ch tán ế ố ượ ng

quang màu vào l c lo i ạ ạ d ngạ ẩ ạ khu n l c

môi tr ng lo i này ườ ạ Lo i 1ạ

Lo i 2ạ

Ch n các khu n l c đ c tr ng nh t làm tiêu b n gi t ép đ quan sát bao nh y. Soi kính hi n vi ẩ ạ ặ ư ả ấ ọ ọ ể ề ầ

c l n, th ng đ ng thành đôi và có bao v t kính 40X đ ki m tra hình thái vi khu n: kích th ậ ề ể ẩ ướ ớ ườ ứ

nh y. ầ

Ghi nh n các đ c đi m này vào b ng ể ả ậ ặ

Hình Bao Hình Bào tử Kích S s pự ắ

th d ngạ cướ x p tế ế nh yầ v tẽ ế

bào bào bàoế t Lo i 1ạ

Lo i 2ạ

14

BÀI 5:VI SINH V T PHÂN GI

I CELLULOSE

Ậ

Ả

I. Lý thuy tế

Cellulose là thành ph n c u t o c b n c a thành t ầ ấ ạ ơ ả ủ ế bào th c v t. Vi c t ng h p cellulose có ệ ổ ự ậ ợ

quy mô ph c t p h n h n vi c t ng h p nh ng h p ch t khác. Do đó, vi sinh v t phân gi ữ ứ ạ ệ ổ ẳ ấ ậ ơ ợ ợ ả i

cellulose có vai trò đ c bi t quan tr ng trong chu trình tu n hoàn Cacbon. ặ ệ ầ ọ

S phân gi i ti n hành trong đi u ki n hi u khí l n k khí, môi tr ng ki m ho c acid, đ ự ả ế ề ệ ế ẫ ỵ ườ ể ặ ộ

các nhi ẩ m th p ho c cao và ặ ấ ở ệ ộ t đ khác nhau. T t c vi sinh v t tham gia vô c hóa cellulose ậ ấ ả ơ

ng hóa năng h u c , có enzyme cellulosase xúc tác vi c phân gi i cellulose đ u thu c lo i d d ề ạ ị ưỡ ộ ữ ơ ệ ả

thành cellobioase và glucose. Vi sinh v t dùng các h p ch t sinh ra này làm ngu n cacbon và ậ ấ ợ ồ

ngu n năng l ng. ồ ượ

Trong đi u ki n hi u khí, các vi sinh v t tham gia vào quá trình này g m niêm khu n, m t s ộ ố ề ệ ế ậ ẩ ồ

và sinh bào t , x khu n, n m...Trong đó, quan đ i di n c a các vi khu n không sinh bào t ạ ệ ủ ẩ ử ử ạ ẩ ấ

tr ng nh t là niêm khu n. ấ ẩ ọ

Niêm khu n có t bào hình que nh bé (03-0,4 x 0,7-10 μm) h i u n cong, th ẩ ế ỏ ơ ố ườ ầ ng có đ u

nh n, thành t ọ ế ơ ấ ặ bào m ng và nhu m màu kém h n so v i các vi khu n khác. Trên c ch t đ c ớ ẩ ỏ ộ ơ

niêm khu n có chuy n đ ng tr t, do s ti bào. Vài ể ẩ ộ ượ ự ế t ch t nh y không đ ng đ u trên b m t t ồ ề ặ ế ề ấ ầ

loài niêm khu n có tiên mao, có chu kỳ phát tri n ph c t p. Đ u tiên, các t bào hình que t ứ ạ ể ẩ ầ ế ừ ừ t

c khác nhau. d y lên, bi n thành nh ng t ầ ữ ế ế bào d ng ngh , hình c u ho c b u d c, kích th ầ ặ ầ ụ ạ ỉ ướ

i cellulose ch y u g m các gi ng Niêm khu n phân gi ẩ ả ủ ế ố Cytophaga, Sporocytophaga, ồ

Sorangium s ng trong đ t ít acid, trung tính và ít ki m. Các loài thu c gi ng ố Cytophaga có t ề ấ ố ộ bàoế

Sporocytophaga có hình thái t ng t đ u nh n, không sinh vi kén. Các loài trong gi ng ầ ọ ố ươ ự ư nh

Cytophaga nh ng khác ch có kh năng sinh vi kén. Các loài thu c gi ng ư ở ỗ ả ộ ố Sorangium là nh ngữ

tr c khu n đ u nh n, có kh năng hình thành kén. ự ẩ ầ ả ọ

Trên b m t v t li u có cellulose, niêm khu n phát tri n trong d ng th nh y, không có hình ề ặ ậ ệ ể ể ẩ ạ ầ

ng ng v i ch cellulose d ng xác đ nh, lan r ng, không màu ho c có màu vàng, da cam, đ t ạ ỏ ươ ứ ặ ộ ớ ỗ ị

i nhi u hay ít. b phân gi ị ả ề

Ngoài niêm khu n, trong đ t còn có các loài phân gi i cellulose thu c gi ng ẩ ấ ả ố Cellvibrio, t ộ bàoế

, khu n l c không màu ho c có màu u ng cong, di đ ng nh 1 tiên mao, không sinh n i bào t ố ộ ờ ộ ử ẩ ạ ặ

vàng l c. Chúng ch dùng cellulose khi c n ki t các ngu n cacbon khác và kh năng phân gi ụ ạ ỉ ệ ả ồ ả i

không m nh m b ng niêm khu n. ẽ ằ ạ ẩ

15

Trong đ t chua, vai trò phân gi i do các n m thu c gi ng ấ ả ố Chaelomium, Trichoderma, ấ ộ

Fusarium, Aspergillus...

II. Th c hành ự

H u h t t t c nh ng loài phân gi i cellulose thu c nhóm hi u khí và a m. ế ấ ả ữ ầ ả ư ẩ ế ộ

Vi c phát hi n và xác đ nh sô l ng các vi sinh v t phân gi ệ ệ ị ượ ậ ả ế i cellulose trong đi u ki n hi u ề ệ

khí đ c ti n hành b ng cách c y d ch huy n phù nghiên c u lên các đĩa ch a môi tr ượ ứ ứ ế ề ằ ấ ị ườ ọ ng ch n

l c Hutchinson có ngu n cacbon duy nh t là xellulose. Nuôi c y trong đi u ki n hi u khí. ọ ề ệ ế ấ ấ ồ

1. Môi tr ườ ng và hóa ch t ấ

Môi tr ng Hutchinson (g) ườ

KNO3 2,5

K2HPO4 1,0

MgSO4 0,3

CaCl2 0,1

NaCl 0,1

FeCl3 0,01

Agar 3%

N c máy 1000ml ướ

2. Ti n hành thí nghi m ế ệ

Chu n b các đĩa petri có môi tr 1 atm. ẩ ị ườ ng Hutchinson v i thành ph n nh trên, h p kh trùng ầ ư ử ấ ớ ở

ng ng đĩa petri. H p kh trùng c t 1 atm. Gi y l c c t thành nh ng khoanh tròn kích th ữ ấ ọ ắ ướ ươ ứ ử ấ ở

M u đ t pha v i n ớ ướ ẫ ấ c máy đ l y d ch huy n phù ị ể ấ ề

1 đ n 10 ế

10, trang đ u lên b m t b ng que c y ấ

đ pha loãng 10 C y 0,1 ml d ch huy n phù t ị ề ấ ừ ộ ề ặ ằ ề

trang. Sau đó dùng k p s t đã kh trùng trên ng n l a g p 1 khoanh gi y l c vô trùng đ t áp sát ọ ử ấ ẹ ắ ấ ọ ử ặ

lên b m t. M i đ pha loãng l p l ỗ ộ ề ặ ậ ạ i 3 l n. ầ

OC trong 12-14 ngày đêm.

Đ y n p đĩa petri đ t vào bình hút m. Nuôi c y 28-30 ậ ắ ặ ẩ ấ

3. Quan sát và ghi nh n k t qu ậ ế ả

Quan sát và đ m s l ng khu n l c vi sinh v t m c đ ố ượ ế ẩ ạ ọ ượ ậ c trên khoanh gi y l c trong m i đĩa ấ ọ ỗ

petri.

Xác đ nh xem khu n l c là c a nhóm vi sinh v t nào (niêm khu n, x khu n hay n m khu n ty) ậ ẩ ạ ủ ẩ ẩ ạ ẩ ấ ị

chi m u th trên gi y l c. Đ phân bi t các khu n l c nh c a x khu n và n m, có th quan ế ư ấ ọ ế ể ệ ỏ ủ ạ ẩ ạ ể ẩ ấ

ệ sát trên kính hi n vi v i v t kính 8X. Nh n xét s khác nhau gi a các lo i vi sinh v t phát hi n ớ ậ ự ữ ể ậ ạ ậ

đ c.ượ

Khu n l c Kích th ẩ ạ Hình cướ Màu s cắ M c đ phân ứ ộ S khu n l c cùng ẩ ạ ố

16

gi i cellulose lo i ghi nh n đ lo iạ d ngạ ả ậ ượ c ạ

(khu n l c/đĩa) ẩ ạ Lo i 1ạ

Lo i 2ạ

Mô t ả ẩ ạ ặ khác khu n l c khác nhau c a niêm khu n, ghi nh n các d u hi u. Ch n khu n l c đ c ẩ ạ ủ ệ ẩ ấ ậ ọ

tr ng nh t làm tiêu b n cùng v i các s i cellulose t ư ấ ả ợ ớ ừ ữ nh ng ch gi y l c b phân gi ỗ ấ ọ ị ả ề i nhi u

nh t. L u ý hình d ng t bào sinh d ng và vi kén ho c bào t ư ấ ạ ế ưỡ ặ ử ấ n m m c ố

T bào sinh Vi kén Hình v t bào Khu n l c lo i ạ ẩ ạ ế ẽ ế Hình v vi kén ẽ

d (n u có) ngưỡ ế Lo i 1ạ

Lo i 2ạ

17