Ổ Ộ Ệ T NG LIÊN ĐOÀN LAO Đ NG VI T NAM
ƯỜ Ạ Ọ Ứ TR Ắ NG Đ I H C TÔN Đ C TH NG
Ứ Ụ Ọ KHOA KHOA H C VÀ NG D NG
BÁO CÁO BÀI SEMINAR
Ủ Ề
Ấ
Ở Ự
Ậ
CH Đ : CH T KÍCH KHÁNG
TH C V T
ự ệ Nhóm sinh viên th c hi n:
ễ ấ Nguy n Minh Tu n 61203172
Lê Thành Thi nệ 61203137
Khoá : 2012
ả ướ Ầ Ị Gi ng viên h ng d n : ẫ TS TR N TH DUNG
1
ồ Tp. H Chí Minh, tháng 9 năm 2014
Ụ
Ụ
M C L C
2
REAL TIME PCR
I. KHÁI NI MỆ ậ ỹ ấ ế ạ ườ Trong k thu t PCR, sau khi hoàn t ạ t khu ch đ i đo n DNA đích, ng i làm
ả ế ụ ệ ố ộ thí nghi m ph i ti p t c làm m t s b ướ c
ệ ế ả ể ọ thí nghi m đ đ c k t qu xác
ế ả ạ ẩ ị đ nh có s n ph m khu ch đ i
ố ố ả mong mu n trong ng ph n
ứ ạ ng hay không, và giai đo n này
ệ ạ ọ g i là giai đo n thí nghi m sau PCR. Trong
ạ ườ ệ giai đo n này, ng i làm thí nghi m có th ể
ự ệ ệ ả ạ ẩ th c hi n đi n di s n ph m PCR trên gel agarose đ ể ả xem có v ch s n
ế ẩ ạ ph m khu ch đ i đúng kích th ướ c
ố mong mu n hay không, cũng có
ự ể ệ ệ th th c hi n thí nghi m lai
ạ ặ ệ ớ v i các đo n dò đ c hi u
ự ế ế (trên màng, trên gi ng hay phi n nh a...) đ ể ẩ ả xem s n ph m
ế ự ậ ầ ả ố ạ khu ch đ i có trình t ỹ mong mu n hay không. K thu t PCR mà c n ph i có
ể ọ ệ ạ ấ ả ứ ế giai đo n thí nghi m đ đ c và phân tích sau khi hoàn t ạ t ph n ng khu ch đ i,
ượ ọ ổ ể ngày hôm nay đ c g i là PCR c đi n (classical PCR).
ế ể ả ạ ậ ỹ ế Realtime PCR là k thu t PCR mà k t qu khu ch đ i DNA đích hi n th đ ị ượ c
ỳ ệ ủ ả ứ ậ ượ ọ ỗ ngay sau m i chu k nhi t c a ph n ng, chính vì v y nên đ c g i là realtime;
ể ặ ớ ườ ệ ầ và do đ c đi m này nên v i realtime PCR ng i làm thí nghi m không c n thi ế t
ả ể ể ọ ế ệ ế ả ị ả ph i làm ti p các thí nghi m đ đ c và phân tích k t qu đ xác đ nh có s n
ả ứ ủ ế ả ẩ ạ ố ế ế ph m khu ch đ i đích hay không vì k t qu cu i cùng c a ph n ng khu ch
ượ ể ị ấ ả ứ ạ ạ đ i cũng đ c hi n th ngay sau khi hoàn t ư ậ ế t ph n ng khu ch đ i. Nh v y,
ể ả ố ỹ ệ ậ nên có th nói realtime PCR là k thu t nhân b n DNA đích trong ng nghi m
ỷ ả ự ỳ ệ ế ả ạ thành hàng t b n sao d a vào các chu k nhi ố ế t và k t qu khu ch đ i trong ng
ượ ạ ả ả ứ ể ườ ể ế ớ ị ả ứ ph n ng đ c hi n th cùng lúc v i ph n ng khu ch đ i x y ra đ ng i làm
ể ấ ượ ệ thí nghi m có th th y đ c.
3
Ấ Ề Ỹ Ậ Ơ Ả Ủ Ầ Ế II.
ể ồ ế
ạ ủ Bi u đ khu ch đ i c a realtime PCR. ườ ị ơ ả ể ể ể CÁC V N Đ K THU T C B N C N BI T C A REALTIME PCR. 1. Trong realtime PCR, hi n th c b n đ ng ệ i làm thí nghi m có th quan
ượ ả ứ ể ả ố ộ sát đ ủ c trong quá trình nhân b n DNA c a các ng ph n ng là m t bi u đ ồ
ụ ể ế ạ ồ ườ ộ khu ch đ i (amplification graph). Bi u đ này có tr c tung (Y) là c ỳ ng đ hu nh
ừ ả ứ ụ ậ ố quang phát ra t các ng ph n ng khi nh n ánh sáng kích thích, còn tr c hoành (X)
ỳ ệ ế ể ạ ồ ể ườ bi u đ 1 là các chu k nhi t. Trên bi u đ khu ch đ i này ( ồ ), ng ệ i làm thí nghi m
ố ớ ừ ả ứ ố ườ ậ ộ ỳ ẽ ấ s th y đ i v i t ng ng ph n ng, c ng đ hu nh quang mà máy ghi nh n đ ượ c
ỳ ầ ẽ ấ ị ằ ữ ư ể ấ ổ ộ ầ trong nh ng chu k đ u s r t th p và h u nh không thay đ i, hi n th b ng m t
ạ ủ ằ ẳ ườ đ ạ ể ọ ng th ng n m ngang, chúng ta có th g i đây là “giai đo n ” hay “giai đo n
ể ượ ụ ề ạ ả ti m ph c”, vì trong giai đo n này dù DNA đích đã có th đ c nhân b n thành các
ố ượ ư ủ ể ậ ỳ ư ả b n sao nh ng do s l ấ ng ch a đ đ giúp cho ch t phát hu nh quang nh n đ ượ c
ủ ườ ỳ ộ ể ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng hu nh quang đ c ậ ng đ đ máy ghi nh n.
ố ượ ư ạ ế ủ ả ộ ưỡ ộ Nh ng m t khi s l ng b n sao c a DNA đích đ t đ n m t ng ấ ị ng nh t đ nh thì
ẽ ủ ườ ỳ ộ ể ượ ánh sáng hu nh quang phát ra s đ c ng đ đ đ ậ c máy ghi nh n và lúc này
ẽ ấ ườ ạ ắ ầ ườ ế ễ ể ộ chúng ta s th y đ ỳ ng bi u di n khu ch đ i b t đ u ngóc lên. C ng đ hu nh
ả ứ ừ ẽ ỗ ở ỳ ệ ố quang trong ng ph n ng t ấ lúc này tr đi s tăng g p đôi sau m i chu k nhi t do
ủ ấ ả ọ ỗ ỳ ố ượ s l ng b n sao c a DNA đích tăng g p đôi sau m i chu k . Chúng ta g i giai
ề ườ ừ ạ ạ ả ộ ỳ đo n này là “giai đo n lũy th a” v c ạ ng đ hu nh quang, không ph i là giai đo n
ưở ề ố ượ ườ ủ ả ộ ỳ tăng tr ừ ng lũy th a v s l ng b n sao c a DNA đích. C ng đ hu nh quang
ẽ ố ưở ứ ế ộ ộ ưở ả ứ trong ng ph n ng s tăng tr ng đ n m t m c nào đó thì đ tăng tr ng s ẽ
ạ ế ả ứ ủ ả ậ ầ ch m d n và đ t đ n bình nguyên vì các b n sao c a DNA đích, do ph n ng đã
ạ ộ ả ữ ệ ầ ạ c n d n dNTP và enzyme Taq polymerase không ho t đ ng hi u qu n a, nên s ẽ
ố ượ ấ ố ữ ạ ọ không còn gia tăng s l ng theo c p s 2 n a. Chúng ta g i giai đo n này là “giai
ạ đo n bình nguyên”.
ộ ườ ủ ế ễ ể ạ Phân tích m t đ ộ ng bi u di n khu ch đ i (amplification curve) c a m t
ố ả ứ ỳ ệ ộ ng ph n ng sau khi hoàn t ấ ượ t đ c các chu k nhi ẽ ấ t, chúng ta s th y m t thông
ỳ ưỡ ọ ớ ố ế ứ s h t s c quan tr ng luôn đi kèm v i nó, đó là chu k ng ng (Ct, threshold cycle).
ỳ ưỡ ỳ ệ ờ ế ị Chu k ng ng hay Ct là chu k nhi t mà ở ạ t ể i th i đi m này thi t b realtime ghi
ượ ệ ỳ ừ ố ắ ầ ả ứ ượ ậ nh n đ c tín hi u hu nh quang phát ra t ng ph n ng b t đ u v t qua c ườ ng
ề ể ể ỳ ị ề ộ ỳ ộ đ hu nh quang n n. Đ có th xác đ nh đ ượ ườ c c ng đ hu nh quang n n, thi ế ị t b
4
ườ ậ ườ ệ ệ ấ ộ ỳ realtime th ng ghi nh n c ố ng đ tín hi u hu nh quang xu t hi n trong ng
ộ ố ả ứ ỳ ề ỳ ầ ọ ph n ng trong m t s chu k đ u, chúng ta g i là các chu k n n (ba sal cycle), và
ủ ộ ườ ộ ỳ ườ ộ ấ l y trung bình c ng c a các c ng đ hu nh quang này làm c ỳ ng đ hu nh quang
ườ ườ ề ộ ỳ ượ ắ ề n n. Đ ng c t ngang đi qua c ng đ hu nh quang n n này đ ọ c g i là đ ườ ng
ỳ ưỡ ị ố ượ ằ ố ỳ ị ở ề n n (base line). Chu k ng ng là tr s đ c xác đ nh b ng s chu k mà đó
ề ắ ượ ườ ế ễ ể ạ ượ ư ậ ườ đ ng n n c t đ c đ ng bi n di n khu ch đ i. Do đ c tính toán nh v y nên
ỳ ưỡ ườ ộ ố ẻ ộ ố ẵ ụ chu k ng ng th ng là m t s l ứ (ví d : Ct = 28.35) ch ít khi là m t s ch n.
ả ứ ả ứ ữ ữ ố ớ ố Có nh ng ng ph n ng có Ct s m và cũng có nh ng ng ph n ng có Ct
ỏ ượ ặ ệ ấ ộ ơ ượ ư ậ xu t hi n mu n h n, và câu h i đ c đ t ra là lý do nào đã làm đ c nh v y? Câu
ố ượ ả tr ả ờ l i chính xác là do s l ầ ng b n DNA đích ban đ u (starting quantity, Sq) có
ả ứ ả ứ ố ượ ế ề ố ố trong ng ph n ng nhi u hay ít. N u trong ng ph n ng s l ng DNA đích
ẽ ầ ề ỳ ệ ơ ể ạ ế ố ượ ủ ể ố ả nhi u thì s c n ít chu k nhi t h n đ đ t đ n s l ả ng b n sao đ đ ng ph n
ứ ượ ệ ẽ ậ ỳ ượ ng cho đ c tín hi u hu nh quang mà máy s ghi nh n đ c, còn n u s l ế ố ượ ng
ề ầ ơ ỳ ệ ơ DNA đích ít h n thì c n nhi u chu k nhi t h n.
ể ồ Bi u đ chu n c a realtime PCR.
ẩ ủ ộ ố ả ứ ư ủ ớ ộ 2. ấ Nh đã nói Ct c a m t ng ph n ng realtime PCR s m hay mu n (Ct th p
ố ượ ộ ầ ả ố hay Ct cao) là tùy thu c vào s l ả ng b n DNA đích ban đ u có trong ng ph n
5
ứ ộ ặ ể ượ ộ ủ ổ ể ớ ng. Đây chính là m t đ c đi m v t tr i c a realtime PCR so v i PCR c đi n, vì
ờ ự ể ặ ườ ị ượ ố nh d a vào đ c đi m này mà ng ệ i làm thí nghi m xác đ nh đ ủ c s copies c a
ổ ể ử ể ẫ ộ ố tác nhân đích có trong m u th , m t thông s mà PCR c đi n không th nào làm
ượ ế ả ườ ệ ả ể đ có đ c k t qu chính xác. Ng ổ ể ỉ ọ ế i làm thí nghi m ch đ c k t qu PCR c đi n
ấ ả ứ ế ế ế ả ạ ị ượ ượ sau khi hoàn t t ph n ng khu ch đ i, và k t qu này n u đ nh l ng đ c thì
ả ị ỉ ượ ố ả ủ ấ ế cũng ch là k t qu đ nh l ng s b n sao c a DNA đích sau khi hoàn t ế t khu ch
ố ượ ả ả ả ố ượ ạ đ i. Mà trong PCR, s l ng b n sao cu i cùng không ph n nh đ ộ c m t cách
ố ượ ử ẫ ầ ả ố chính xác s l ng b n DNA đích ban đ u có trong m u th vì trong đa s các
ườ ợ ố ượ ả ứ ố ượ ả ố tr ng h p s l ng b n sao có trong ng ph n ng PCR là s l ự ạ ng c c đ i sau
ạ ượ ạ khi PCR đ t đ c giai đo n bình nguyên.
ể ị ượ ố ượ ả Tuy nhiên đ realtime PCR xác đ nh đ c chính xác s l ng b n đích ban
ử ẫ ườ ự ệ ệ ả ầ đ u có trong m u th , ng ẫ i làm thí nghi m ph i th c hi n realtime PCR các m u
ử ứ ố ượ ố ượ ầ ầ ả ị th ch a các s l ng b n DNA đích ban đ u c n xác đ nh s l ớ ng cùng lúc v i
ứ ố ượ ẫ ầ ế ố ượ ườ ẩ các m u chu n ch a s l ng DNA đích ban đ u đã bi t rõ s l ng, và th ng thì
ứ ố ượ ệ ố ẫ ẩ ẫ các m u chu n là các m u pha loãng theo h s pha loãng 10 ch a s l ng DNA
ầ ấ ỳ ệ ủ ể đích ban đ u. Sau khi hoàn t t các chu k nhi t c a realtime PCR, trên bi u đ ồ
ế ể ồ ạ khu ch đ i (bi u đ
ử ẽ ẫ ẩ ẫ ườ ạ ủ ễ ể 2), các m u chu n và các m u th s có các đ ế ng bi u di n khu ch đ i c a nó và
ứ ớ ườ ế ễ ể ẫ ẩ ẫ ạ ươ t ng ng v i các đ ng bi u di n khu ch đ i này, các m u chu n và m u th ử
ỳ ưỡ ộ ề đ u có m t chu k ng ng (Ct).
ệ ữ ườ ẽ ể ễ ỳ ưỡ ớ ố ượ ố Đ ng bi u di n v lên m i quan h gi a chu k ng ng v i s l ả ng b n
ẫ ẩ ầ ượ ườ ể DNA đích ban đ u có trong các m u chu n đ ọ c g i là đ ẩ ễ ng bi u di n chu n
ộ ườ ể ế ẳ ộ ọ (standard curve). Đây là m t đ ng th ng tuy n tính đi qua các đi m t a đ xác
ở ố ượ ầ ủ ừ ụ ẫ ẩ ả ị đ nh b i s l ng b n DNA đích ban đ u c a t ng m u chu n (trên tr c tung) và
ưỡ ứ ố ượ ủ ố ể ả ồ ỳ chu k ng ả ứ ng c a ng ph n ng ch a s l ng b n DNA đích này (bi u đ 1).
ố ượ ụ ụ ể ẩ ồ Trên bi u đ chu n này, tr c tung (Y) là Ct còn tr c hoành (X) là s l ả ng b n
ẫ ẩ ẫ ẩ ầ ườ ượ DNA đích ban đ u có trong các m u chu n. Do các m u chu n th ng đ c pha
ệ ố ố ượ ả cách nhau theo h s pha loãng 10, nên s l ẫ ng b n DNA đích trong các m u
ượ ủ ố ượ ơ ố ị ằ ể ậ ẩ chu n đ c bi u th b ng logarith c s 10 (log10) c a s l ng này. Do v y tr ị
ụ ươ ứ ố ượ ả 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 trên tr c X là t ớ ng ng v i các s l ng b n đích là 101.5,
6
ứ 102, 102.5, 103, 103.5, 104, 104.5 t c là 32, 100, 316, 1000, 3162, 10000, 31623 copies
ả ứ ố trong ng ph n ng.
ẩ ẽ ễ ể ể ề ố ẩ ồ ể ồ : Bi u đ chu n v lên đ
ườ ẫ ng bi u di n chu n v m i quan h gi a s ỳ ẩ ng b n DNA đích có trong các m u chu n và chu k ng
ươ ng t ứ ưỡ ả ứ ố
ệ ữ ố ứ ng ng. ẫ ồ ở trên này, chúng ta E2E4E7 là các ng ph n ng ch a các m u ố ả ứ ứ ẫ ẩ
Bi u đ 1 ả ượ l ể Trong bi u đ ử chu n còn B4 là ng ph n ng ch a m u th . III. MÁY PCR ầ ể ự ượ ệ ệ ề ả ể Đi u ki n đ u tiên đ có th th c hi n đ c realtime PCR là ph i có máy real
ộ ồ ủ ệ ượ ươ time PCR. Máy này cũng có m t bu ng nhi ạ t ch y đ c ch ng trình luân nhi ệ t
ư ườ ư ộ ọ ế ị nh máy PCR bình th ng, nh ng có thêm m t thi ế ị ượ t b đ c g i là thi t b real
ộ ế ị ứ ọ time. Đây là m t thi t b quang h c có hai ch c năng:
ượ c các tia sáng kích thích (excitation light) có ồ (1) Có các ngu n sáng phát ra đ
ả ứ ị ướ b c sóng xác đ nh lên các tube ph n ng realtime PCR;
ượ ậ ả ượ ỳ ế c camera hay c m bi n quang ghi nh n đ c ánh sáng hu nh quang (2) Có đ
ừ ả ứ phát ra (emission light) t ả ứ các tube ph n ng realtime PCR khi các tube ph n ng
ượ ế này đ c chi u các tia sáng kích thích.
ề ể ấ ả ế ị Tùy theo hãng và model s n xu t mà có nhi u ki u thi t b realtime khác nhau. Các
ể ế ị ề ồ ki u thi ậ t b này khác nhau v cách phát ra ngu n sáng kích thích và cách ghi nh n
ỳ ượ ừ ắ ượ đ c ánh sáng hu nh quang đ c phát ra t ả ứ các tube ph n ng. Tóm t ể t có các ki u
sau đây:
7
ồ
ử ụ ế ọ ể ứ ấ ị ộ ộ ế
ồ ả ứ 1. S d ng ngu n sáng kích thích là đèn tungstene và dùng các kính l c đ chi u ngu n sáng có đ dài sóng nh t đ nh lên toàn b các gi ng ch a tube ph n ng.
ộ ọ ồ m t kính l c màu Ngu n sáng này đi qua
ọ ươ ằ ch n (b ng ch ng ượ đ c ng ườ ử ụ i s d ng
ọ ể xoay đĩa ch n kính ề trình đi u khi n đ ể
ị ế đ n đúng v trí) ợ ọ l c màu thích h p
ạ ỉ ộ sáng có đ dài sóng ộ ch cho m t lo i ánh
Ánh sáng kích thích ợ thích h p đi qua.
ượ ộ ọ l c này đ c ọ có đ dài sóng ch n
ế ố chi u xu ng bu ng ồ ủ ươ g ả ng dichroic ph n
ứ ệ ả ng. Trong tube ph n nhi ả t có các tube ph n
ấ ả ứ ộ hóa ch t có kh năng ạ ứ ng có ch a m t lo i
ệ ủ ự ệ ỳ có s hi n di n c a ế phát hu nh quang, n u
ạ ừ ế khu ch đ i t DNA ợ s i đôi DNA đ ượ c
ế ở ộ ợ ị đích và b chi u sáng b i ánh sáng kích thích có đ dài sóng thích h p. Ánh sáng
ỳ ừ ả ứ ẽ ươ ọ hu nh quang phát ra t tube ph n ng s đi qua g ng dichroic, qua kính l c màu
ể ượ ỳ ẽ ụ ậ ở ộ hu nh quang đ đ c ghi nh n b i m t CCD camrea. CCD camera này s ch p
ồ ủ ệ ủ ể ệ ậ ườ ộ ỳ hình nguyên bu ng nhi t c a máy PCR đ ghi nh n tín hi u và c ng đ hu nh
ượ ừ ả ứ ỗ ỳ ệ quang đ c phát ra t các tube ph n ng qua m i chu k nhi ử ư ề ộ t và đ a v b vi x
ồ ể ườ ủ ể ể ằ ồ ị lý c a máy vi tính r i hi n th realtime lên màn hình b ng bi u đ đ ng i làm thí
ấ ượ ườ ệ ộ ủ ệ ỳ ừ ỗ ả nghi m th y đ c c ng đ c a tín hi u hu nh quang phát ra t ế m i gi ng ph n
ứ ỳ ệ ng qua các chu k nhi t.
8
ể ư 2. Thi
ả ứ ế ế ị ọ ợ t b realtime dùng s i quang h c (fiber optic cables) đ đ a ồ ngu n sáng kích thích đ n các tube ph n ng.
ế ị ể ồ Trong thi t b này, ngu n sáng kích thích có th là đèn laser, hay đèn tungstene,
ự ế ọ ẫ ả ứ ế ợ ợ ọ ượ đ c các s i quang h c d n tr c ti p đ n các tube ph n ng, và các s i quang h c
ụ ẫ ệ ế ờ ỳ ọ ồ h c đ ng th i cũng làm luôn nhi m v d n ánh sáng hu nh quang phát ra đ n
ế ị ể ượ ấ CCD camera thi ể t b real time ki u này có th đ c th y trong các máy realtime
ư ủ PCR c a hãng ABI, nh các máy real time ABI 7000 hay ABI 7.500 (hình 2).
ồ
ế ị ế ị ượ ử ụ ồ 3. Thi Trong thi t b realtime dùng đèn led làm ngu n sáng kích thích. t b này, ngu n sáng kích thích đ c s d ng là các đèn LED đ ượ c
ể ộ ồ ủ ệ ế ắ g n trên m t giá và giá này di chuy n sát trên bu ng nhi ể t (hình 3) đ chi u ánh
ả ứ ậ ỳ sánh kích thích lên các tube ph n ng và nh n ánh sáng hu nh quang phát ra (máy
ủ ượ ố ị ạ ộ ị realtime PCR model CFX 96 c a Biorad), hay là đ c c đ nh t i m t v trí trong
ủ ệ ả ứ ượ ế ể ờ ồ bu ng nhi t và các tube ph n ng đ ị c di chuy n đ n v trí này nh các tube
ượ ắ ả ứ ph n ng đ c g n
ộ ệ ủ trên m t giá xoay tròn (máy luân nhi ủ t Lighcycler c a Roche hay Rotor Gene c a
ủ ể ợ ế ị ủ Corbett Research). L i đi m c a thi ờ ố t b realtime này là đ i s ng c a đèn LED có
ể ế ụ ể ấ ờ th kéo dài r t lâu, có th đ n hàng ch c ngàn gi .
9
Ỳ Ệ IV. TÍN HI U HU NH QUANG TRONG PCR.
ắ ủ ỹ ệ ả ự ệ ế ẩ ậ ạ Nguyên t c c a k thu t này là khi không có s hi n di n s n ph m khu ch đ i
ậ ấ ỳ ị ị ủ c a PCR, ch t hu nh quang b phân tán trong dung d ch PCR mix, do v y mà tube
ả ứ ẽ ỳ ỳ ỉ ị ph n ng s không b phát hu nh quang hay ch phát hu nh quang không đáng k ể
ự ệ ư ế ệ ả ồ ở ị ẩ khi b chi u b i ngu n sáng kích thích. Nh ng khi có s hi n di n s n ph m
ạ ủ ẽ ị ế ậ ỳ ợ khu ch đ i c a PCR thì màu hu nh quang s b chèn vào và t p trung trên các s i
ủ ả ả ứ ẽ ế ạ ẩ ị ỳ đôi DNA c a s n ph m khu ch đ i và s làm cho tube ph n ng b phát hu nh
ế ở ị quang khi b chi u b i
ư ặ ố ồ ố ơ ể ngu n sáng kích thích. Gi ng nh trên phi c nhìn xu ng m t bi n vào ban đêm mà
ế ề ể ặ ả ề trên m t bi n có r i rác các thuy n con sáng đèn. N u các thuy n con này cách xa
ẽ ấ ể ố ặ ư ế ậ ạ ớ nhau thì chúng ta s th y m t bi n t i đen, nh ng n u chúng t p trung l i v i nhau
ẽ ấ ữ ể ậ ặ ừ thì chúng ta s th y trên m t bi n có nh ng vùng sáng do t p trung ánh sáng t các
thuy n.ề
ủ ở ượ ử ụ ắ Kh i th y ethidium bromide đ c s d ng cho nguyên t c realtime PCR này,
ư ư ể ượ ộ ơ ọ ử ụ nh ng sau này các nhà khoa h c s d ng SYBR I vì các u đi m v t tr i h n nh ư
ề ấ ư ả ấ ợ ỳ màu hu nh quang n n r t th p, kh năng chèn vào s i đôi cao nh ng không làm cho
ờ ậ ị ế ị ắ ả ặ ưở ệ ợ s i đôi b g n ch t vào nhau khi b bi n tính nh v y mà nh h ng ít lên hi u qu ả
PCR.
10
ộ ợ ẽ ấ ỳ 1. Ch t nhu m khi chèn vào s i đôi DNA s phát hu nh quang.
Ví d : ụ SYBR Green I.
ế ế ồ ỳ Thi t k m i cho realtime PCR dùng màu hu nh quang chèn:
ế ế ồ ỳ Thi ậ t k m i cho realtime PCR dùng màu hu nh quang chèn cũng theo các qui lu t
ế ế ồ ệ ượ ở ầ thi t k m i chung cho PCR, đó là: (1) tránh hi n t ng chân tóc đ u 5’ hay 3’;
ắ ặ ữ ấ ớ ớ (2) tránh b t c p gi a primer v i nhau hay cùng primer v i nhau, nh t là ngay ở ầ đ u
ắ ặ ệ ặ ự ầ 3’; (3) Tránh b t c p không đ c hi u trên trình t đích; (4) thành ph n GC trong
ả ự ồ ế ặ kho ng 4060%; (5) Trong trình t m i, tránh l p liên ti p trên 3 base G hay C; (6)
ế ế ể ầ ế ạ ả ẩ Nên thi ể t k đ đ u 3’ có base là G hay C đ tránh s n ph m khu ch đ i không
ệ ế ế ể ệ ộ ắ ặ ố ả ừ ặ đ c hi u; (7) Nên thi t k đ nhi t đ b t c p t i h o là t ế 55oC đ n 65oC đ ể
ế ệ ạ ặ ị ệ ộ ắ ặ ấ không b khu ch đ i không đ c hi u vì nhi ố t đ b t c p quá th p. Ngoài ra, đ i
ộ ế ố ỹ ậ ữ ư ả ẩ ớ v i realtime PCR thì l u ý thêm m t y u t ế k thu t n a, đó là s n ph m khu ch
ế ế ồ ể ạ ừ ế ẩ ả ế ạ đ i: nên thi t k m i đ có s n ph m khu ch đ i t 75 đ n 200 bps. Không nên ít
ư ậ ẽ ệ ượ ả ạ ặ ế ệ ẩ ơ h n 75 bps vì nh v y s khó phân bi ớ c s n ph m khu ch đ i đ c hi u v i t đ
ạ ủ ế ầ ẩ ả s n ph m khu ch đ i c a dimerprimer (xem ph n phân tích melt curve), không nên
ư ậ ẽ ạ ượ ệ ưở ư ậ dài quá 200 bps vì nh v y s khó đ t đ ả c hi u qu PCR lý t ng và nh v y thì
ẩ ẽ ạ ể ể ể ồ ượ ế ả ị ượ bi u đ chu n s không đ t đ có th cho đ c k t qu đ nh l ng chính xác (xem
ể ầ ồ ẩ ủ ph n bi u đ chu n c a realtime PCR).
ể ự ệ ượ ậ ỹ Cách pha realtime PCR mix: Đ th c hi n đ c k thu t realtime PCR s ử
ấ ỳ ườ ệ ả ụ d ng SYBR I làm ch t phát hu nh quang thì ng i làm thí nghi m ph i pha PCR
ớ ồ ộ ừ ồ mix trong đó có thêm SYBR I v i n ng đ 1X (pha t stock 10.000X), n ng đ ộ
ế ộ ộ MgCl2 đ n 3mM, và thêm m t ít DMSO, BSA... Ngoài ra, tùy thu c vào thi ế ị t b
ề ả ỏ ỳ realtime PCR có đòi h i PCR mix ph i thêm màu hu nh quanh n n hay không đ ể
ế ị ệ ượ ị ị ượ ị ưỡ ỳ thi ậ t b nh n di n đ c v trí và xác đ nh đ c giá tr ng ầ ng hu nh quang ban đ u
ế ệ ườ ệ ấ ử ủ ừ c a t ng gi ng th nghi m, mà ng ỳ i làm thí nghi m có cho thêm ch t hu nh
ề ể ự ể ệ quang n n vào PCR mix hay không. ộ Đ có th th c hi n pha realtime PCR mix m t
ả ơ ạ ạ ộ ệ ả ộ ườ ệ cách đ n gi n mà l i ho t đ ng m t cách hi u qu , ng i làm thí nghi m có th ể
ừ ả ấ ấ pha t ứ realtime PCR master mix do các hãng s n xu t có uy tín cung c p có ch a
ớ ọ ẵ s n SYBR I, enzyme Taq polymerase, dNTP và MgCl2. V i PCR master mix g i là
ườ ệ ồ ồ ộ ỉ SYBR PCR master mix này, ng i làm thí nghi m ch cho thêm m i, n ng đ 1025
11
ả ứ ể ế ể ộ ố ầ pm cho m t th tích ph n ng, và n u c n thì cho thêm dUTP và UNG đ ch ng
ạ ượ ệ ễ ngo i nhi m, là có đ ể ự c realtime PCR mix đ th c hi n realtime PCR.
ấ ứ ợ ệ ấ ố Vì SYBR I là màu chèn cho b t c s i đôi DNA nào xu t hi n trong ng
ả ứ ỳ ệ ể ả ế ả ợ ph n ng sau các chu k nhi ạ ặ t k c các s i đôi DNA không ph i khu ch đ i đ c
ệ ừ ậ ự ệ ấ ườ ể ễ ạ hi u t DNA đích, do v y s xu t hi n đ ố ế ng bi u di n khu ch đ i trong ng
ặ ủ ả ả ứ ự ẽ ệ ế ẩ ặ ạ ặ ph n ng s không đ c hi u 100 % cho s có m t c a s n ph m khu ch đ i đ c
ệ ừ ư ậ ả ứ ế ả ẩ ạ ố hi u t DNA đích. Nh v y thì trong ng ph n ng, s n ph m khu ch đ i nào
ườ ạ ừ ể ệ ế ả ả ẩ ấ th ng có th xu t hi n mà không ph i là s n ph m khu ch đ i t DNA đích?
ạ ừ ế ả ẩ ườ ả Đó chính là các s n ph m khu ch đ i t các dimer primer, th ng x y ra vào các
ố ủ ạ ỳ ệ giai đo n cu i c a các chu k nhi ạ ộ t, khi mà enzyme Taq polymerase ho t đ ng
ự ắ ặ ẫ ữ ệ ệ ả ặ ữ không còn hi u qu và đ c hi u n a. Dimer primer là s b t c p l n nhau gi a
ữ ồ ị ự ồ ữ ổ ượ ớ m i do có nh ng v trí trên trình t m i mang nh ng base b sung đ c v i nhau.
ạ ộ ỳ ầ ệ Tuy nhiên trong các chu k đ u khi mà enzyme polymerase còn ho t đ ng hi u
ẽ ả ạ ượ ả ạ ặ ự ủ ế ệ ẩ qu thì s không t o đ c s n ph m khu ch đ i đ c hi u do s kéo dài c a hai
ắ ặ ẫ ắ ặ ồ ỉ ị m i khi chúng b t c p l n nhau ch vài v trí nucleotide mà không b t c p đ ượ ở c
ủ ạ ố ầ đ u 3’ (hình 4 [1]). Tuy nhiên trong các giai đo n cu i c a PCR, enzyme
ạ ộ ữ ệ ể ẫ ở polymerase đã tr nên ho t đ ng kém h u hi u nên nó v n có th kéo dài đ ượ c
ắ ặ ẫ ồ ở ầ ồ ẫ ủ các m i khi chúng b t c p l n nhau dù ắ ặ đ u 3’ c a m i v n không có b t c p
ớ ạ ệ ậ ớ ượ ế ả ặ đ t hi u v i nhau, chính vì v y nên m i t o đ ạ ẩ c các s n ph m khu ch đ i
ệ ừ ạ ừ ế ả ẩ ặ không đ c hi u t các dimer primer (hình 4 [2]). S n ph m khu ch đ i t dimer
ệ ớ ả ạ ừ ế ẩ ở ẽ primer s khác bi t v i s n ph m khu ch đ i t DNA đích chính là ề chi u dài,
ẽ ế ừ n u t ề dimer primer thì chi u dài s không bao gi ờ ượ v ế t quá 50 – 55 bps, còn n u
ề ườ ể ể ừ t DNA đích thì chi u dài th ư ậ ng quá 100 bps. Nh v y, đ có th phân bi ệ ượ c t đ
ườ ạ ủ ố ủ ả ả ứ ể ễ ế ẩ ượ đ c đ ế ng bi u di n khu ch đ i c a ng ph n ng là c a s n ph m khu ch
ệ ừ ả ừ ộ ạ ặ đ i đ c hi u t b n DNA đích hay là t ấ ả ự dimer primer, ph i d a vào m t tính ch t
ư ạ ả ủ ề ế ẩ ạ ặ đ c tr ng giúp phân bi ệ ượ t đ c chi u dài c a hai lo i s n ph m khu ch đ i này,
ấ ặ ệ ộ ả ệ ộ ư và tính ch t đ c tr ng đó chính là nhi t đ ch y (melting To, Tm), là nhi t đ làm
ị ế ị ế ố ợ ứ ợ cho s i đôi DNA b bi n tính 50 % t c là có 50 % s s i đôi b bi n tính hoàn toàn.
ệ ộ ả ủ ợ ủ ề ầ ộ Nhi t đ ch y c a s i đôi DNA tùy thu c vào thành ph n GC và chi u dài c a nó:
ầ ợ ả Thành ph n GC càng cao thì Tm càng cao, s i đôi càng dài thì Tm càng cao. S n
ạ ừ ẩ ẽ ơ ơ ế ph m khu ch đ i t ủ ả DNA đích dài h n nên s có Tm cao h n là Tm c a s n
12
ạ ừ ế ẩ ể ế ượ ủ ả ế ạ ph m khu ch đ i t dimer primer. Đ bi t đ ẩ c Tm c a s n ph m khu ch đ i có
ả ứ ố ấ ệ ủ trong ng ph n ng, sau khi hoàn t ỳ t các chu k luân nhi t c a realtime PCR,
ườ ẽ ế ụ ệ ng i làm thí nghi m s ti p t c cho máy ch yạ thêm m tộ chương trình phân
meltcurv tích nhi tệ độ ch y,ả g iọ là ch ư ơ ng trình e . Tùy thu cộ vào từng lo iạ
ử ụ ệ máy realtime PCR mà người làm thí nghi m s d ng ch ương trình meltcurve
được cài s nẵ trong máy, hay là tự t oạ chương trình melt curve mà mình th yấ
ủ thích hợp hơn. Đ iố với các máy realtime PCR thế hệ iQ c a Biorad thì
chương trình meltcurve là, trước hết bu ng ồ ủ nhi tệ s đẽ ưa nhi t đệ ộ lên 95oC
trong 1 phút để làm bi nế tính hoàn toàn các s nả ph mẩ khu chế đ iạ có trong ống
ạ ả ph n ả ứng, r iồ h xu ng ố nhi tệ độ 55oC trong 1 phút đ t ể ấ c các t s nả ph mẩ
khu chế đ iạ này b t c p ắ ặ hoàn toàn thành sợi đôi. Sau đó thực hiện chương trình
ộ meltcurve đưa nhi tệ đ bu ng ồ ủ nhi tệ từ 55oC lên 95oC trong 80 bước tăng
nhi tệ đ ,ộ m iỗ bước tăng 0.5oC và giữ trong 10 giây; đồng thời trong m iỗ bước
ẽ này, thi ị tế b realti me cũng s chi u ồ ế ngu n sáng kích thích và ghi nh nậ và hi nể thị
trên đồ thị cường độ ánh sáng hu nhỳ quang phát ra từ các ngố ph nả ứng lên m tộ
bi uể đồ ch yả (melt curve chart). Phân tích trên bi uể đ hi n ồ ể thị realtime này,
ố ỳ chúng ta s th y ẽ ấ đ i ố với từng ng ph n ả ứng thì cường độ hu nh quang phát ra sẽ
giảm d nầ theo các bước tăng nhi tệ độ trong buồng ủ nhi t,ệ lý do là các s nả phẩm
khu chế đ iạ có trong ống ph nả ứng sẽ bị bi nế tính d nầ d nầ theo sự gia tăng nhi tệ
độ trong buồng ủ nhi t.ệ Đ nế m tộ bước tăng nhi tệ độ mà ở đó trùng khớp với Tm
c aủ s nả ph mẩ khu chế đ iạ trong ống ph nả ứng thì cường độ huỳnh quang sẽ
ế ả ế ạ ị ế giảm đ t nộ g tộ vì có đ n 50 % s n ph ẩm khu ch đ i này b bi n tính thành s ợi
ộ đơn cùng m t lúc, do v yậ ở bước nhi tệ độ này chúng ta sẽ th yấ đường bi uể
di nễ cường độ hu nhỳ quang phát ra t ừ ố ph nả ứng không còn là m tộ đường ng
ị th ngẳ đi xu ngố đ uề như trước mà b chúi xu ngố th pấ hơn nhi uề so với độ d cố
c aủ nó. Nhờ v yậ mà người làm thí nghiệm khi quan sát di nễ ti nế c aủ quá trình
vẽ realtime bi uể đồ ch y,ả sẽ hoàn toàn có thể có thể xác đ nhị được Tm c aủ s nả
ố ph m ẩ khu chế đ iạ có trong ng ph n được ả ứng (bi uể đồ 4 [1]). Để giúp xác đ nhị
d dàễ ng hơn Tm, sau khi hoàn t tấ chương trình meltcurve, máy realtime PCR sẽ
đồ đ nhỉ thay đ iổ hi nể thị bi uể đồ ch yả thành m tộ đồ khác g iọ là bi uể ch yả (melt
ế curve peak, bi uể đồ 4 [2]), trong bi uể đồ này tr cụ hoành (X) v nẫ là bi n thiên
13
nhi tệ độ c aủ bu ngồ ,ủ nhưng tr cụ tung (Y) thì thay bi nế thiên cường độ hu nhỳ
quang (RFU) thành bi nế thiên
tỷ lệ giảm cường độ hu nhỳ
quang so với tăng nhi tệ độ c aủ
bu ng ồ ủ nhi tệ (DRFU/DT). Nhờ
sự thay đ iổ này, chúng ta sẽ
ấ th y tr ị s c a ố ủ DRFU/DT h uầ
như không bi nế đ iổ khi sự gia
tăng nhi tệ độ c aủ bu ng ồ ủ nhi tệ
ạ chưa đ t đ n ế Tm, nhưng khi
nhi tệ độ bu ng ồ ủ nhi tệ đ tạ
đ nế Tm thì sẽ có sự gia tăng
đáng kể tr sị ố DRFU/DT, và
ị trên bi uể đồ chúng ta sẽ th yấ m tộ đ nhỉ (peak) c aủ trị số này. Giá tr nhi ệ ộ t đ
ủ ườ ứ ể ễ ượ ị ố ổ bu ng ủ ươ t ớ ỉ ng ng v i đ nh c a đ ng bi u di n này cho ta đ ủ c tr s Tm c a
ư ậ ế ạ ẩ ớ ả ứ ả s n ph m khu ch đ i có trong ông ph n ng. Nh v y v i phân tích melt curve
ươ ử ụ ườ trong ph ng pháp realtime PCR s d ng SYBR Green I, ng ệ i làm thí nghi m
ể ệ ượ ả ả ứ ế ẩ ạ ố ừ có th phân bi c s n ph m khu ch đ i có trong ng ph n ng là t t đ DNA
ừ ụ ượ ắ ượ ể đích hay là t dimer primer, do đó mà đã kh c ph c đ c nh ặ c đi m không đ c
ủ ệ ệ ế ạ ẩ ả ấ ỳ ấ hi u c a ch t phát hu nh quang này trong phát hi n s n ph m khu ch đ i xu t
ả ứ ệ ố ệ hi n trong ng ph n ng trong quá trình luân nhi t.
ậ ỹ ả ệ ộ ả K thu t phân tích phân gi i cao nhi t đ ch y (High resolution melting,
HRM)
ư ư ể ặ ơ M c dù có u đi m h n ethidium bromide, nh ng SYBR green I cũng còn
ượ ể ệ ấ ọ ỳ ộ m t nh c đi m r t quan tr ng, đó là tín hi u hu nh quang phát ra không cao và l ạ i
ể ứ ế ượ ể ườ ể ễ ỉ có th c ch PCR. Chính vì nh c đi m này mà đ ng bi u di n đ nh ch y s ả ẽ
ộ ả ủ ế ả ả ẩ ạ ỉ không cao, đ phân gi i các đ nh ch y c a các s n ph m khu ch đ i có trình t ự
ệ ệ ể ấ ấ khác bi ề t hay/và chi u dài khác bi t cũng r t th p, không th phân bi ệ ượ c t đ
ử ụ ấ ậ ớ chúng v i nhau. Chính vì v y mà realtime PCR s d ng SYBR I làm ch t phát
ể ứ ụ ỳ hu nh quang không th ng d ng trong multiplex realtime PCR, trong realtime
14
ệ ị PCR phát hi n các SNP (single nucleotide polymorphism), hay realtime PCR đ nh
ượ đ c genotype.
ữ ệ ế ệ ể ộ ỳ Hi n nay đã có nh ng ti n b đáng k trong phát hi n các màu hu nh quang chèn
ụ ượ ắ ượ ủ ể ả kh c ph c đ c các nh c đi m c a SYBR green I. Các màu này có kh năng phát
ữ ạ ấ ơ ỳ ứ ế ộ hu nh quang r t cao và h n n a l i hoàn toàn không c ch PCR nên đ phân gi ả i
ồ ỉ ể ậ ả ấ ượ ọ ủ c a các bi u đ đ nh ch y r t cao, do v y đ c g i là các màu HRM (high
ả ệ ộ ố ệ ấ ỳ resolution melting dye). B ng 5 li t kê m t s ch t hu nh quang HRM hi n nay
ượ ứ ứ ự ự ụ ọ ộ đang đ c các nhà nghiên c u ng d ng, và s l a ch n màu nào là tùy thu c vào
ọ ỳ kênh ánh sáng kích thích và ánh sáng hu nh quang mà máy realtime PCR h đang
ể ự ệ ượ ạ ệ ắ ử ụ s d ng có th th c hi n đ c trong quá trình ch y luân nhi ể t. Có th tóm t t các
ư ọ ỉ ự l a ch n này nh sau: SYTO9 hay LCGreen thì ch dành cho máy realtime PCR
ủ ủ ớ Rotor Gene c a Corbett hay Light Cycler c a Roche vì các máy này m i có kênh
ể ợ ợ màu thích h p; EVAGreen hay BEBO thì có th thích h p trên các máy realtime
ấ ố ư ủ ụ PCR thông d ng và r t t i u trên realtime PCR c a Biorad hay Applied Biosystem
(dùng đúng kênh màu FAM hay SYBR green I); BOXTO thì dùng kênh màu Joe có
ể ế ợ ụ ề ớ trên nhi u máy realtime PCR thông d ng, có th k t h p v i realtime PCR dùng
ắ ấ ỳ Beacon probe g n ch t phát hu nh
ể ị ượ ằ ờ ậ quang là FAM, nh v y mà có th đ nh l ng DNA đích b ng FAM và phân tích
Tên HRM Hãng có bản quyền Bước sóng kích thích Bước sóng huỳnh quang Nồng độ trong ống phản ứng phát ra
SYTO9 green Molecular Probes
485¤ 498¤ 2mM
LCGreen Idaho Technology
440470¤ 470520¤ 110mM
EVAGreen Biotium Corporate 470495* 525530*
1.33mM # 1X pha từ 20X
BEBO Tataa Biocenter 468* 492*
15mM (3mM) # pha từ 5mM
BOXTO Tataa Biocenter
515§ 552§ 0.30.7mM (0.5mM)
¤
Chỉ thích hợp cho Rotor Gene và Light Cycler; *Thích hợp cho kênh màu FAM và SYBR của các máy realtime PCR thông dụng; §
Thích hợp cho kênh Joe của các máy PCR thông d ngụ
ớ HRM curve v i kênh Joe.
15
Với realtime PCR dùng HRM làm màu chèn, nhà nghiên cứu cũng như
người làm thử nghiệm hoàn toàn có thể
ệ thực hi n realti me PCR để không chỉ
ặ ộ đ nhị ệ lượng m t cách đ c hi u
được tác nhân đích có trong m uẫ
thử, mà còn có thể thực hi nệ được
multiplex realtime PCR để phát hi nệ
ề nhi u tác nhân đích, phát hi nệ các đ tộ
ậ bi nế th m chí SNP với ch 1ỉ
nucleotide khác bi t,ệ phát hi nệ và
xác đ nhị được genotype. Chìa khóa
chính c aủ các bước ti nế này là
ỉ ề ề khả năng không ch v chi u dài mà c ả
ệ ự ủ ế ế ả ẩ ạ ự s khác bi t trình t có khi đ n 1 nucleotide c a các s n ph m khu ch đ i có trong
ố ả ứ ờ ả ấ ư ệ ủ ứ ế ng ph n ng nh b n ch t u vi t c a các màu HRM là không c ch PCR và
ờ ườ ủ ộ ộ ỳ ử ồ đ ng th i c ng đ phát phát hu nh quang c a m t phân t màu HRM khi chèn
ể ế ầ ợ ớ ự ị vào s i đôi DNA có th tăng đ n trên 250 l n so v i khi t do trong dung d ch.
ườ ạ ươ ệ ờ ậ Chính nh v y mà ng ệ i làm thí nghi m khi ch y ch ng trình luân nhi t phân tích
ộ ả ươ ỉ ạ ứ ệ melt curve đ phân gi ọ i cao (g i là ch ng trình HRM) – t c là ch ch y luân nhi t
ả ộ ệ ệ ộ ẹ ụ ế phân tích melt curve trong m t kho ng cách bi t nhi t đ h p (ví d 73oC đ n 78oC
ệ ộ ư ế ế ạ ả ẩ ả là kho ng nhi t đ mà s n ph m khu ch đ t Tm, thay vì 55oC đ n 95oC nh trong
ươ ệ ườ ế ể ch ng trình luân nhi t phân tích melve curve bình th ả ng đ dò Tm) – k t qu
ồ ỉ ủ ể ả ả ệ ự ệ ủ bi u đ đ nh ch y hoàn toàn đ phân gi ể i cao đ phân bi t s khác bi ả t c a các s n
16
ộ ế ả ứ ế ể ả ẩ ạ ố ọ ồ ph m khu ch đ i có trong ng ph n ng. Bi u đ 5 minh h a m t k t qu cho
ấ ệ ượ ự ệ ể ả ạ ỉ ể th y có th phân bi c s khác bi t đ t ch 1 nucleotide, k c tình tr ng
ủ ể ế ạ ả ẩ ồ heterozygote c a các s n ph m khu ch đ i qua bi u đ HRM.
ử ụ ấ ỳ 1. Realtime PCR s d ng probe làm ch t phát hu nh quang.
ượ ị ữ ạ ạ ợ Probe đ c d ch là “đo n dò” hay “dò”, đó là nh ng đo n oligonucletides s i
ự ể ắ ặ ớ ổ ộ ự ặ ệ ơ đ n có trình t có th b t c p b sung v i m t trình t đ c hi u trên DNA đích
ạ ặ ệ ừ ế ả ẩ (trong PCR, đó là s n ph m khu ch đ i đ c hi u t ử ụ DNA đích). S d ng probe làm
ạ ặ ặ ả ự ế ẩ ấ ỳ ắ ch t phát hu nh quang d a trên nguyên t c là khi có m t s n ph m khu ch đ i đ c
ự ắ ặ ủ ả ứ ệ ẽ ố ự ặ ệ ủ hi u trong ng ph n ng thì s có s b t c p c a probe lên trình t đ c hi u c a
ự ắ ặ ự ế ẽ ẩ ạ ỳ ừ ả s n ph m khu ch đ i, và khi có s b t c p này thì s có s phát hu nh quang t
ố ả ứ ậ ượ ề ạ ồ ng ph n ng khi nó nh n đ c ngu n sáng kích thích. Có nhi u lo i probe, và
ậ ượ ử ụ ấ ả th m chí c primers đ ỳ c s d ng làm ch t phát hu nh quang cho realtime PCR.
ỹ ộ ố ườ ạ ượ ử ụ Trong ph m vi bài này, chúng tôi xin trình bày k m t s th ng đ c s d ng
ệ hi n nay.
ắ ỹ ử ụ ậ ử ụ a. Realtime PCR s d ng Taqman probe. Nguyên t c k thu t realtime PCR s d ng Taqman probe:
ầ ơ ả ủ ậ ỹ Trong k thu t này, realtime PCR mix ngoài các thành ph n c b n c a PCR
ứ ể ể ầ ỳ ọ mix, còn ch a hai thành ph n quan tr ng đ probe có th phát hu nh quang đ ượ c
ủ ả ự ệ ạ ặ ệ ừ ệ ế ẩ khi có s hi n di n c a s n ph m khu ch đ i đ c hi u t DNA đích, đó là: (1)
ữ ự ổ ộ Taqman probe, là nh ng oligonucleotides có trình t ớ b sung v i m t trình t ự ặ đ c
ệ ự ớ ầ ế ả hi u trên DNA đích, và trình t ắ này dài kho ng 24 đ n 30 bases v i đ u 5’ có g n
ấ ấ ụ ươ ắ ầ ấ ọ ỳ ch t phát hu nh quang (g i là reporter) còn đ u 3’ có g n ch t h p ph t ứ ng ng
ể ấ ụ ượ ọ ỳ ượ ừ (g i là quencher) đ h p ph đ c ánh sáng hu nh quang đ c phát ra t reporter.
ể ạ ả ủ (2) Enzyme Taq polymerase có ho t tính 5’3’ exonuclease đ có kh năng th y
17
ả ắ ỏ ắ ặ ủ ầ ả ồ ợ gi i c t b probe khi probe này b t c p lên s i khuôn và c n đ u 3’ c a m i khi
ợ ợ ổ ồ ổ ủ ế ơ ỳ enzyme kéo dài m i t ng h p s i b sung. C ch phát hu nh quang c a Taqman
ỳ ể ọ probe trong các chu k nhi ệ ượ t đ c trình bày minh h a trong hình 25. Có th tóm t ắ t
ệ ủ ả ạ ặ ệ ừ ư ư ự ế ẩ ấ nh sau: (1) Khi ch a có s xu t hi n c a s n ph m khu ch đ i đ c hi u t DNA
ẹ ậ ẫ ỳ đích thì Taqman probe v n còn nguyên v n do v y mà hu nh quang phát ra đ ượ ừ c t
ở ầ ở ầ ụ ố ử ủ ệ ấ reporter ẽ ị đ u 5’ s b quencher đ u 3’ c a probe h p ph , ng th nghi m s ẽ
ượ ậ ượ ỳ ồ không phát đ c hu nh quang khi nh n đ ắ ầ c ngu n sáng kích thích. (2) Khi b t đ u
ẽ ắ ặ ệ ả ạ ặ ự ế ệ ẩ ấ có s xu t hi n s n ph m khu ch đ i đ c hi u thì Taqman probe s b t c p vào
ẩ ở ạ ệ ộ ắ ặ ẽ ị ủ ả ợ s i khuôn c a s n ph m này giai đo n nhi t đ b t c p và s b enzyme Taq
ắ ỏ ể ợ ổ ồ ổ ậ ủ ợ polymerase c t b đ kéo dài m i t ng h p nên s i b sung, do v y mà reporter c a
ẽ ị ắ ờ ượ ậ ỳ Taqman probe s b c t r i xa quencher và phát đ c hu nh quang khi nh n đ ượ c
ệ ề ế ẩ ạ ấ ồ ả ngu n sáng kích thích. Càng nhi u s n ph m khu ch đ i xu t hi n thì s l ố ượ ng
ự ẽ ề ộ ườ ộ ỳ reporter t ế do s càng nhi u, đ n m t lúc nào đó c ng đ hu nh quang phát ra t ừ
ủ ạ ẽ ậ ượ ệ ỳ reporter đ m nh thì máy s ghi nh n đ c tín hi u hu nh quang phát ra t ừ ố ng
ả ứ ậ ượ ồ ph n ng khi nh n đ c ngu n sáng kích thích.
ủ Reporter và quencher c a Taqman probe:
ư ở ấ ắ ủ ầ ộ Nh đã nói trên, reporter là m t ch t g n vào đ u 5’ c a Taqman probe, có
ả ượ ậ ỳ ượ ồ kh năng phát đ c hu nh quang khi nh n đ ề c ngu n sáng kích thích. Có nhi u
ạ lo i hóa ch t đ ấ ượ ử ụ c s d ng
làm reporter.
ấ Quencher là ch t có
ả ấ kh năng h p ph đ ụ ượ c
ỳ ánh sáng hu nh quang phát
ừ ra t reporter khi reporter
ượ ậ nh n đ c ánh sáng kích
ạ thích. Có hai lo i quencher,
đó là quencher phát hu nhỳ
quang và quencher phát
ệ nhi ỳ t. Quencher phát hu nh
quang là quencher khi h pấ
ụ ỳ ph ánh sáng hu nh quang
18
ẽ ể ượ ụ ượ ấ ậ ừ t reporter s chuy n năng l ng h p ph đ c thành ánh sáng, do v y quencher s ẽ
ư ế ỳ ượ ả phát ra hu nh quang nh ng không đ n đ ế c CCD hay c m bi n quang vì b c n l ị ả ạ i
ọ ỳ ỉ ừ ở b i kính l c ch dành cho ánh sáng hu nh quang phát ra t ộ reporter. TAMRA là m t
ụ ọ ỳ ườ ượ ví d minh h a cho quencher phát hu nh quang, th ng đ c dùng cho taqman
ẽ ả ỳ probe có reporter là FAM (b ng 6). Dùng quencher phát hu nh quang s có m t tr ộ ở
ạ ỳ ừ ể ổ ỳ ng i là hu nh quang phát ra t ủ ớ quencher có th trùng v i ph hu nh quang c a
ủ ế ộ ượ ế reporter c a m t Taqman probe khác, n u realtime PCR đ c thi t k ế
ứ ứ ậ ọ ọ multiplex, do v y mà khi ch n l c reporter cho probe th 2 hay th 3 thì nhà
ả ể ứ ể ạ ở ệ nghiên c u ph i đ ý đ tránh tr ng i này. Quencher phát nhi t là quencher s ẽ
ể ượ ụ ượ ấ ệ ụ ụ ấ chuy n năng l ng h p ph đ c thành nhi ỳ t, ví d DABCYL h p ph hu nh
ướ ụ ỳ ướ ố ư quang b ấ c sóng 425, BHQ0 h p th hu nh quang b c sóng 430520 (t i u 493),
ụ ỳ ấ ố ư ụ ấ ỳ BHQ1 h p th hu nh quang 480580 (t i u 534), BHQ2 h p th hu nh quang 560
ố ư ấ ỳ ố ư 670 (t ụ i u 579), BHQ3 h p th hu nh quang 620730 (t i u 672). Quencher phát
ệ ệ ượ ư ả ộ ơ ỳ nhi t hi n nay đ ấ c a chu ng h n quencher phát hu nh quang vì kh năng h p
ụ ạ ỳ ượ ư ỗ ấ ph hu nh quang r t m nh, các BHQ đ c xem nh các l đen (black hole quencer,
ấ ấ ả ừ ấ ứ ỳ BHQ) hút l y t ỳ t c các hu nh quang t reporter không cho b t c hu nh quang nào
ờ ấ ễ ể ồ ế ế phát ra đ ượ ừ c t reporter, đ ng th i r t d dàng đ thi t k các taqman probe dùng
ủ ế ỳ ị ổ cho multiplex PCR mà không lo đ n ph hu nh quang c a các reporter có b trùng
B nả g 6: Trình bày các reporter hiện nay đang được các nhà nghiên cứu sử d nụ g cùng với bư cớ sóng
kích thích, huỳnh quang phát ra, và quencher tương ứng
Tên reporter Bước sóng Bước sóng HQ Quencher
Tên reporter Bước sóng Bước sóng Quencher kích thích HQ phát ra
kích thích phát ra
Cy3TM 548 566 BHQ2
522 544 BHQ1
FAM 495 520 TAMRA, DABCYL, BHQ1 TAMRA 557 583 BHQ2, DABCYL
Cal Fluor(cid:210) Gold 540
TET 521 536 BHQ1, DABCYL
Cal Fluor Orange 560 538 559 BHQ1
Cal Fluor Red 590 569 591 BHQ2
TEXAS RED 590 610 BHQ2, BHQ3, DABCYL VIC 538 554 BHQ1
Cal Fluor Red 610 590 610 BHQ2
Cal Fluor Red 635 618 637 BHQ2
HEX 535 556 BHQ1, BHQ3, DABCYL JOE 529 555 BHQ1
LC red 640 618 637 BHQ2
460 650 BHQ2
Cy5 647 667 BHQ2, BHQ3
Pulsar(cid:210) 650
Cy5.5 690 705 BHQ2
Quasar 670 647 667 BHQ2
Quasar 705 690 705 BHQ3
Rox 586 610 BHQ2, BHQ3, DABCYL
ủ ề ổ ỳ ỳ ớ v i ph hu nh quang c a quencher vì quencher không h phát hu nh quang.
Thi tế kế m iồ và Taqman probe
19
Thi tế kế m iồ cho realtime PCR dùng Taqman probe cũng theo các qui lu tậ
thi t ế kế m iồ chung cho PCR (trình bày trong ph nầ thi tế kế m iồ dành realtime
PCR dùng màu hu nhỳ quang chèn). Trong realtime PCR dùng Taqman probe thì
nên thi tế kế m i cóồ nhi tệ độ ch yả khoảng 55oC 60oC và th pấ hơn nhi tệ độ
ch yả c aủ Taqman probe khoảng 5oC 10oC. Để thi tế kế Taqman probe, nên
thi tế kế để không dài quá 30 bases, tỷ lệ GC trong probe khoảng 3080 % với C
ầ ủ nhi uề hơn G, vị trí b t c p c a ắ ặ ủ đ u 5’ c a Taq man probe chỉ 25 bases cách vị
ấ ọ trí 3’ của m iồ b tắ c pặ trên cùng sợi đích, và r t quan tr ng là ầ đ u 5’ g nắ
ề ấ reporter không ph iả là G vì G có thể là quencher cho r t nhi u reporter. Có thể sử
ể d ngụ ph nầ mềm Beacon Designer đ thi ế kế m iồ và Taqman probe. Ph nầ mềm t
này được c pấ mi nễ phí cho các phòng thí nghiệm mua máy PCR iCycler cua
Biorad. Ngoài ra, vi cệ ch nọ reporter và quencher cũng là m tộ v nấ đề h tế sức
ể ề khả năng lựa ch nọ cho phù hợp. quan tr nọ g. Xin tham kh oả b ngả 6 đ có nhi u
Khi thi tế kế m iồ cho realtime PCR dùng Taqman probe thì cũng nên lưu
ể ý đ chi u ề dài s nả ph mẩ kh chế đ iạ trong khoảng 75150 bps, không nên quá 150
ể ệ bps đ hi u qu ả PCR có thể đ tạ được t iố h o.ả Tuy nhiên trên thực tế cũng còn
tùy thu cộ vào DNA đích có cho phép chúng ta ch nọ được m iồ đ t đạ ược t iố h oả
ả đ cóể s n ph m ẩ khu chế đ i đ t ạ ạ như v yậ hay không. Công ty Nam Khoa đã có
ử ụ bộ thử nghiệm RT realtime PCR s d ng Ta qman probe để phát hi n ệ và đ nhị
lượng HCVRNA dựa trên sự khu chế đ iạ sợi cDNA đích dài 240 bps phiên mã
ẫ ả ngược từ vùng 5’NC c aủ bộ gene c aủ virus mà v n đ t đ ệ ạ ược hi u qu PCR t ố i
ể ệ ạ ả h o th hi n qua E% luôn đ t 90105 % ( bi uể đồ 6); cũng chính nhờ v yậ mà
công ty tri nể khai được thử nghiệm gi iả trình tự s nả phẩm realtime PCR này
đ xácể đ nhị được genotype c aủ HCV nhi mễ trên b nhệ nhân.
ệ Chương trình luân nhi t realti me PCR dùng taqman probe thường chỉ có hai
o C trong 15 – 30
giai đo nạ nhi tệ độ là: bi nế tính giây, kế đó là giai 94 – 95
đo nạ vừa b t c p ắ ặ vừa kéo dài ở 60oC trong 3060 giây và thi ị tế b realti me sẽ ho tạ
20
động ở giai đo nạ này. Ở giai đo nạ
o C thì Taqman probe
nhi t ệ sẽ b tắ độ 60
c pặ vào sợi đích trước vì đây là nhi tệ
độ b tắ c pặ t iố h oả c aủ Taqman probe
(th p hấ ơn Tm c aủ Taqman probe là 65 –
70oC, nhưng bằng hay cao hơn Tm c aủ
m iồ là 55oC 60oC) r iồ sau đó m iồ
mới b tắ c pặ vào. Chính nhờ v yậ mà khi
ổ Taq polymerase t ng h ợp sợi bổ sung,
ộ ủ enzyme này mới có cơ h i th y gi iả
ả ầ được Taqman probe c n đ u nó. N uế
m iồ b tắ c pặ trước vào sợi đích thì sẽ
không có cơ h iộ để Taqman probe b tắ c p ặ vào sợi đích và như v yậ thì Taqman
probe sẽ không thể bị th yủ gi iả khi enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung.
Đây chính là lý do gi iả thích t iạ sao ph iả thi tế k ế m iồ có Tm kho nả g 5560oC và
th pấ hơn Tm c aủ Taqman probe 5oC 10oC.
b. ử ụ Realtime PCR s d ng Beacon probe.
21
Trong kỹ
ậ thu t này, probe
ượ ử ụ đ c s d ng có tên là
Beacon molecular
probe. Đây là probe có
ự trình t ả dài kho ng
2540 bases, có đ uầ 5’
ớ ắ g n v i reporter và
ắ ớ ầ đ u 3’ g n v i
quencher. Probe có
ự trình t 1539 bases ở
ữ ớ ổ gi a là b sung v i
ộ ự ặ ộ ợ ủ ầ ủ ệ m t trình t ỗ ầ đ c hi u trên m t s i c a DNA đích, còn hai đ u c a probe thì m i đ u
ộ ự ấ ạ ổ ớ có m t trình t 56 bases b sung v i nhau làm cho probe t o thành c u trúc hình
ự ủ ạ ộ ắ ặ ủ ế ầ ơ ẹ k p tóc do trình t c a hai đ u b t c p nhau. C ch ho t đ ng c a Beacon probe
ọ ắ ượ đ c minh h a trong hình 26, tóm t ư t nh sau:
Ở ệ ộ ế ủ ẹ ấ (1) ạ giai đo n nhi t đ bi n tính, c u trúc k p tóc c a Beacon probe không
ế ở ẽ ậ ạ còn nên n u ồ giai đo n này reporter nh n ngu n sáng kích thích thì nó s phát
ỳ hu nh quang.
Ở ạ ệ ộ ắ ặ ặ ả ư ế ế ẩ (2) giai đo n nhi ạ t đ b t c p, n u ch a có m t s n ph m khu ch đ i
ẽ ệ ượ ậ ượ ỳ ặ đ c hi u, Beacon probe s không phát đ c hu nh quang khi nh n đ ồ c ngu n sáng
ủ ẹ ầ ấ ớ ầ kích thích vì c u trúc k p tóc c a hai đ u đã làm cho reporter g n v i quencher
ế ấ ả ỳ ừ ụ ư ề ế ấ ị khi n t t c hu nh quang phát t reporter đ u b quencher h p ph . Nh ng n u có
ẽ ắ ặ ạ ặ ặ ả ệ ế ẩ ự ặ m t s n ph m khu ch đ i đ c hi u, Beacon probe s b t c p vào trình t ệ đ c hi u
ờ ậ ủ ế ạ ẩ ả ợ trên s i đích c a s n ph m khu ch đ i, nh v y reporter cách xa quencher nên
ượ ậ ồ ỳ reporter phát đ c hu nh quang khi nh n ngu n sáng kích thích.
ạ ệ ộ ủ (3) Trong giai đo n nhi t đ kéo dài, enzyme Taq polymerase không th y gi ả i
ợ ổ ỏ ợ ỉ Beacon probe mà ch làm tách Beacon probe kh i s i đích khi s i b sung đ ượ ổ c t ng
ế ự ắ ặ ạ ố ợ h p kéo dài đ n trình t mà probe b t c p vào. Cu i giai đo n kéo dài, Beacon probe
ỏ ợ ở ạ ấ ẹ tách kh i s i đích và tr i c u trúc k p tóc nên không cho reporter phát đ l ượ c
ậ ượ ế ỳ ồ hu nh quang n u nh n đ c ngu n sáng kích thích.
22
Ọ Ả V. Đ C K T QU REAL TIME PCR.
2 đánh giá đ chính xác c a thao tác
Ế ố ầ ệ ố ươ ủ ộ Thông s đ u tiên là h s t ng quan R
ể ấ ố pipetting l y có đúng th tích mong mu n hay không. Tr s R ị ố 2 ph i đ t là trên hay ả ạ
ườ ế ể ễ ẩ ằ b ng (≥) 0.99 có nghĩa là đ ả ạ ng bi u di n chu n ph i đ t tuy n tính cao. Khi
ườ ử ấ ượ ể ắ ắ ng ệ i làm th nghi m không l y đ c các th tích chính xác thì ch c ch n các th ể
ẽ ể ẫ ẩ ượ tích m u chu n cho vào realtime PCR mix s không th nào chính xác đ c, nên
ắ ẽ ể ạ ắ R2 ch c ch n s không th nào đ t ≥ 0.99.
ộ ấ ị M t tr s ị ố ữ n a r t có giá tr mà
ườ ệ ả ế ng i làm th ử nghi m ph i bi t rõ đó
ệ ả ượ ọ là hi u qu PCR, đ c g i là E% (PCR
ệ ạ efficiency). M tộ ả khi PCR đ t hi u qu lý
ứ ỗ ỳ ưở t ng, thì c sau m i chu k nhi ệ ườ ng t c
ỳ ộ ố ộ đ hu nh quang ả ứ trong m t ng ph n ng
ả ấ ế ở ố ph i tăng g p đôi, còn n u ả hai ng ph n
ứ ng có s ố ượ ng l ầ ả b n DNA đích ban đ u
cách nhau m t hộ ệ ố s pha loãng A, thì hai
ỳ ớ ườ ạ ẽ ế ể ễ ộ ỳ ườ đ ng bi u di n khu ch đ i s cách nhau n chu k v i c ủ ng đ hu nh quang c a
ộ ệ ố ư ậ ả ứ ẽ ế ố hai ng ph n ng cũng s cách nhau m t h s pha loãng A = 2n. Nh v y, n u đ ộ
ủ ủ ẫ ẩ ầ ộ ế pha loãng là 10 l n thì Ct c a các đ pha loãng DNA đích c a m u chu n liên ti p
ẽ ỳ ừ ứ ẽ nhau s cách nhau là 3.32 chu k (tính toán t ớ công th c trên v i A = 10, s tính
ỳ ượ đ c n = 3.32 chu k ).
ể ẫ ẩ ẩ ồ ớ ộ Trong bi u đ chu n v i các m u chu n cách nhau qua đ pha loãng h s ệ ố
ế ệ ạ ượ ứ ằ ớ ả 10 thì hi u qu khu ch đ i E đ c tính là b ng công th c 101/slope v i slope chính
ộ ố ủ ườ ể ễ ộ ưở ệ ế ạ ả là đ đ c c a đ ẩ ng bi u di n chu n. M t cách lý t ng, hi u qu khu ch đ i E
ả ạ ượ ố ượ ả ừ ả ả ủ c a PCR ph i đ t đ c là 2 nghĩa là s l ng b n sao nhân b n t b n DNA đích
ả ấ ỗ ỳ ệ ạ ưở ừ ứ ph i tăng g p đôi sau m i chu k nhi t trong giai đo n tăng tr ng lũy th a, t c là
ừ ẽ ể ứ 2 = 101/slope. T công th c này, chúng ta s tính ra đ ượ ườ c đ ẩ ễ ng bi u di n chu n
ưở ư ậ ộ ố ộ ố ấ ả lý t ng ph i có đ đ c (slope) là 3.32. Nh v y, chúng ta th y đ d c chính là s ự
ệ ề ỳ ưỡ ố ượ ữ ẩ ố ả ầ cách bi t nhau v chu k ng ng gi a các ng chu n có s l ng gi m d n theo
ệ ế ể ạ ầ ằ ả ớ ệ ố h s pha loãng 10. Hi u qu khu ch đ i cũng có th tính b ng ph n trăm (%) v i
ừ ạ ớ ưở ứ công th c tính t E là: E% = (E1) x 100%. V i E đ t lý t ng là 2 thì E% = 100 %.
23
ố ớ ấ ứ ộ ườ ể ể ề ể ẩ ượ Đ i v i b t c m t đ ng bi u di n chu n nào, đ u có th tính đ ệ c hi u qu ả
ộ ố ủ ế ế ậ ạ khu ch đ i E % = (101/slope – 1) x 100 %. Do v y n u đ d c c a m t đ ộ ườ ng
ệ ể ẽ ễ ậ ả ẩ ủ bi u di n chu n là 3.436 thì E s là 10(1/3.436) = 1.954, v y thì hi u qu % c a
ế ệ ẽ ả ạ khu ch đ i (hi u qu PCR) s là: E % = (1.954 – 1) x 100% = 95.4 %, có nghĩa là
ạ ưở ừ ố ượ ả ỗ ỳ trong giai đo n tăng tr ng lũy th a s l ng b n sao sau m i chu k nhi ệ ẽ t s
ệ ệ ả ả ầ ượ đ c nhân lên 1.954 l n hay hi u qu PCR là 95.4 %. Dĩ nhiên hi u qu PCR lý
ự ế ệ ấ ậ ả ượ ưở t ư ng là 100 %, nh ng trong th c t thì hi u qu PCR ch p nh n đ ả c ph i trong
ả kho ng 90 % 105 %.
ườ ệ ả ế ệ ể ể ả ị Ng i làm thí nghi m ph i bi t dùng hi u qu PCR hi n th trong bi u đ ồ
ẫ ủ ể ể ầ ầ ẩ chu n đ đánh giá thao tác pipetting đ pha loãng m u c a mình. Sai l m đ u tiên
ể ặ ẫ ượ ừ ẫ ồ có th g p trong thao tác pha loãng m u là mang l ng DNA đích t m u n ng đ ộ
ộ ấ ẫ ố ơ ườ ầ ồ cao xu ng m u có n ng đ th p h n, mà th ng là do không thay đ u pipette sau
ể ừ ồ ộ ấ ố ượ ậ ộ ố ồ khi mang th tích t n ng đ cao xu ng n ng đ th p, vì v y mà s l ả ng b n
ẩ ẫ ượ ẽ ề ơ DNA đích có trong các m u chu n đ c pha loãng s nhi u h n tính toán. Ví d ụ
ừ ố ồ ế n u thao tác pha loãng chính xác, thì t 10.000 copies xu ng 1.000 copies r i 100
ỗ ầ ư ậ ư ẽ ế ầ copies s chính xác nh v y; nh ng n u không thay đ u pipette sau m i l n hút
ẫ ượ ả ở ầ ẽ m u và l ng b n đích mang theo đ u pipette là 40% thì chúng ta s có các s ố
ẽ ố ồ ượ l ng s là 10.000 copies xu ng 4.000 copies r i 1.600 copies.
ậ ả ượ ạ ượ ẽ ằ ị ệ Vì v y nên hi u qu PCR đ c tính toán b ng giá tr E s không đ t đ c lý
ế ẽ ơ ỳ ưỡ ủ ưở t ng 90 % đ n 105 % mà s cao h n 105 %. Lý do là chu k ng ẫ ng c a các m u
ẽ ị ầ ộ ố ủ ẩ ườ ễ ể ẩ ấ ơ chu n s b g n nhau h n làm cho đ d c c a đ ng bi u di n chu n th p đi.
ượ ạ ế ủ ể ẫ ẩ Ng i n u thao tác pha loãng mà không cho đ th tích m u chu n hút t c l ừ ẫ m u
ố ượ ẩ ượ ể ẫ ẩ ấ ầ ơ có s l ng DNA chu n cao đ pha m u chu n l ng th p h n (sai l m này có th ể
ẩ ầ ị ị ượ ặ g p khi dùng các đ u pipette b dính dung d ch trên thành nên không đ y đ ế c h t
ẫ ừ ầ ư ậ ế ẫ ố ỳ ượ l ng m u t đ u pipette xu ng m u k ), và chính nh v y nên chu k ng ưỡ ng
ộ ố ủ ườ ế ẩ ẫ ẽ ủ c a các m u chu n liên ti p nhau s cách xa nhau làm cho đ d c c a đ ể ng bi u
ẽ ướ ệ ễ ả ấ ẩ ệ di n chu n th p đi, và hi u qu PCR s d ộ ả i 95 %. Hi u qu PCR cũng là m t
ố ấ ị ể ứ ố ư ượ ậ ỹ thông s r t có giá tr đ nhà nghiên c u t i u đ c k thu t realtime PCR mà
ế ệ ể ả ế ế ồ ư ấ mình. N u hi u qu PCR th p thì nguyên do có th là thi t k m i ch a đ t đ ạ ộ
ạ ế ả ứ ứ ế ế ả ạ nh y, do tách chi ế t DNA đích còn các c ch ngăn c n ph n ng khu ch đ i. N u
24
ệ ả ạ ự ắ ặ ệ ủ ể ặ hi u qu PCR cao thì nguyên do l ồ i có th là do s b t c p không đ c hi u c a m i
ủ ạ hay c a đo n dò.
ư ậ ệ ế ậ ấ ầ ể ẩ ồ ế Nh v y, vi c thi t l p bi u đ chu n là r t c n thi t khi làm realtime PCR
ẩ ặ ệ ố ượ ể ị ầ ch n đoán, đ c bi t khi đ xác đ nh chính xác s l ng tác nhân đích ban đ u có
ử ụ ể ẫ ẩ ướ ượ ồ trong m u th . Bi u đ chu n có công d ng tr c tiên là đánh giá đ c thao tác
ủ ườ ế ứ ử ệ ệ ạ ộ pipetting c a ng i làm th nghi m có đ t không. Đây là m t vi c là h t s c quan
ọ ế tr ng vì n u thao tác pipetting mà
ể ẽ không chính xác thì s không th nào có
ượ ượ đ ế c k t qu ả ị đ nh l ng chính xác
ầ ượ đ ậ c. Do v y ẽ ậ s th t là sai l m và
ể ế ấ thi u hi u bi ế t ả ế n u nhà s n xu t b ộ
ử ố ể ị thu c th real time PCR dành đ đ nh
ạ ấ ượ l ng tác nhân đích l ẵ i cung c p s n
ướ các PCR mix có cho tr c các l ượ ng
ẩ ọ ủ chu n c a DNA đích, g i là các b ộ
ể ẩ ườ ệ ự ể ẩ chu n, mà không đ cho ng i làm thí nghi m t ẫ pha loãng các m u chu n đ cho
vào realtime PCR mix.
ượ ủ ườ ử ệ Sau khi đã đánh giá đ c thao tác pipetting c a ng ạ i làm th nghi m là đ t,
ườ ẽ ử ụ ử ụ ứ ủ ệ ể ẩ ồ ng i làm th nghi m s s d ng công d ng th hai c a bi u đ chu n, đó là xác
ử ầ ẫ ị ượ ị đ nh đ ượ ố ượ c s l ng tác nhân đích ban đ u có trong m u th . Giá tr này đ c tính
ị ố ươ ố ể ờ ỳ ưỡ toán nh vào hàm s bi u th m i t ữ ng quan gi a chu k ng ớ ng (Y = Ct) v i
ủ ố ượ ả ứ ầ ả ố log10 c a s l ng b n DNA đích ban đ u có trong ng ph n ng (X = log10 Sq).
ề ố ố ể Hàm s đó là: Y = [slope (X)] + intercept, và các thông s slope và intercept đ u hi n
ừ ể ồ ố ị ườ ẽ ể ẩ th trên bi u đ chu n. T hàm s này, ng ệ i làm thí nghi m s hi u đ ượ ạ c t i sao
ị ượ ể ờ ừ máy tính hi n th đ c Sq, đó là nh tính toán t Sq = 10[(Ct – intercept)/slope]. T ừ
ườ ẽ ầ Sq này, ng ệ i làm thí nghi m s tính đ ượ ố ượ c s l ng tác nhân đích ban đ u có trong
ử ự ệ ẫ ả ế ừ ẫ ử m u th d a vào hi u qu tách chi t nucleic acid đích t m u th và các pha loãng
ế ủ ư ự ụ ệ ế n u có trong quá trình tách chi t c ng nh th c hi n realtime PCR. Ví d : khi s ử
ệ ộ ố ị ượ ả ử ụ d ng các b thu c th phát hi n và đ nh l ấ ng HCV do công ty Nam Khoa s n xu t
ẽ ằ ử ế ệ ố ớ thì s copies HCV có trong 1 ml huy t thanh th nghi m s b ng N x 71 v i N là s ố
ị ượ ượ ử ụ ả ứ ố ố ộ copies đ nh l ng đ c trong ng ph n ng, hay khi khi s d ng các b thu c th ử
25
ệ ị ượ ả ấ ố phát hi n và đ nh l ng HBV do công ty Nam Khoa s n xu t thì s copies HBV có
ử ế ệ ớ ố ị ẽ ằ trong 1 ml huy t thanh th nghi m s b ng N x 50 v i N là s copies đ nh l ượ ng
ả ứ ố ượ đ c trong ng ph n ng.
Ụ VI. NG D NG TRONG CHU N ĐOÁN VÀ NGHIÊN C U.
Ẩ ụ ị Ứ ệ ượ ố ấ Ứ Realtime PCR là công c đ nh l ng tác nhân gây b nh t t nh t trong
ệ ẫ ẩ m u b nh ph m.
ố ượ ề (cid:0) Xác đ nh s l ị ị ng virus (HIV, HBV, HCV...): Theo dõi đi u tr
ố ượ ở ầ ủ ệ ẩ (cid:0) Xác đ nh s l ị ấ ng kh i đ u c a các tác nhân gây b nh kh n c p
ế ệ ấ ẫ ố ứ trong m u b nh (S t xu t huy t, H5N1, H1N1..): Tiên đoán m c
ế ọ ả ộ đ nghiêm tr ng và tiên đoán k t qu .
(cid:0) ự ễ ẩ ạ ẩ Tình tr ng nhi m khu n th c ph m: Samonella, Campyllobacter….
ấ ộ Ứ ứ ụ ệ Realtime PCR trong nghiên c u bi u hi n gen: ng d ng r t r ng rãi ể
ứ ộ ể ệ ệ trong vi c đánh giá m c đ bi u hi n gen.
ế ượ ử ấ ớ VD: Sau khi t bào đ c x lý v i kháng nguyên hay hóa ch t, tìm
ứ ộ ể ệ ủ ể ự ủ ứ hi u s đáp ng c a TB trong m c đ bi u hi n c a gen đích.
ụ ủ ứ Các ng d ng khác c a RealTime PCR:
(cid:0) ệ Phát hi n GMO (genetically modified organism) hay GEO
ế ậ ổ (genetically engineered organism): sinh v t bi n đ i gene.
(cid:0) ệ Phát hi n SNP (single nucleotide polymorphism) (genotypic/allelic
discrimination)
Ả Ệ VII. TÀI LI U THAM KH O
ề ơ ả ấ ạ [1] TS.BS Ph m Hùng Vân. “PCR và realtime PCR Các v n đ c b n và các áp
ườ ặ ọ ụ d ng th ấ ả ng g p”. Nhà xu t b n Y h c, 2009.
ấ ả ươ ụ ử ồ ọ ỳ [2] H Qu nh H ng. “Sinh h c phân t ”. Nhà xu t b n giáo d c.
ạ ẩ ậ ọ ỹ [3] “K thu t realtime PCR”. Trung tâm đào t o và chu n đoán y sinh h c phân
ượ ử ệ t , b nh viên Y d c TP.HCM.
http://www.ysinhhocphantu.com/training/kythuatrealtimepcr/8/
[4] “Realtime PCR handbook”
http://www.genequantification.de/realtimepcrhandbooklifetechnologies
updateflr.pdf
[5] “qPCR guide”
26
http://www.eurogentec.com/uploads/qPCRguide.pdf
27
