Tiểu luận: Sản xuất insulin tái tổ hợp

Ổ

Ộ

Ệ

T NG LIÊN ĐOÀN LAO Đ NG VI T NAM

ƯỜ

Ạ Ọ

Ứ

Ắ

TR

NG Đ I H C TÔN Đ C TH NG

Ọ Ứ

Ụ

KHOA: KHOA H C NG D NG

SEMINAR:

Ổ Ợ

Ả

Ấ

S N XU T INSULIN TÁI T H P

ầ ị GVHD: TS. Tr n Th Dung

ị ỹ ễ Nguy n Th M Duyên 61203027

ễ ị Nguy n Th Hoài Nhiên – 61203099

ễ ấ ươ Nguy n Kh u Ph ng Nhung – 61203100

Ơ ƯỢ Ề S L C V INSULIN:

1. S l

ơ ượ ề ệ ể ườ c v b nh ti u đ ng:

ườ ệ ể ể + Ti u đ

ỵ ị ế ả ộ

ể ạ ố ng là m t d ng b nh do r i lo n chuy n hoá cacbon hydrat khi ơ ể ế hormone insulin c a tuy n tu b thi u hay gi m tác đ ng trong c th , ng máu luôn cao. bi u hi n ộ ạ ủ ệ ở ứ ườ m c đ

ệ ườ ườ ệ ạ ng lo i 1 do tu ỵ

+ B nh ti u đ không ti

ng có 2 th b nh chính: b nh ti u đ ề ể ế ế ạ ả ể ệ t ra insulin, lo i 2 do ti ể t gi m insulin và đ kháng insulin.

ệ ớ ạ + Bi u hi n: giai đo n m i phát sinh, ng

ể ể ườ ướ ứ ườ ệ i b nh th ệ ti u vào ban đêm và kèm theo ch ng khô mi ng, khát n ề ể ng đi ti u nhi u, c.

ủ ặ t ra thi u ho c không đ và t

ả ớ

ẫ ớ ự ố ả ổ ườ ấ ế ế + Nguyên nhân phát sinh b nh: do insulin ti ạ ấ ả i s r i lo n quá trình ơ ể ệ ướ c, ch t béo và ch t đi n gi m trong c th . ế ệ bào có tính m n c m v i insulin gi m th p, d n t ấ trao đ i đ ẫ ng, n

2. S l

ơ ượ ề c v Insulin:

a. Ngu n g c:

ồ ố

ộ ọ ộ Insulin là m t hormon quan tr ng, giúp c th h p thu glucose m t trong

ườ ữ ầ ấ ượ ơ ể ấ ng cho con ng i. nh ng thành ph n chính cung c p năng l

ồ ố ủ Ngu n g c c a insulin:

ậ ừ ụ ượ ố + Ngu n g c đ ng v t: t c tinh

+ Insulin ng

ồ ế ằ ộ ươ t y c a bò hay l n. Ngày nay, insulin đ ắ ủ ộ ế ch b ng ph ng pháp s c kí đ tinh khi ợ ấ t hóa r t cao.

i.ườ

ượ ả ấ ừ ậ ộ ươ Đ c s n xu t t insulin đ ng v t qua các ph ng pháp:

ợ ừ ợ ổ + Bán t ng h p t insulin l n.

+ Tái t

ượ ả ơ

ậ

ấ ấ ấ

ấ ượ ạ ệ ụ ủ ể ậ ờ ạ ấ c s n xu t ạ ả ử ụ ổ ợ h p DNA, s d ng n m men làm c th sinh s n đ t ng cao nh t, có c u trúc gi ng h t insulin ắ i, do v y ít t o kháng th và th i gian tác d ng ng n

ầ ổ ợ h p gen: là lo i insulin trung tính đ n thành ph n, đ ơ ể ỹ ằ b ng k thu t tái t ố ế ộ ế t hóa và ch t l đ n đ tinh khi ườ ự t nhiên c a ng h n.ơ

b. C u t o:

ấ ạ

ộ ạ ồ ỗ

Là m t protein g m 51 acid amin t o thành 2 chu i polypeptid. ỗ Ở ầ ằ ồ ỗ ố

ế h u h t các ố ầ ồ loài, chu i A g m 21 acid amin, chu i B g m 30 acid amin n i nhau b ng 2 c u n i SS(disulfua).

ượ ử ả Tr nọ g l ng phân t kho ng : 58006000 Dalton.

ủ ấ ử C u trúc c a phân t insulin

ự ộ ố ữ ạ

ử ả ồ ạ ố

ứ ủ ủ ầ

ở

ề ủ ạ ế ấ ừ ộ ế ậ ố ơ ặ M c dù trình t ủ ị đ nh c a phân t ỗ ủ ầ đ u c a chu i A và các nhánh bên c a đ u COOH c a chu i B. S t ự acid amin d n đ n c u trúc 3 chi u c a Insulin trong tình t ọ gi ng nhau. Insulin chi ấ ư các acid amin khác nhau gi a các loài nh ng m t s đo n nh t ả ầ có tính b o t n cao, các đo n đó có ch a 3 c u n i disulfua, c hai ồ ự ươ ỗ ng đ ng ấ các loài khác nhau r t đ ng v t có ho t tính sinh h c cao h n các loài khác ẫ t rút t

c. Phân lo i:ạ

ạ Có 4 lo i insulin:

ụ Insulin có tác d ng nhanh

ụ ậ Insulin tác d ng bán ch m (trung bình)

ụ ậ Insulin tác d ng ch m

ố ợ Insulin h n h p

ơ ế d. C ch :

ủ ờ Th i gian bán h y 35 phút

+ B phá h y t

ủ ạ ườ ị ở ạ ạ i đ ng tiêu hóa b i enzym proteinase t i d dày

ố ằ ườ ộ ồ ộ ng tiêm. M c đ ph thu c vào n ng đ insulin,

ứ ộ ụ ộ ậ ấ + H p thu t t b ng đ ủ ộ ị v trí tiêm, đ sâu c a mũi tiêm, v n đ ng

ể ị ạ ậ ơ ạ Insulin b chuy n hóa t i gan, th n, c . Trong đó 50% t i gan

ậ ả + Đào th i qua th n

Ổ Ợ Ử Ụ Ệ Ể Ả II. QUY TRÌNH S D NG CÔNG NGH DNA TÁI T H P Đ S N

Ấ XU T INSULIN:

1. Khái quát v công ngh DNA tái t

ề ệ ổ ợ h p:

ỹ ậ ậ ể ạ ề ậ ộ ỹ h p là t p h p nhi u k thu t đ t o ra m t gen ho c c

ợ ằ ể ả

K thu t DNA tái t ế ấ ơ ể ổ ợ ủ ằ ớ ồ ẩ ạ ả ủ ấ ả

ơ ể ạ ớ ặ ả ệ h gen ; c i bi n c u trúc c a gen, nh m t o ra các gen m i r i chuy n chúng vào ế bào, c th ch nh m m c đích s n xu t các s n ph m ( protein, enzym, trong t ế …), các t ụ ố bào, c th có tính tr ng m i theo mong mu n

ắ ề ọ ơ ở ữ ể ế ọ ủ ỹ

ử t sâu s c v các đ i phân t ỹ ạ ở ầ ề sinh h c là c s khoa h c c a k ổ ợ ậ Nh ng hi u bi ỹ ậ ậ thu t gen( k thu t di truy n) mà kh i đ u là k thu t DNA tái t h p

ậ ỹ ổ ợ ướ ơ ả K thu t DNA tái t ồ h p g m các b c c b n sau:

+ Tách chi

ế ạ ậ ố t t o ra DNA, RNA theo mong mu n ( phân l p gen)

+ T o vector tái t enzym n i)ố

ổ ợ ẩ ắ ị ớ ạ ạ h p ( chu n b vector tách dòng, enzym c t gi i h n và

ể ạ ổ ợ ế ủ ế + Chuy n ( bi n n p) DNA tái t h p vào t bào ch và nhân dòng gen

+ Sàng l c và theo dõi s ho t đ ng c a gen đ ớ

ượ ự ủ ế

ể c chuy n vào trong t ể ử ụ ạ ộ ạ ố bào ụ ng l n đo n DNA theo mong mu n đ s d ng vào m c

ọ ố ượ ủ ạ ch , t o s l đích khác nhau.

a. Phân l p gen:

ậ

 Tách chi nhau:

ế ữ ể ồ ế t DNA: tùy theo ngu n acid nucleic,có nh ng ki u tách chi t khác

ố ớ ẩ ẩ

ố ớ ằ ế ủ ỡ ấ ạ ằ

ế ợ ạ + Đ i v i vi khu n, nuôi vi khu n thu sinh kh i l n, phá v màng, lo i ỏ b protein b ng enzim, k t t a và tinh s ch DNA b ng hóa ch t, dung môi, ị d ch chi t thích h p.

ế ế ậ ắ bào đ ng th c v t, nguyên t c tách chi

t DNA nh ư ộ ự ẫ ẩ

ướ ọ ị ư ố ớ + Đ i v i mô, t trên. Tuy nhiên chúng ta tr c ti p l y các m u sinh ph m nh lông, tóc, th t, máu, n ự ế ấ ễ c b t., mô thân , r , lá….

 Tách chi

ự ị ế tách chi t RNA, d ch chi ạ t sau khi làm s ch

ế t RNA: quy trình t ử ụ ế ế ủ ươ ng t ủ protein, s d ng enzim phân h y RNA, k t t a thu RNA.

ế ầ ẩ

ủ ượ ượ ả ứ

ng DNA, RNA: s n ph m sau khi tách chi ươ ng đ cho nghiên c u, dùng ph ạ ộ ổ ể ế ượ ụ ộ

ạ ộ

ạ t c n có đ tinh s ch và ỉ ị ng pháp đo quang ph đ xác đ nh ch ặ ầ t. Ho c dùng ng c n thi ị ng pháp đi n di trên gel th ch xác đ nh băng DNA, RNA, suy ra đ tinh ứ ế ị  Đ nh l hàm l ố ấ s h p ph , tù đó đánh giá đ tinh s ch và hàm l ươ ph ạ s ch và hàm l ệ ầ ượ ng c n thi t cho nghiên c u.

b. T o vector tái t

ạ ổ ợ h p:

ả

ỏ ặ ệ ắ c nh , có kh năng g n các gen ệ ả t ph i mang tín hi u

ế ướ ử  Vector tách dòng: là phân t DNA có kích th ả ủ ế ồ ạ bào ch và đ c bi tái b n, t n t i trong t ổ ợ ủ h p bào ch đã mang vector tái t ế ự t, t ế t trong t ầ c n thi ậ nh n bi

ạ ườ Các lo i vector tách dòng th ng dùng :

+ Plasmid : phân t

ử ạ ắ ế ấ ủ DNA d ng vòng, xo n kép, có trong t bào ch t c a vi

khu n.ẩ

+ Phage : ph n l n là phag Lamda, có h gen ch a v trí thu n l

ầ ớ ứ ệ ơ ị

ậ ậ ợ ẩ i cho cài ả

ả ễ các gen khác nhau, giúp các gen này d dàng xâm nh p vào vi khu n có kh năng và có kh năng sao chép nhanh.

ủ ế bào nhân th c

+ Virut c a t herpes…đ ự ậ th c v t

ượ ử ụ ể c s d ng trong tách dòng và chuy n gen ự : virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut ậ ộ bào đ ng v t, ở ế t

 Enzym c t gi ử

ắ

i h n ắ ự ừ ệ ả ể DNA và c t DNA

ớ ạ : là enzym có kh năng nh n bi ế ồ ạ ậ ệ nh ng đi m đ c hi u. Đ ng th i c t gen t ổ ợ ở ữ ặ ề ắ ộ ạ t m t đo n trình t trên ờ ắ h gen ạ ệ h p, t o đi u ki n g n các đo n

ế ặ phân t ắ nào đó, c t vector tách dòng ho c vector tái t ầ gen c n thi t.

 Enzym n i Ligase

ố ữ ọ ế : là nh ng enzym quan tr ng trong t bào, chúng xúc tác hình

ế ạ ớ ể ố thành các liên k t photphodieste đ n i các đo n acid nucleic v i nhau.

ọ ố ệ ề

ẩ ế ừ t t

ạ ế ừ t t vi khu n E.Coli, enzym T ườ ầ

ạ ạ ằ

ừ ư ạ ầ ỗ Có 3 lo i enzym n i quan tr ng trong Công ngh di truy n: enzym E.Coli DNA phage 4 DNA và enzym T4 RNA tách chi tách chi ử ụ ố i ta còn s d ng các đo n n i (đ u dính adaptor ) cho T4 . Ngoài ra, ngày nay ng ầ ắ ầ ố các enzym đ u b ng. Adaptor xúc tác n i các đo n DNA do các enzym c t đ u ặ ạ ằ đó t o nên đ u sol. Các adaptor đ c tr ng riêng cho m i lo i enzym. b ng t

ắ ạ ồ Dùng enzym c t h n ch t ố ộ ẫ hai ngu n DNA khác nhau, qua khâu n i tr n l n

ả ẩ ế ừ ổ ợ ẽ ạ s t o ra s n ph m DNA tái t h p.

ế ổ ợ ế ủ ạ c. Bi n n p DNA tái t h p vào t bào ch và nhân dòng gen:

ủ ế ỹ ự ậ

ế

ạ ể bào ch có th là vi khu n, t ủ ẩ ả ế ế bào ch theo k thu t bi n n p( chuy n tr c ti p ậ ế ạ h p, t o ể ế ủ ộ bào đ ng v t, t ổ ợ ề ủ ế bào ch nhân b n DNA tái t

ự ậ ố ớ ổ ợ ư h p vào t Đ a DNA tái t ủ ế ổ ợ h p vào t DNA tái t bào ch ) – t ờ ộ bào th c v t; nh b máy di truy n c a t sinh kh i l n.

ế ườ ữ Nh ng t ủ bào ch chính th ng dùng:

+ Vi khu n E.Coli: d thao tác, ít t n kém, sinh s n nhanh, t o dòng DNA tái

ễ ả ạ ố

ẩ h p nhanh. ổ ợ t

+ T bào n m men, t ườ

ạ ế ự ế ậ ộ bào đ ng v t, th c v t nuôi c y Invitro, lo i t

ậ ụ ể ấ ứ ề

ế ế ấ bào ụ ạ ộ ư ng dùng vào m c đích c th ; nh nghiên c u đi u hòa ho t đ ng này th ộ ủ c a gen, đ t bi n gen…

ữ ươ ủ ế ượ ể ư ổ ợ ế Nh ng ph ng pháp ch y u đ c dùng đ đ a DNA tái t h p vào t bào

nh n:ậ

+ K thu t siêu âm: chuy n gen vào t

ậ ỹ ế ầ bào tr n ( không có thành Xelulose)

ườ ể ợ ng thích h p trong môi tr

+ K thu t xung đi n: s d ng dòng đi n cao áp ( khoãng 500V/cm) t o l ề

ỏ ử ụ ầ ệ ệ ế ệ ạ ậ ệ bào tr n, t o đi u ki n gen xâm nh p vào h gen t ạ ỗ ế bào

ỹ ậ ủ th ng nh trên t chủ

+ K thu t vi tiêm: tiêm l ở

ượ ế ặ ế ng nh DNA vào t ủ bào ch ho c t ứ bào tr ng đã

ỹ ụ ạ ế ậ th tinh giai đo n phôi 48 t ỏ bào

ỹ ạ ầ

ế ị ắ ủ ạ

ượ ắ t b b n vi đ n mang gen c n chuy n ( súng b n ộ ạ bào ch . Vi đ n là các h t Volfram ho c vàng tr n c b n vào viên đ n l n h n, khi

ơ ố ớ ạ ớ ượ ạ ạ ậ ậ ắ + K thu t b n gen: dùng thi ủ ế ệ gen) vào h gen c a t ể ầ ớ v i gen c n chuy n và ph gia, vi đ n đ ắ ắ b n, viên đ n l n đ ể ặ ạ ớ ớ bào nh n v i gia t c l n. ắ ế i, vi đ n b n vào t ụ ữ ạ l c gi

d. Ch n l c, t o dòng và s bi u hi n c a gen:

ọ ọ ạ ệ ủ ự ể

ệ ọ ọ ế ề ơ Vi c ch n l c đúng dòng t

ế ầ ứ ả bào nh ý không đ n gi n và t n nhi u công s c. ế t

ố bào và mang đúng gen c n thi ệ ổ ợ h p đã xâm nh p vào t ể ạ ề ể ệ ả ậ Khi xác nh n DNA tái t ượ thì chúng đ ư ậ ạ c sinh s n đ t o dòng và t o đi u ki n cho gen bi u hi n

 Xác đ nh dòng vi khu n ch a plasmit tái t

ẩ

ạ ị ậ ẩ

ứ ế ổ ợ h p: sau khi bi n n p DNA vào t ế bào vi khu n khác nhau. Chúng đ ẩ ữ ẩ

ượ bào vi khu n không nh n đ ậ ạ ế ồ c plasmit không có gen l ế ạ c nuôi cây thành ượ ậ c và dòng nh n đúng plasmit tái

ề bào nh n, t o nhi u dòng t ẩ ạ nh ng dòng khu n l c vi khu n (g m dòng t ượ ậ plasmit, dòng nh n đ ổ ợ t h p).

ậ ừ ư ệ ườ Do đó mu n nh n đúng và tách đúng dòng gen t th vi n DNA, ng i ta s ử

ươ ụ d ng ph ố ng pháp:

+ Lai acid nucleic: làm tan t

ạ ẩ ẩ ấ

ỗ ắ

ạ ớ ộ ắ ặ ả

ượ ạ ọ i ch các khu n l c vi khu n trên gi y l c ử ẫ ấ ớ nitrocellulose và DNA thoát ra g n v i m u th acid nucleic có mang d u ế ổ ệ ượ phóng x v i đ dài hàng trăm nu. N u hi n t ng b t c p b sung x y ra ậ ế bào nh n có nghĩa là gen đã đ ể c chuy n vào t

+ Phát hi n ki u hình: đòi h i dòng m c tiêu ph i có bi u hi n ra

ệ ể ỏ ệ ể ả ở ạ d ng

ễ ệ ằ ụ ử protein d phát hi n b ng các phép th .

ễ ượ ậ ễ + Ph n ng mi n nhi m: khi t bào nh n đ

ế ạ ẩ

ọ ượ ấ ườ ạ ẩ ạ c trên môi tr c trên môi tr

ế ả ứ ế thì t ọ ượ m c đ có tetrecyclin. Đây là dòng t ắ ạ c plasmit có g n đo n DNA l ỉ bào vi khu n m t ho t tính kháng tetracyclin, do đó khu n l c ch ườ ng có ampicilin, không m c đ ng ọ ầ bào c n ch n

 S bi u hi n c a gen đ

ượ ư ạ c đ a vào t sau khi đ

ệ ủ ố ủ

ầ ấ ạ ơ ệ ổ ợ ế ề ể ị

ệ ọ ế ự ể ượ ạ c t o dòng: nói chung gen l ợ ể ậ bào nh n, mu n gen có bi u hi n t ng h p protein c n c u t o vector có đ các ế ố ể ơ ở phiên mã và d ch mã phù h p trên c s là c ch đi u hòa bi u bi u y u t ể ệ ủ hi n c a gen. Các vector này g i là vector bi u hi n.

2. Ý nghĩa c a s d ng công ngh DNA tái t

ủ ử ụ ệ ổ ợ ể ả ấ h p đ s n xu t insulin:

ổ ợ ộ ướ ệ ả h p là m t b

ể ả ị ệ

ườ ấ ệ ộ ệ ế ệ

ử ụ ẫ ề ẩ ẩ ả ng s n ph m v n b o đ m, chính là nh

ủ ế ệ ấ ả ố ữ ọ c nh y v t trong vi c ch a ệ ử ụ ả , khi s d ng công ngh này, giá ờ ả ấ ượ bào nhân tham gia quy trình con ngh DNA tái

ằ ấ S n xu t Insulin b ng công ngh tái t tr b nh ti u đ ng. Ngoài ra m t ý nghĩa khá quan trong khi s d ng công ngh ể ả này đ s n xu t Insulin, đó là hi u qu kinh t ả ạ ả thành s n ph m h khá nhi u mà ch t l ý nghĩa s n xu t sinh kh i cao c a t ổ ợ t h p.

3. Quy trình s n xu t Insulin b ng công ngh DNA tái t

ệ ả ấ ằ ổ ợ h p:

ườ ề ồ ộ ướ ổ i là m t quá trình sinh hóa g m nhi u b ồ c, g m hai

ươ ợ T ng h p Insulin ng ng pháp ph

a. Ph

ươ ng pháp 1:

ệ ấ ọ ỗ ặ ạ t, k t h p hoá h c ho c t o m t ti n ch t chu i

T o ra các chu i riêng bi ườ ế ợ ắ ể ạ ộ ề ỉ ạ ơ đ n proinsulin ng ỗ i, sau đó phân c t đ t o thành insulin hoàn ch nh.

ẩ ầ ị

 B

c 1ướ : Chu n b gen c n tách dòng.

ọ ỹ ử ượ tách đ c gen mã

ậ ườ ể ố ễ ằ hoá proinsulin ng ử ụ B ng k thu t tách gen s d ng trong sinh h c phân t ắ i trên nhi m s c th s 11.

ủ ỵ ủ ề ổ m u nghi n tu c a ng

ừ ẫ ể ợ ớ ế ạ

+ Tách mRNA c a gen t ng h p proinsulin t ườ i. ệ ạ ỏ ử ụ ườ ề i đ u có đuôi polyA nên s d ng

ỗ ớ ồ ặ ả ứ Dùng ph n ng RTPCR v i m i đ c hi u đ khu ch đ i gen, lo i b ủ ế ầ protein. Do h u h t các mRNA c a ng ể ắ ặ chu i polyT đ b t c p v i đuôi polyA đó.

ắ ớ ầ ế ữ ạ l i mRNA c n thi t cho quá trình

+ S d ng s c kí ái l c v i polyT gi

ự ạ ỏ ạ ử ụ ị d ch mã; còn l i lo i b DNA và các RNA khác.

ắ ỏ ầ ố ượ c mRNA.

+ C t b c u n i A T thu đ

ủ ổ ợ ừ ẫ ỵ ủ ề Tách mRNA c a gen t ng h p proinsulin t m u nghi n tu c a ng ườ i

 B

ế ế ổ ợ t k plasmit tái t h p. c 2ướ : Tách và thi

ằ

ớ ạ + C t gen mã hoá proinsulin và plasmit b ng m t lo i enzym gi ệ ể ạ ộ ầ ủ ủ

ệ ượ ể ẩ ạ ố ắ i h n. N i ả ằ b ng DNA ligase c a phageT4. Trong thành ph n c a vector bi u hi n ph i có các promoter m nh giúp gen bi u hi n đ c trong vi khu n.

+ Thi

ể ệ ậ mã hoá cho các protein tín hi u giúp v n chuy n insulin

ế ế ế ra ngoài t ự t k các trình t ấ bào ch t.

ế ử ụ ư ế N u s d ng mRNA tách đ ượ ừ c t trên ti n hành nh sau:

+ Sao mRNA tinh khi

ờ ượ t thành DNA (cDNA) nh enzym phiên mã ng c và nh ờ

ế ả ứ các dNTP (trong ph n ng RT PCR).

ứ ạ ộ

ổ ợ ế ạ ẩ E.coli. ỉ + Cài đo n cDNA mã hoá insulin hoàn ch nh vào plasmit đ ng sau m t promoter h p vào vi khu n ạ m nh. Bi n n p vector tái t

ờ ươ ớ E.coli nh ph ộ ng pháp tr n v i dung

: Bi n n p plasmit tái t ặ ạ ỗ c 3ướ  B ị d ch ion Ca ế ạ + ho c t o l ổ ợ h p vào ệ xung đi n.

ế ổ ợ ạ Tách và bi n n p Plasmic tái t h p vào E.Coli

 B

ọ ế ổ ợ bào mang vector tái t h p. c 4ướ : Sàng l c các dòng t

ầ ế ượ ữ Sau quá trình bi n n p, c n ch n l c đ

ố ọ ọ ộ ẩ ấ

ạ ọ ọ ườ ặ c s d ng. Thông th

ụ ử ụ ọ ọ ể ề ằ

ổ ợ ự ủ ạ ớ nucleotic c a đo n gen cài vào vector tái t

c nh ng dòng vi khu n mang gen mong mu n. Qúa trình ch n l c ph thu c vào quy trình và gen đánh d u trên vector ể ượ ử ụ đ ng là s d ng kháng sinh Ampixilin ho c Tetraxilin đ ọ ọ ả i ch n l c. Sau đó ki m tra dòng ch n l c theo nhi u cách khác nhau b ng cách gi ự ạ h p và so sánh v i trình t đo n trình t g c. ố

 B

ấ ế ổ ợ ể ầ ả bào tái t h p đ thu s n ph m c 5ướ : Nuôi c y t

ẩ ể ượ ư ồ

ử ụ i u. S d ng các ph ụ ượ ổ ươ ể ả ả ự ấ c b sung đ đ m b o s tăng tr

ẩ ượ ẩ c đ a vào n i lên men. Nuôi chúng trong ng pháp nuôi c y liên ưở ng c nhân lên qua ệ i có hàng tri u vi khu đ

ố ẽ ư ậ ắ ờ ỉ Các vi khu n chuy n gen sau đó đ ề ớ ệ ố ư ồ các n i lên men v i các đi u ki n t ưỡ ấ ụ ng liên t c đ t c, theo đó các ch t dinh d ạ ứ ủ c a vi khu n theo hàm mũ. C 20 phút l ộ nguyên phân. Nh v y, ch sau m t th i gian ng n, sinh kh i s tăng

 B

ề ạ c 6ướ : Ti n tinh s ch

+ Sau khi lên men c n tách t

ầ ế ệ ử bào và kh trùng nhi t.

+ Dùng enzym lizozyme phá v màng t

ỡ ế ợ ấ ẩ ử ỗ bào, sau đó dùng h n h p ch t t y r a

ớ ể đ tách l p màng lipit.

+ Proinsulin đ

ượ ỡ ế ả ỏ ươ c tách ra kh i các m nh v t ằ bào b ng ph ng pháp li tâm và

 B

l c.ọ

ướ c 7: ạ Ho t hoá.

ệ ố ư ể ệ E.coli có kh năng bi u hi n gen insulin nh ng không có

ả ả + Do h th ng ạ kh năng ho t hoá insulin.

ạ ử ệ ằ ị

ặ ậ

ượ ẩ ầ ả ớ ạ + Ho t hoá proinsulin invitro b ng cách x lý dung d ch đ m, giúp nó đ t ắ ấ c u trúc b c 4, sau đó dùng enzym đ c hi u trypsin đ phân c t proinsulin. Khi đó s n ph m thu đ ể ệ ế ạ t. c m i có ho t tính c n thi

 B

ạ ỗ ợ ỉ c 8ướ : H n h p tinh s ch ch còn có insulin.

ươ ắ ươ ễ ắ ằ + B ng ph ng pháp s c ký, tách và ph ị ng pháp mi n d ch g n enzym.

+ Đ tinh s ch c a insulin đ ấ

ộ ủ ạ ượ ạ ỗ

ờ ủ c đánh giá qua m i giai đo n trung gian c a quá ượ ố c tinh

ể ệ ả trình s n xu t nh phòng thí nghi m chuyên hoá. Cu i cùng insulin đ th hoá.

ể Các tinh th insulin

b. Ph

ươ ổ ợ ỗ ng pháp 2: ẽ T ng h p riêng r hai chu i A và B.

ẽ ệ ả ệ ặ ấ ầ c vi c s n xu t enzim đ c hi u c n

+ thi

ươ ế ể ế ượ ng pháp này s tránh đ Ph t đ bi n proinsulin thành insulin.

ấ ả ỗ ị

ấ ầ ể ự ổ ợ ỏ ẻ ả + Nhà s n xu t c n hai gen nh đ s n xu t hai chu i A và B. Xác đ nh trình t DNA đ qua đó t ng h p và tách hai dòng gen này.

ượ ấ ươ ả ự c chèn vào plasmit. Sau đó s n xu t t ng t ư ả nh s n

ấ ỗ + M i DNA đ xu t proinsulin.

ố ỗ

ố ớ ộ c tr n v i nhau và hình thành c u n i ử ờ ộ ấ ị ấ ầ ượ + Cu i cùng hai chu i A và B đ ả ứ đisulfua qua ph n ng tái oxi hoá kh nh m t ch t oxi hoá nh t đ nh.

ả ấ ổ ợ ớ ỗ ỗ ệ S n xu t insulin tái t h p v i chu i A và chu i B riêng bi t

ổ ợ ỗ ẽ T ng h p riêng r hai chu i A và B.

c. Các ph

ươ ấ ả ng pháp s n xu t khác:

ươ ạ ộ

ự ủ ạ

ả ế : C i ti n ph insulin ổ i b ng cách thay đ i trình t ế ả ớ

ủ ứ ng th c ho t đ ng c a insulin trong c th acid amin c a nó và t o ra ch t t ễ ả ư ả ấ ơ ể ấ ươ ng ít k t dính v i nhau h n và khu ch tán vào máu d dàng ấ ươ nh quy trình s n xu t ơ cũng t ế ự ng t

ả + Gi ườ ằ ng ự t . Insulin gi ả ơ h n. Quy trình s n xu t Insulin gi insulin trên

̀ ́ ́ ̉ ̉ ̣ ̉

ươ + Ph ̀ ̃ ́ ̀ ph ng phap san xuât cua Tâp đoan Eli Lilly: ́ ̃ ươ ử ̉ ̣ ̣ ̣

̀ ̃ ̀ ̣ ̣

̀ ́ ơ ́ ́ ́ ̀ ̣ ̉ ̉

́ ́ ̀ ́ ươ ươ ươ ơ ̉ ̣ ̉ ̉ ̣

̃ ́ ́ ̃ ̀ ̀ ́ ươ ư ̉ ̣ ̣ ̣ ́ ng phap san xuât nay biêu hiên chuôi A va chuôi B riêng biêt băng cach s dung Escherichia ́ coli, sau đo thu chuôi A va chuôi B, trôn v i nhau in vitro tao câu nôi ́ ng phap nay co hiêu qua san xuât thâp. Do đo, Eli Lilly phat disulfur. Ph ng phap nay biêu hiên proinsulin triên môt ph ng phap cai tiên h n, ph ́ ̃ ́ ̀ ng phap cu, tao câu nôi thay vi biêu hiên chuôi A va B riêng biêt nh ph

̀ ̀ ́ ́ ̃ ̉

̀ ̀ ̣ disulfur in vitro, sau đo phân căt peptide C khoi hai chuôi A va B băng trypsin va carboxypeptidase, tao thanh insulin.

+ Ph

ả ươ ấ ủ ̣

̀ ̃ ng pháp s n xu t c a tâp đoan Novo Nordisk ̀ ̀ ươ ́ ơ ̉ ̣

̃ ́ ́ ượ ̉ ̣

ử ̀ ̀ ̀ ươ ̣

̀ ̀ ̀ ̀ ̉ ̣

́ ̀ ̣

ư ́ ̀ ́ ượ ̉ ̀ ́ ng phap nay : ph ̀ ́ biêu hiên miniproinsulin bao gôm chuôi B va chuôi A nôi v i nhau băng 2 ́ c biêu hiên trong nâm men, sau đo x ly miniproinsulin in acid amin, đ ̀ ́ ́ ̣ ợ ng phap nay co nhiêu thuân l vitro băng trypsin tao thanh insulin. Ph i ̀ ́ ̀ ́ ́ ượ nh câu nôi disulfur đ c hinh thanh trong qua trinh biêu hiên va qua trinh ̃ ́ ̀ tiêt miniproinsulin, va miniproinsulin nay đ c tach chiêt va tinh sach dê c tiêt thăng ra môi tr dang do đ ̀ ượ ̀ ́ ươ ng nuôi cây.

ủ ươ Trong ph ng pháp c a công ty BioTechnology General: ươ + Ph ̀ ̀ ợ ̣ ̣

́ ́ ̀ ượ ̉ ̣

̀ ́ ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉

́ ́ ̀ ượ ̉

́ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ơ ử ̀ ̀ ́ ơ ng phaṕ nay, môt dang protein dung h p (fusion protein) bao gôm superoxide ́ ơ c biêu hiên trong tê bao E.coli. dismutase (SOD) găn v i proinsulin đ ́ ̀ ́ Băng cach nay, hiêu suât cua qua trinh biêu hiên protein va hiêu qua cua qua ́ ̀ trinh hinh thanh cac câu nôii. Sau đo, proinsulin đ c chuyên thanh insulin ̀ nh x ly v i trypsin va carboxypeptidase B.

ế

ử ụ + S d ng t ọ ẻ ơ bào g c l y t

ế ọ ể ế ể ườ ố Các nhà ố ấ ừ máu ạ ng lo i 1 khôi

ủ ả ụ ả ố ấ ừ ố bào g c l y t máu trong dây r n tr s sinh: ỹ ể ử ụ khoa h c Anh và M cho bi t h có th s d ng t ẻ ơ ệ trong dây r n c a tr s sinh đ giúp b nh nhân ti u đ ơ ể ấ ph c kh năng s n xu t insulin trong c th .

ươ Ư ế ủ  u th c a ph ớ ng pháp m i

+ Insulin t o ra g n nh hoàn ch nh v i c u trúc Insulin

ớ ấ ư ạ ầ ỉ ở ườ ng i.

+ T o ra m t s l

ộ ố ượ ạ ắ ờ ộ ớ ng l n Insulin trong m t th i gian ng n.

+ Năng su t cao.

ấ

+ Ngu n nguyên li u d tìm ,không nguy h i đ n môi tr

ạ ế ệ ễ ồ ườ ng.

+ Trong quá trình tách chi

ế ễ ậ ẩ t: d thao tác kĩ thu t và chu n hóa trong phòng

thí nghi m. ệ

+ Ít t n kém chi phí.

+ Giá thành r .ẻ

III.

ố

Ư U VÀ NH Ủ ƯỢC ĐIỂM C A INSULIN:

ụ Insulin tác d ng nhanh

Ư ể u đi m:

+ Là lo i duy nh t dùng trong c p c u do tác d ng h đ

ấ ứ ạ ườ ụ ấ ế ng huy t nhanh

ạ chóng.

ể ộ ẫ ụ ề ầ ậ ớ ị + Có th tr n l n v i insulin ch m tùy theo m c đích và nhu c u đi u tr .

ụ ể ả ạ ờ ườ ế ắ + Có th i gian tác d ng ng n và m nh đ làm gi m đ ng huy t sau khi ăn.

b. Nh

ượ ể c đi m :

ề ầ ụ ả ắ

ể ề ị ướ i ả ế ợ không dùng riêng insulin tác d ng nhanh đ đi u tr mà ph i k t h p

ụ ặ ậ ậ ờ Th i gian tác d ng ng n nên ph i tiêm nhi u l n trong ngày (4 mũi tiêm d ụ ự ế da, th c t thêm insulin tác d ng bán ch m ho c ch m).

2. Insulin tác d ng bán ch m

ư ữ ụ ụ ị ậ (d ch tiêm đ c nh s a)

ả ớ ố ầ ườ ạ ả Đ làm gi m b t s l n tiêm trong ngày, ng

ể ụ ơ ồ

ạ ể ử ụ ế ộ ề ị ớ

ấ i ta đã s n xu t ra lo i insulin có tác d ng dài h n g m 2 lo i insulin là NPH (Neutral Protamine Hagedorn) hay IZS (Insulin Zinc Suspension) đ s d ng trong ch đ đi u tr v i 2 hay 3 mũi tiêm trong ngày.

ạ ớ ụ ề ờ u đi m: ụ ể insulin tác d ng trung bình có nhi u lo i v i th i gian tác d ng

ậ ợ ủ ệ ự ề ầ ộ ị Ư khác nhau tùy thu c vào yêu c u đi u tr và s thu n l i c a b nh nhân.

b. Nh

ượ ể ộ ớ c đi m ể : có th gây đau khi tr n v i insulin nhanh.

ộ ẵ ư ữ ụ ị 3. Insulin tr n s n (d ch tiêm đ c nh s a)

+ Có t

ộ ẫ ữ ạ ạ Là lo i insulin tr n l n gi a 2 lo i nhanh và trung bình theo t ỷ ệ l ấ ị nh t đ nh.

+ Có t

ỷ ệ l 30% insulin nhanh và 70% insulin trung bình.

ỷ ệ l ộ ữ ế ế 50% insulin nhanh và 50% insulin trung bình. Ngoài ra còn ti n ạ khác mà trong đó lo i nhanh chi m 10 20 ỷ ệ l

hành tr n theo nh ng t 40%.

ệ ợ ơ ỏ ả ự ộ tr n

ớ ể : ti n dùng, phù h p h n v i sinh lý mà không đòi h i ph i t u đi m ề ừ ạ ậ Ư ấ l y li u khi dùng riêng t ng lo i nhanh ch m.

b. Nh

ề ộ ỉ ỷ ệ l c đi m

ề ế ả

ừ ẽ ế ữ ộ ng huy t mu n. Trong khi l ỉ ra ch tăng t

ợ ể : vì t ượ ố ị pha tr n là c đ nh nên khó đi u ch nh cho phù h p ụ ể ố ớ ừ v i t ng tình hu ng c th : ăn b a no n u tăng li u c insulin nhanh và ơ ế ạ ườ ẽ ậ ch m s gây h đ 2 đ n 6 đ n ị ạ v lo i insulin nhanh.

4. Insulin tác d ng ch m (d ch tiêm đ c nh s a)

ư ữ ụ ụ ậ ị

ụ ả Ch c n m t mũi tiêm có tác d ng trong c 24 gi

ể u đi m: ể ộ ậ ữ trong ngày. Có ướ c các b a ăn

ủ ộ ờ ỉ ầ Ư ờ ỹ th dùng trong k thu t 4 mũi tiêm/ ngày, 3 mũi nhanh vào tr và m t mũi vào lúc đi ng (22 gi ).

b. Nh

ạ ườ ườ ướ ế ng huy t không l ể c đi m:

ị ỏ ồ c do ng tr ả ng không làm gi m

ườ ậ ớ ờ ấ ượ ơ B đ , đau n i tiêm. H đ ụ tác d ng kéo dài ch ng chéo v i các mũi tiêm khác. Th ượ ườ c đ đ ng máu sau ăn do th i gian h p thu vào máu ch m

[1] http://d.violet.vn/uploads/resources/562/1075370/preview.swf

[2] http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?

file=article&name=News&sid=1149

[3] http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=487936

[4] http://thuviensinhhoc.com/chuyendesinhhoc/congnghesinh

hoc/2659insulinvacongnghesanxuatinsulintrenthegioi

[5] http://vi.wikipedia.org/wiki/Insulin

Ả Ệ TÀI LI U THAM KH O