BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOXIN CỦA LOÀI Lactobacillus plantarum L24"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15

Thêm vào BST

Báo xấu

315
lượt xem 68
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo axitlactic. Vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi trong đời sống như chế biến thức ăn lên men, ủ chua thức ăn cho gia súc, sản xuất axitlactic và xử lý môi trường để tránh mùi hôi thối. Tuy nhiên vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh bacterioxin,

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOXIN CỦA LOÀI Lactobacillus plantarum L24"

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOXIN CỦA LOÀI Lactobacillus plantarum L24 Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội I. MỞ ĐẦU Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo axitlactic. Vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi trong đời sống như chế biến thức ăn lên men, ủ chua thức ăn cho gia súc, sản xuất axitlactic và xử lý môi trường để tránh mùi hôi thối. Tuy nhiên vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh bacterioxin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào
peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Vì vậy bacterioxin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, sữa tươi, nước giải khát cũng như trong xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi. Trong báo cáo này chúng tôi giới thiệu một chủng vi khuẩn lactic sinh bacterioxin mới phân lập tù nước dưa. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vi sinh vật. a. Chủng vi sinh vật được phân lập từ nước dưa và được giữ và bảo quản tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội. b. Môi trường MRS dùng trong nghiên cứu có thành phần sau (g/l): Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10, cao nấm men - 5, glucose -20. Tween 80, K2HPO4 - 2, Na- acetate - 5, (NH4)2 citrate - 2.00, MgSO4 . 7 H2O - 0.20, MnSO4 . H2O - 0.05, nước 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8. Khử trùng 121oC trong 15 phút.
c. Xác định hàm lượng bacterioxin theo phương pháp Brarford [1]. d. Xác định bacterioxin trên gel polyacrylamit (SDS- PAGE) theo phương pháp của Laemmli [4. 5]. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. a. Đặc điểm hình thái nuôi cấy Chủng vi khuẩn L24 phân lập từ nước dưa có khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào đều có dạng hình que, bắt màu Gram dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử, phản ứng catalaza âm tính, có khả năng đồng hoá cacbonhydrat amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, nhưng không sử dụng sorbitoi Căn cứ vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá, dựa theo khoá phân loại Bergey’s [5], chủng L24 được xác định thuộc chi Lactobacillus.
Hình 1. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic L24 chụp dưới kính hiển vi điển tử ở độ phóng đại x 20 000 lần b. Xác định thành phần của axit diaminopimelic (DAP) trong thành tếa bào của chủng vi khuẩn lactic L24 Các tác giả Schliifer và Kandlu [3] cho rằng đồng phân DAP có trong thành phần peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn Gram dương. đặc biệt đối với xạ khuẩn và vi khuẩn lactic. Để xác định đồng phân DAP của chủng L24 chúng tôi tiến hành lấy 50mg tế bào ướt cho vào ống thuỷ tinh nút xoáy (cỡ 3x100mm), thuỷ phân bằng 1ml 6N HCl trong nồi ổn nhiệt 100oC trong 16 giờ. Làm nguội dịch thuỷ phân tới nhiệt độ phòng. Dùng giấy sắc ký bản mỏng TLC để xác
định meso-DAP. Chấm chừng 3 l dung dịch lên giấy sắc ký bản mỏng TLC. Dùng 1l của 0,01M DL- diaminopimelic axit (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) làm dung dịch chuẩn. Đặt giấy sắc ký bản mỏng trong bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp methanol - nước - 6N HCl - pyridine (80:26:4:10, v/v) trong 3 giờ hoặc lâu hơn. Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (trong nước bão hoà n - butanol) lên giấy sắc ký bản mỏng, đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 100oC trong 5 phút). Vết meso-DAP tách rời, xuất hiện từ TLC như là các vết màu xanh đen. Hình 2. Kết quả xác định meso-DAP của chủng vi khuẩn lactic trên sắc ký bản mỏng
Chú thích: Chẩm 1 - meso-DAP chuẩn (Sigma) Chấm 4: Meso - DAP của chủng L24 Kết quả sắc ký cho thấy chủng L24 chứa meso-DAP và do đó vi khuẩn có thành tế bào thuộc nhóm IV. Dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và typ thành tế bào của chủng L24, đối chiếu với khoá phân loại của Ber’sgey có thể xác định chủng này thuộc chi Lactobacilus [2]. Việc đưa các chủng vi sinh vật sống vào môi trường là một việc làm hệ trọng, phải đảm bảo chắc chắn rằng chủng đó không gây hậu quả xấu đối với sức khoẻ con người và môi trường, do vậy chúng tôi tiến hành xác định trình tự rADN 16S để định danh chính xác đến loài. Sau khi tiến hành phản ứng PCR, trình tự rADN 16S được đọc trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant bằng đoạn mồi đặc hiệu. Trình tự đoạn gen được tổng hợp có chiều dài 645bp. Đây là đoạn ít bền vững so với trình tự đoạn rADN 16S của Lactobacillus plantarum, ký hiệu AL 935261 trong ngân hàng dữ liệu gen của Nhật Bản thì độ tương đồng lên đến
98%. Dưới đây là số liệu vế kết quả so sánh trình tự gen của sản phẩm đã được tổng hợp bằng phản ứng PCR với trình tự của đoạn gen trong ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản. Hình 3. Điện di sản phẩm PCR của chủng L24 trên gel agaroza 5%, được nhuộm bạc M - ADN chuẩn 1kb Ladder (10 000bp) Chú thích: Băng 1 biểu hiện đoạn được tổng hợp của chủng L24.
c. Xác định bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum L24 trên gel polyacrylamit 15%. Bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra là các phân tử protein
mang điện tích dương, kích thước nhỏ gồm 30 - 60 axit amin, có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh ra bacterioxin đó [4]. Bacterioxin có mặt trong tất cả các nhóm của vi khuẩn lactic như: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc và, Pediococcus,. Trong đó, hai nhóm chính là: Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò quan trọng. Theo hệ thống phân loại do Kleen - hammer, các bacterioxin được chia thành 4 nhóm, dựa trên trọng lượng phân tử, độ bền nhiệt, sự có mặt của các axit amino. Do đó, để xác định rõ Lactobacillus plantarum L24 chúng tôi nghiên cứu thuộc nhóm sinh bacterioxin nào. Chủng L24 được nuôi cấy tĩnh sau 24 giờ tiến hành phá vỡ tế bào và hạ pH xuống 2.5, để qua đêm ở 4oC. Sau đó chỉnh pH về 7,0 và đem tủa với aceton 100%, lạnh (giữ ở -22oC) với thể tích bằng thể tích mẫu. Ly tâm 10000vòng trong15 phút. Làm khô mẫu và hoà tan trở lại bằng dung dịch đệm l mẫu bacterioxin thô được tra vào mỗi giếng trên gelmSorensen pH = 7,0. Lấy 10 polyacrymit 15%. Chạy với cường độ
dòng điện 1,5A/giếng. Cuối cùng nhuộm bạc. Kết quả được trình bày ở hình 34 Hình 4. Điện di đồ gel polyacrylamit 15% Chú thích: Giếng 1 protein chuẩn 200 kDa (Sigma) Giếng 2 băng bacterioxin của Lactobacillus plantarum L24, trọnglượng phân tử 15kDa. Kết quả cho thấy trọng lượng phân tử của bacterioxin của Lactobacillus plantanrum L24 thuộc nhóm lớn, nhóm bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ từ 10 - 30kDa. d. Ảnh hưởng của nguồn nitơ (N) vô cơ đến khả năng
sinh trưởng và sinh tổng hợp bacterioxin của Lactobacillus plantarum L24 Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là muối amon còn muối nitrat là nguồn thức ăn không thích hợp đối với nhiều loại vi khuẩn. Hầu như các loại vi sinh vật đều có khả năng đồng hoá muối amôn. Đôi khi có loài không sử dụng được muối này thì nguyên nhân không phải do bản chất của NH4+ mà do sau khi đồng hoá gốc amôn, môi trường sẽ tích lũy các gốc anion vô cơ như SO4-, HPO42-, làm giảm pH của môi trường. Đối với vi khuẩn lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì quá trình sinh trưởng của chúng phụ thuộc rất nhiều vào pH. Lactobacillus plantarum L24 được tiến hành nuôi tĩnh ổn nhiệt trên môi trường dịch thể MRS, với tỷ lệ giống 0.5%, có bổ sung các nguồn nitơ vô cơ 0,1% khác nhau thời gian nuôi 48 giờ. Xác định khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacterioxin của Lactococcus plantarum L24. Kết quả trình bày trên hình 5.
Hình 5. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum L24 Một điều dễ nhận thấy khi bổ sung vào môi trường một lượng nitơ định trước đã có ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp bacterioxin của Lactobacillus plantarum L24. Rõ ràng là amoni photphat là nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất cho sinh tổng hợp bacterioxin của Lactobacillus plantarum L24. Nguyên nhân gây ra sự khác nhau này có
thể do gốc phọtphat có tính đệm cao và tính axit yếu nên không làm giảm pH của môi trường nhiều như các gốc khác. Trên các môi trường thường sử dụng nguồn nitơ vô cơ khác, sinh trưởng mật độ OD của tế bào đạt 2. 2 và sinh tổng hợp bacterioxin đạt là 52g/ml. Điều này rất thuận lợi khi bổ sung các chất khoáng khi nuôi cấy vi sinh vật. IV. KẾT LUẬN Chủng vi khuẩn lactic L24 có khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào đều có dạng hình que, bất màu Gram dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử, phản ứng catalaza âm tính Có khả năng đồng hoá cacbonhydrat đặc biệt là xyloza. Chủng L24 vừa có khả năng sinh axitlactic vừa có khả năng sinh bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10-30kDa. Các phân tích trình tự rADN 16S cho thấy chủng L24 là Lactobacillus plantarum. SUMMARY
STUDY ON BACTERIOCIN PRODUCTION OF NEWLY ISOLATEDSTRAIN Lactobacillus plantarum L24 Nguyen Thi Hoai Ha et al The strain of lactic acid bacteriocin L24 was isolated from fermented sour vegetables cell are rods, non sporing, non- notile, catalase negative. Metabolision was predominantly fermentative, lactic acid being formed from glucose homofermentatively, xylose was fermented. The analysis of 16S rDNA sequence shows that this strain L24 was identified as Lactobacillus plantarum. Bacteriocin II was produced. Antibacterial protein with molecular weigh 15kDa were detected by using gel electrothesis SDS-PAGE method. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Bradford, M. M. 1976. Arapid and Sensitive- Method for
the Quantitation of Laemmli, U. K.1970. Nature. Vol 227. 680-685. 2. Buchanan, R.E., and Gillons, N.E. Bergey s. Manual Determinative Bacteriology 8 Ed. William Wilkins Co., Baltimore, 1974. 3. Helo, H; Nilssen. O; 1991. Lactococcin A, new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris isolation and characterization of the protein and it’s gene. J. Bacteriol 173, 3879 – 3887. 4. Kelly, W. J. 1998. Charaterization of Lactococci isolated from minimally processed fresh fruits and vegetables. Int. J. Food Microbiol., 45. 85-92. 5. Yang, R, Johnson, M and Ray, B.1992. Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 38. 3355-3559