Các phương pháp tạo ADN tái tổ hợp
Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp
chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo
ra plasmid hở có hai đầu lệch nhau.
1. Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch
- Chọn và xử lí DNA plasmid:
Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp
chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo
ra plasmid hở có hai đầu lệch nhau.
- Chọn và xử lí đoạn cài:
DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng
nghiên cứu. Cắt DNA bằng enzyme RE loại II cùng loại với enzyme cắt
plasmid (EcoRI) để tạo ra các vết cắt giống nhau.
- Tạo plasmid tái tổ hợp:
Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài với plasmid với
sự có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp. Phản ứng nối
xảy ra theo sơ đồ được biểu diễn trên hình.
2. Phương pháp sử dụng đoạn nối (linker)
- Chọn và xử lí vector plasmid: (tương tự như trên)
- Chọn và xử lí đoạn cài:
Linker là những đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, được tổng hợp bằng
phương pháp hóa học, sao cho ở giữa mỗi linker phải có trình tự nhận biết
bởi một enzyme cắt hạn chế loại II. Ví dụ như EcoRI có chuỗi đích là
G/AATTC.
cDNA đầu bằng được tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo
cơ chế nuclease S1. Metyl hóa các vùng hạn chế có trong đoạn cDNA sợi đôi
được nhận biết bởi enzyme EcoRI.
Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA và enzyme DNA ligase để
tạo phân tử lai.
Cắt phân tử DNA lai bởi enzyme EcoRI, ta được phân tử lai có hai đầu lệch.
Phương pháp dùng đầu lệch
Dùng các đoạn nối linker tạo DNA tái tổ hợp
3. Tạo vector tái tổ hợp:
Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid
mà cũng được cắt bởi cùng một enzyme EcoRI. Nhờ tác dụng của enzyme
DNA ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành.
- Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT)
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng
gắn cùng một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử DNA.
Cách tạo DNA tái tổ hợp bằng phương pháp này được tiến hành theo 4 bước
sau:
- Bước 1:
Chọn và phân lập DNA lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có
chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI (G/GATCC).
Cắt plasmid bằng enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính.
Cắt DNA lạ bằng enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai
đầu lệch nhau.
- Bước 2:
Ủ DNA lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme
terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của DNA lạ.
Ủ plasmid với cùng một loại nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme
terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH) của plasmid hở.
- Bước 3:
Đưa DNA lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, các đầu
mút của homopolymer có trình tự bổ sung (---GGGG 3’/3’CCCC---) sẽ bắt
cặp với nhau.
- Bước 4:
Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào
chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung. Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester
và cuối cùng tạo được plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi
enzyme BamHI.
Ưu điểm của phương pháp là ghép DNA lạ đầu bằng vào plasmid để tạo
DNA tái tổ hợp và chế tác được DNA đầu lệch từ DNA đầu bằng.
