chương VIII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT – CÂY CHUYỂN GENE

Chia sẻ: Nguyễn Thị Phương Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

262
lượt xem 100
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

CHƢƠNG VIII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT – CÂY CHUYỂN GENE Kỹ thuật chuyển gene vào thực vật đã thành công ở nhiều loại cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, bông,... Nhiều gene lạ đã được phân lập từ vi sinh vật, động vật, thực vật hoặc có thể được tổng hợp nhân tạo và được đưa thành công vào cây trồng để tạo ra các giống cây trồng mới có năng suất và chất lượng tốt, có tính chống chịu tốt với sâu, bệnh hại và điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như mặn, hạn,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: chương VIII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT – CÂY CHUYỂN GENE

Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät CHƢƠNG VIII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT – CÂY CHUYỂN GENE Kỹ thuật chuyển gene vào thực vật đã thành công ở nhiều loại cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, bông,... Nhiều gene lạ đã được phân lập từ vi sinh vật, động vật, thực vật hoặc có thể được tổng hợp nhân tạo và được đưa thành công vào cây trồng để tạo ra các giống cây trồng mới có năng suất và chất lượng tốt, có tính chống chịu tốt với sâu, bệnh hại và điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như mặn, hạn, rét, ngập úng. Lợi ích mang lại do các cây trồng được chuyển gene rất to lớn, có thể giúp giải quyết vấn đề lương thực toàn cầu, đặc biệt ở các nước đông dân số và các nước có điều kiện khó khăn cho sản xuất nông nghiệp. 1. Phƣơng pháp chuyển gene trực tiếp 1.1. Phương pháp bắn gene (biolistic) Nguyên tắc của phương pháp này là dùng một lực vật lý để bắn các hạt kim loại (vàng, tungsten) được bao bởi các phân tử DNA vào bên trong tế bào. Các hạt kim loại được bắn với tốc độ lớn để có thể xuyên qua màng và vào bên trong tế bào. Hệ thống tạo lực đẩy dùng khí Helium (khí trơ),... Màng tế bào có tính đàn hồi hoàn hảo nên có thể tái tạo sau khi bắn. Các giai đoạn tiếp theo sự bắn DNA cho tới khi DNA tích hợp được vào bộ gene của cây vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Một phần lớn DNA bị hủy bởi enzyme nuclease của tế bào. Phương pháp này có ưu điểm là không dùng chuyên biệt cho một loài cây trồng nào, có thể sử dụng để chuyển gene với hiệu quả cao cho các đối tượng cây trồng một và hai lá mầm. 1.2. Phương pháp xung điện (electroporation) Nguyên tắc của phương pháp là cảm ứng một trạng thái thấm cao tạm thời của màng tế bào do xử lý một điện thế cao, nhờ vậy DNA có thể đi vào bên trong đến nhân tế bào và tạo sự chuyển gene. Cơ chế cảm ứng trạng thái thấm cao của màng chưa được hiểu đầy đủ. Phương pháp này tương đối đơn giản nhưng hiệu quả chuyển gene thấp do công đoạn chuẩn bị tế bào trần rất phức tạp. 1.3. Phương pháp dùng Polyethylene glycol (PEG) Dùng PEG để tạo ra các lỗ tạm thời – giúp DNA thấm vào bên trong tế bào. Khá nhiều dòng cây chuyển gene như thuốc lá, bắp cải, khoai tây, bắp,... đã được tạo ra nhờ phương pháp này.  73
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Tần số chuyển gene bằng phương pháp này không cao, ngoài ra PEG còn gây kết dính tế bào trần và có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào. 2. Phƣơng pháp chuyển gene gián tiếp Nguyên tắc của phương pháp này là đưa gene chuyển vào tế bào qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn sống lân cận hoặc ngay trên bộ rễ của nhiều cây. Chúng chui vào và sống ở các tế bào rễ bằng cách xuyên qua các vết thương trên mặt rễ. Với sự có mặt của chúng, tổ chức tế bào thực vật phát sinh bướu, bướu thường thấy trên cây hai lá mầm ở vị trí cổ rễ và gây hại cho cây trồng. Gene tạo bướu nằm trên đoạn T-DNA ở trong vi khuẩn và sự di chuyển của T-DNA vào tế bào thực vật chịu sự quy định của gene vir cũng ở trong vi khuẩn. Các gene nói trên nằm trên plasmid Ti. Hiện nay, trong lĩnh vực nghiên cứu chuyển gene vào cây trồng, gene tạo bướu được loại bỏ và thay vào đó là các gene hữu ích để tạo cho cây trồng mang các đặc tính tốt như kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ,... Quy trình tạo cây chuyển gene bằng phương pháp này gồm một số giai đoạn như sau: Chuẩn bị mô cây trồng và dịch huyền phù vi khuẩn - Nuôi chung mô với vi khuẩn (15 – 20 phút) - Vớt mô ra, thấm khô nhẹ dịch vi khuẩn thừa và nuôi chung mô với vi - khuẩn (2 ngày). Trong thời gian nuôi chung, vi khuẩn sẽ chuyển gene vào tế bào thực vật Rửa mô bằng dung dịch kháng sinh (cefatoxime hoặc carbenicillin) để loại - bỏ hết vi khuẩn bám vào mô Cấy chuyền mô sang môi trường có tác nhân chọn lọc để sàng lọc tế bào - chuyển gene (3 – 4 lần) Tái sinh cây chuyển gene từ mô kháng tác nhân chọn lọc - Do cấu trúc hai gene hữu ích và gene chọn lọc nằm kề nhau và cùng ở trên đoạn T-DNA nên cây chuyển gene ngoài đặc tính kháng tác nhân chọn lọc cũng mang gene hữu ích. Để chuyển gene vào cây hai lá mầm, phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp được dùng phổ biến nhất. Phương pháp này tỏ ra khá hiệu quả trong việc tạo cây chuyển gene. Trước đây, phương  74
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät pháp này ít hiệu quả đối với cây một lá mầm nhưng những năm gần đây đã có những tiến bộ. Sự gây vết thương được xem như là một yếu tố kích thích tạo các phân tử cảm ứng gene vir, cảm ứng sự tổng hợp DNA và phân chia tế bào. Vì vậy, các mô đang tăng trưởng mạnh và các hợp chất kích thích gene vir là yếu tố rất cần thiết. Mô thuốc lá bị thương sản xuất một số hợp chất phenol kích thích các gene vir ở plastid Ti. Hiện nay, khi nghiên cứu chuyển nạp gene vào cây trồng, nhất là cây một lá mầm, các nhà nghiên cứu thường sử dụng 4-acetyl-2,6-dimethoxyl- phenol với nồng độ từ 50 – 200 M. 3. Chuyển gene vào lục lạp tế bào Thông tin di truyền của thực vật hiện diện ở ba loại cơ quan tử khác nhau của tế bào: nhân, ty thể và lục lạp. Mỗi loại cơ quan tử chứa bộ gene riêng của nó. Di truyền gene lục lạp và ty thể không tuân theo quy luật Mendel. Bộ gene plastid của thực vật bậc cao là những phân tử DNA xoắn kép vòng có từ 120 – 160 kb (chứa khoảng 130 gene). Các bản sao của bộ gene hiện diện ở tất cả tế bào và ở các loại plastid khác nhau như tiền plastid chưa biệt hóa, lục lạp quang hợp, sắc lạp chứa carotenoid, bột lạp. Đặc tính nổi bật của bộ gene plastid là có mức bội thể rất cao: một tế bào đơn thuốc lá có thể chứa 100 lục lạp, mỗi lục lạp chứa khoảng 100 bản sao của bộ gene plastid, và như vậy có khoảng 10,000 bộ gene plastid / tế bào. Kết quả nghiên cứu di truyền gene lục lạp ở giai đoạn đầu trên đối tượng tảo xanh Chlamydomonas reinhardii và thuốc lá Nicotiana tabacum là tiền đề của các nghiên cứu ở lĩnh vực chuyển nạp gene vào lục lạp và điều này mở ra tiềm năng vô cùng lớn cho lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật trong tương lai. Hiện công nghệ chuyển gene vào lục lạp được thực hiện nhờ công cụ là súng bắn gene. Chuyển nạp gene vào lục lạp có nhiều ưu điểm nổi trội hơn so với chuyển nạp gene vào nhân như: - Số bản sao của gene chuyển rất cao, có thể lên đến 10,000 bản sao/tế bào. - Mức biểu hiện của gene chuyển rất cao, hàm lượng protein mục tiêu có thể lên đến 47% trên tổng số protein hòa tan. - Sự sắp xếp và sao chép của gene chuyển: nhiều gene có thể được tích hợp và biểu hiện theo kiểu sao chép đa cistron (polycistronic); ngược lại, đối với chuyển nạp gene vào nhân, mỗi gene chuyển tích hợp độc lập vào nhiễm sắc thể và có sao chép theo kiểu đơn cistron (monocistronic).  75
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät - Ảnh hưởng của hiệu ứng vị trí lên sự biểu hiện của gene chuyển: không có hiệu ứng của vị trí ở plastid. Ở trường hợp chuyển gene vào nhân, sự tích hợp ngẫu nhiên của gene chuyển ở nhiễm sắc thể thường dẫn đến sự hình thành các mức biểu hiện khác nhau. - Hiện tượng im lặng của gene: không ghi nhận được. Sự im lặng của gene chuyển thường làm giảm hoặc loại trừ sự biểu hiện gene chuyển ở trường hợp chuyển gene vào nhân. - Sự di truyền gene chuyển: có kiểu di truyền mẹ. Ở trường hợp chuyển gene vào nhân, có thể có sự giao phấn với các đối tượng khác. - Sự biểu hiện thì đồng nhất. Ở trường hợp chuyển gene vào nhân, sự biểu hiện của gene chuyển có sự biến thiên cao. 4. Nghiên cứu chuyển nạp gene ở cây lúa 4.1. Một số yếu tố quan trọng trong chuyển gene ở cây lúa Nhiều công bố khoa học đã đề cập một số yếu tố cần được quan tâm ở nghiên cứu chuyển gene vào cây lúa nhằm đạt tần số chuyển gene cao: Yếu tố chuyển gene của cây và khả năng đáp ứng của chúng trong nuôi - cấy in vitro. Yêu cầu mang tính bắt buộc là chỉ sử dụng mô và tế bào có khả năng sinh - phôi. Việc tạo tế bào huyền phù có khả năng sinh phôi để tách tế bào trần là yêu - cầu mang tính tuyệt đối khi sử dụng hệ thống tế bào trần làm chuyển gene. Thời gian chọn lọc càng ngắn càng cần thiết cho việc tái sinh cây không bị - biến dị cao. Cần sử dụng vector mang gene chuyển và promoter thích hợp. - Các nuôi cấy từ giai đoạn chọn lọc đến giai đoạn tái sinh cây cần được - kiểm soát hữu hiệu để tránh các trường hợp "escape". Trong hầu hết các trường hợp, phôi non mới tách từ cây trồng trong điều - kiện tối ưu là nguyên liệu tốt nhất. Mô sẹo vừa mới hình thành từ phôi non luôn có đáp ứng tốt với các thí - nghiệm chuyển gene và tái sinh cây. DNA plasmid cần có chất lượng cao và sử dụng với nồng độ tối thiểu. - Duy trì thời gian tối thiểu giai đoạn nuôi cấy chuyển gene trong phòng, - tránh nuôi cấy quá lâu.  76
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Trồng cây chuyển gene ở nhà lưới trong điều kiện tốt nhất để có được cây - sinh trưởng tốt và hữu thụ. 4.2. Vật liệu dùng để chuyển gene Sự thành công của nghiên cứu chuyển gene tùy thuộc rất nhiều vào vật liệu sử dụng để chuyển gene. Trước đây, khi một số kỹ thuật khác chưa phát triển trừ phương pháp sử dụng PEG và phương pháp điện xung thì vật liệu tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào sinh phôi được xem như là sự lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu về chuyển gene. Tuy nhiên, ở hệ thống này, sự nuôi cấy và chọn lọc cần nhiều thời gian và sự tái sinh tùy thuộc vào kiểu gene. Vì vậy, khi các phương pháp chuyển gene mới được xây dựng, nhiều loại vật liệu khác đã được sử dụng như tế bào huyền phù sinh phôi, mô sẹo, phôi trưởng thành và phôi nuôi cấy từ túi phấn. Ngoài các vật liệu nói trên, các mảnh mô phân sinh, phôi nảy mầm, mô gốc lá, rễ, mô phân sinh chồi, tế bào lớp mỏng phôi mang chồi và trục thượng diệp đã được sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện tạm thời và bền vững của gene chuyển. Sự chọn lựa vật liệu chuyển gene tùy thuộc vào sự thuận lợi trong thao tác nghiên cứu và hiệu quả tái sinh cây. 4.3. Môi trường nuôi cấy và chọn lọc tế bào chuyển gene Nhiều loại môi trường cơ bản đã được sử dụng để nuôi cấy mô tế bào lúa như môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), N6 (Chu et al., 1975), CC (Potrykus et al., 1979), AA (Muller và Grafe, 1978), R2 (Ohira et al., 1973). Môi trường chọn lọc phổ biến là môi trường MS và N6 có bổ sung một số chất chọn lọc thường dùng hiện nay là Kanamycin, Hygromycin, Phosphinothricin. Nồng độ chất chọn lọc tùy thuộc vào loại cây trồng. 4.4. Gene chỉ thị / chọn lọc và promoter Nhiều loại gene chỉ thị và chọn lọc khác nhau đã được nghiên cứu. Các loại gene này cũng được sử dụng để nghiên cứu hoạt động của các promoter. Các nghiên cứu sự biểu hiện tạm thời cho phép đánh giá hiệu quả hoạt động của gene chỉ thị trong vòng 24 – 48 giờ sau khi đưa DNA vào mô mà chưa cần sự thâm nhập của DNA vào bộ gene của cây, và vì vậy giúp đánh giá nhanh chóng và hiệu quả phương pháp chuyển. Gene chỉ thị lý tưởng là gene không gây hại trên trao đổi chất của cây, có thể dùng dễ dàng và nhạy với các thí nghiệm phát hiện. Gene mã hóa -glucuronidase (gene gusA) từ vi khuẩn E. Coli đã được dùng như gene chỉ thị phổ biến vì nó đáp ứng được các yêu cầu trên. Nó có ưu điểm hơn một số gene khác như gene cat (mã hóa cho Chloramphenicol acetyltransferase) và gene nptII (mã hóa cho Neomycin phosphotransferase) vì các thí nghiệm phát hiện cần nhiều thời gian và có sử dụng các chất đồng vị phóng xạ. Gần đây, gene tạo protein phát quang màu xanh lá có nguồn gốc từ sứa biển đã được sử dụng.  77
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Gene này hứa hẹn sẽ được dùng nhiều do việc kiểm tra đơn giản hơn so với gene gusA vì không cần hủy mẫu và không đòi hỏi cơ chất tác dụng. Hơn nữa, nó có thể được sử dụng để đánh giá sự biểu hiện in vivo, xác định các protein dung hợp, sự vận chuyển các protein nội bào và sự định vị các tế bào đặc biệt trong hệ thống đa bào. Gene tạo luciferase từ đom đóm cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gene lúa. Tuy nhiên, thiết bị phát hiện sự biểu hiện của gene này tương đối đắt tiền. Việc sử dụng gene chọn lọc cho phép cây chuyển gene sinh trưởng bình thường trên môi trường chọn lọc và loại bỏ những tế bào không chuyển gene. Các gene này có thể kể như gene kháng kháng sinh, kháng thuốc trừ cỏ,... Trước đây, gene nptII được dùng để chọn lọc cây chuyển gene kháng Kanamycin hoặc Geneticin. Tuy nhiên, việc chọn lọc tế bào chuyển gene kháng Kanamycin thường khó vì cây lúa có khả năng kháng cao đối với Kanamycin và cây lúa chuyển gene thường bất thụ hoặc thường bị bạch tạng khi sử dụng Geneticin để chọn lọc. Gene Dhfr (Dihydrofolate reductase) từ chuột liên quan đến tính kháng Methotrexate cũng đã được sử dụng để chuyển vào cây lúa. Gene hph từ vi khuẩn E. coli liên quan đến tính kháng Hygromycin B được xem là gene chọn lọc hiệu quả vì tế bào không chuyển gene tương đối mẫn cảm với Hygromycin B và nó thường không ức chế khả năng tái sinh cây. Hiện nay, gene bar phân lập từ Streptomyces hygroscopicus mã hóa enzyme Phosphinothricin acetyltransferase (PAT) liên quan đến tính kháng thuốc trừ cỏ Basta, Glufosinate, Bialaphos được dùng khá rộng rãi để chuyển vào cây lúa. Gene bar tạo cho cây kháng thuốc trừ cỏ - một đặc tính có ý nghĩa cho nông nghiệp và xem ra dễ được cộng đồng chấp nhận hơn gene kháng kháng sinh. Một số cố gắng nhằm xây dựng những kỹ thuật dùng các chất không độc như Mannose để chuyển gene. Thí nghiệm đồng chuyển nạp gene hữu dụng với gene chọn lọc là một tiếp cận của công nghệ di truyền. Các cây chuyển gene không mang gene chọn lọc (marker-free) đã nhận được bằng kỹ thuật tạo các vector mang hai đoạn T-DNA riêng biệt dùng cho thí nghiệm đồng chuyển nạp bằng vi khuẩn Agrobacterium. Sự phân ly của hai đoạn T-DNA sẽ tạo được cây chuyển gene không mang gene chọn lọc (Komari và cộng sự, 1996). Promoter – liên quan đến sự biểu hiện của gene chỉ thị hoặc gene chọn lọc hoặc gene hữu dụng là yếu tố rất quan trọng. Các promoter cấu trúc (constitutive) tạo sự biểu hiện ở hầu hết các loại mô, không lệ thuộc vào các tín hiệu phát triển và môi trường. Promoter CaMV 35S ở cây một lá mầm so với cây hai lá mầm (Schledzewski và cộng sự, 1994). Vì vậy, một số promoter từ gene tạo Actin lúa Act1 (McElroy và cộng sự, 1990), từ gene tạo Ubiquitin bắp Ubi1 (Christensen và cộng sự, 1992) và Emu từ bắp đã được nghiên cứu sử dụng. Các promoter này  78
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät mạnh và cho thấy hoạt tính làm biểu hiện gene gusA cao hơn nhiều lần ở cây một lá mầm so với CaMV35S (Schledzewski và cộng sự, 1994). Nhiều cấu trúc gene gusA với các promoter khác nhau đã được thiết kế bởi CAMBIA (McElroy và cộng sự, 1995). Li và cộng sự (1997) đã so sánh hiệu quả của một số promoter. Ở các thí nghiệm của họ, kết quả sự biểu hiện tạm thời với các promoter cấu trúc khác nhau cho thấy Ubi1 là mạnh nhất, kể đến là Act1, Emu và CaMV35S. Hiệu quả tương đối của các promoter khác nhau đối với gene bar hoặc gene hph và gene gusA đã được so sánh. Điểm lý thú là trật tự hoạt tính vẫn là Ubi1 > Emu > CaMV35S. Ngoài các promoter cấu trúc, một số promoter có liên quan đến sự biểu hiện ở mô đặc trưng (tissue-specific) và biểu hiện do cảm ứng (inducible promoter) đã được nghiên cứu. Sự biểu hiện rất cao các sản phẩm của gene chọn lọc có thể gây ra sự bảo vệ tương tác (cross protection) giữa các tế bào không chuyển gene và tế bào chuyển gene dẫn đến hiện tượng khảm. Vì vậy, việc dùng các promoter có hoạt tính thấp hoặc trung bình cho các gene chọn lọc cần được quan tâm nhiều hơn. Các nghiên cứu về công nghệ lắp ngược gene (antisense technology) để ức chế hoạt động của gene cũng đã góp phần xác định hiệu quả của các phương pháp chuyển gene và thử nghiệm các cấu trúc gene mới (McElroy và cộng sự, 1994). Ngoài ra, ảnh hưởng trên sự biểu hiện gene của một số yếu tố khác như các đoạn intron, các đoạn gây kích thích (enhancer) hoặc các đoạn 3’ (3’ sequence) cũng đã được nghiên cứu trong thời gian gần đây. 5. Môt số phƣơng pháp chuyển gene đã sử dụng đối với cây lúa 5.1. Phương pháp dùng Polyethylene glycol Phương pháp dùng PEG là phương pháp đầu tiên được dùng trong nghiên cứu chuyển gene. Phương pháp này có hiệu quả khi sử dụng tế bào trần tách từ huyền phù tế bào có khả năng sinh phôi. Toriyama và cộng sự (1988), Zhang và cộng sự (1988) là những tác giả đầu tiên công bố tạo được cây chuyển gene nhờ xử lý DNA với tế bào trần trong điều kiện có PEG – Zhang và cộng sự đã tái sinh cây mà không qua sự chọn lọc, ngược lại Toriyama và cộng sự đã chọn lọc mô sẹo kháng chất kháng sinh G418. Sự thâm nhập của gene gusA đã được kiểm tra bằng phương pháp lai Southern. Từ đó, nhiều kết quả tạo cây chuyển gene bằng phương pháp này đã được công bố. Tuy nhiên, việc tạo cây chuyển gene qua xử lý PEG thường chỉ thành công giới hạn đối với vài giống lúa japonica. Phương pháp này cũng được sử dụng đối với giống lúa indica. Datta và cộng sự (1990a), Peng và cộng sự (1992) đã tái sinh thành công cây lúa indica chuyển gene từ tế bào trần. Những cây lúa chuyển gene hữu thụ kháng Hygromycin, Kanamycin, kháng thuốc trừ cỏ và Sulfonylurea đã được tạo ra. Có sự di truyền theo quy luật Mendel của gene gusA, nptII và gene hph ở thế hệ sau, mặc dù trong một vài trường hợp có sự di truyền không theo quy luật Mendel. Tuy nhiên, phương pháp  79
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät này có một số hạn chế. Việc tạo quần thể tế bào sinh phôi ở giai đoạn đầu, việc duy trì khả năng tái sinh bình thường của các tế bào nuôi cấy trong thời gian dài là tương đối khó vì khả năng tái sinh giảm dần theo thời gian (Jahne và cộng sự, 1995). Hơn nữa, việc nuôi cấy và tái sinh cây từ tế bào trần thường không có hiệu quả cao, cần nhiều thời gian và tùy thuộc nhiều vào kiểu gene của cây. Đối với nhiều giống lúa indica, việc tái sinh cây từ tế bào trần thường rất khó và tỷ lệ cây tái sinh hữu thụ thường thấp. Chưa kể sự biến dị soma trong quần thể tế bào nuôi cấy dùng để tách tế bào trần dẫn đến sự biến dị ở cây chuyển gene. Mặc dù có các nhược điểm trên nhưng phương pháp này vẫn được sử dụng để tạo cây chuyển gene vì việc xử lý DNA tương đối đơn giản và đã có một số báo cáo về việc chuyển một số gene có ích vào cây lúa như gene kháng thuốc trừ cỏ, gene kháng nấm và gene kháng thuốc trừ sâu. 5.2. Phương pháp dùng xung điện Việc sử dụng phương pháp xung điện tỏ ra thích hợp và hiệu quả hơn phương pháp dùng PEG. Shimamoto (1989) là người đầu tiên nghiên cứu thành công việc tái sinh cây lúa hữu thụ bằng phương pháp này. Các gene gusA và hph đã di truyền ở các thế hệ sau. Sau đó, nhiều tác giả cũng đã tái sinh thành công cây lúa chuyển gene ở cả hai trường hợp lúa japonica và indica. Không có sự khác biệt về hình thái và kích thước hạt giữa cây chuyển gene và cây đối chứng. Tuy nhiên, tương tự như phương pháp dùng PEG, phương pháp này còn lệ thuộc vào nuôi cấy tế bào trần. Gần đây, một tiếp cận mới dùng xung điện để đưa DNA không vào tế bào trần mà dùng tế bào nguyên trạng (intact cell) cây ngũ cốc để nghiên cứu sự biểu hiện của gene gusA, thí dụ như dùng tế bào lá, phôi nảy mầm lúa indica. Một số dòng lúa indica chuyển gene từ xung điện phôi hạt trưởng thành tách rời và cây chuyển gene từ điện xung tế bào huyền phù đã được tạo ra. Sự di truyền của các gene nói trên đã được ghi nhận. Mặc dù có nhiều hạn chế, một số phòng thí nghiệm vẫn đang sử dụng phương pháp này để chuyển gene, nghiên cứu sự điều hòa biểu hiện gene và chuyển các yếu tố chuyển vị (transposable element). 5.3. Phương pháp bắn gene Phương pháp bắn gene sớm được sử dụng nhiều ngay sau khi ra đời để chuyển gene vào cây ngũ cốc bao gồm cây lúa. Phương pháp này dựa trên sự bắn các vi hạt (tungsten hoặc vàng) bọc DNA vào mô nhờ lực nén đẩy của không khí, khí hellium hoặc dòng điện. Christou và cộng sự (1991) là những tác giả đầu tiên nhận được cây chuyển gene từ phôi non của một số giống lúa trồng indica và japonica quan trọng qua sử dụng thiết bị bắn ACCELL. Sau đó, Cao và cộng sự (1992) thông báo việc tạo cây chuyển gene từ tế bào huyền phù nhờ thiết bị  80
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät PDS1000 / He BiolisticTM. Từ đó, phương pháp này được dùng phổ biến để tạo cây chuyển gene. Phương pháp này có thể được áp dụng trên bất cứ loại mô nào có khả năng tái sinh cây, không cần sử dụng tế bào trần và loại mô đã qua giai đoạn mô sẹo lâu dài do đó giảm thiểu được biến dị. Nhờ phương pháp này, hơn 40 giống lúa khác nhau đã được sử dụng để nghiên cứu chuyển gene – chứng tỏ phương pháp này có ưu điểm là không phụ thuộc vào kiểu gene cây. Ở một số trường hợp, tần số chuyển gene không thu kém trường hợp cây hai lá mầm.  81