Đánh giá khả năng đối kháng Proteus mirabilis gây thối nhũn hành lá (Allium fistulosum) của Bacillus spp.

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thối nhũn do vi khuẩn là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều loại cây trồng khác nhau. Bacillus spp. được báo cáo là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả trong kiểm soát nhiều mầm bệnh gây hại cây trồng. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ đất vùng rễ hành lá (Allium fistulosum) với hoạt tính đối kháng Proteus mirabilis SSR (chủng SSR) gây bệnh thối nhũn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đánh giá khả năng đối kháng Proteus mirabilis gây thối nhũn hành lá (Allium fistulosum) của Bacillus spp.

TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 ASSESSMENT OF ANTAGONISTIC ACTIVITY AGAINST Proteus mirabilis CAUSING SOFT ROT DISEASE ON GREEN ONION (Allium fistulosum) OF Bacillus spp. Nguyen Thi Lien*, Phan Ngoc Nhu Ngoc, Ngo Thi Huynh My, Le Tuan Tuong, Nguyen Thanh Thao, Nguyen Tang Phu Institute of Food and Biotechnology – Can Tho University ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 01/10/2024 Bacterial soft rot can cause serious damage in various crops. Bacillus spp. had been reported as effective biological control agents in Revised: 17/12/2024 controlling many phytopathogens. This study aimed to isolate and Published: 18/12/2024 select Bacillus spp. strains from green onion (Allium fistulosum) rhizosphere soil with antagonistic activity against Proteus mirabilis KEYWORDS SSR (strain SSR) causing. A total of 25/45 Bacillus isolates showed antagonistic activity against SSR strain in co-culture test in liquid Antagonistic ability medium. Most of the antagonistic bacterial isolates were capable of Green onion producing siderophore. Regarding the ability to produce hydrolytic enzymes, the number of isolates capable of producing protease and Proteus mirabilis esterase were 15 and 7, respectively. The potential antagonistic isolate Rhizobacteria DT2 was identified as Bacillus thuringiensis through the results of 16S Soft rot rRNA gene sequencing and biochemical characteristics. This study indicated the potential of Bacillus spp. in controlling soft rot of green onion caused by P. mirabilis. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG Proteus mirabilis GÂY THỐI NHŨN HÀNH LÁ (Allium fistulosum) CỦA Bacillus spp. Nguyễn Thị Liên*, Phan Ngọc Như Ngọc, Ngô Thị Huỳnh My, Lê Tuấn Tường, Nguyễn Thanh Thảo, Nguyễn Tăng Phú Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm – ĐH Cần Thơ THÔNG TIN BÀI BÁO TÓM TẮT Ngày nhận bài: 01/10/2024 Thối nhũn do vi khuẩn là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều loại cây trồng khác nhau. Bacillus spp. được báo cáo là tác nhân kiểm Ngày hoàn thiện: 17/12/2024 soát sinh học hiệu quả trong kiểm soát nhiều mầm bệnh gây hại cây Ngày đăng: 18/12/2024 trồng. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ đất vùng rễ hành lá TỪ KHÓA (Allium fistulosum) với hoạt tính đối kháng Proteus mirabilis SSR (chủng SSR) gây bệnh thối nhũn. Tổng số 25/45 chủng Bacillus phân Hành lá lập cho thấy hoạt tính đối kháng chủng SSR trong thử nghiệm đồng Khả năng đối kháng nuôi cấy trong môi trường lỏng. Hầu hết các chủng vi khuẩn thể hiện Proteus mirabilis khả năng đối kháng đều có khả năng sinh ra siderophore. Đối với khả năng sản sinh enzyme ly giải, số chủng vi khuẩn thử nghiệm có khả Thối nhũn năng sinh protease và esterase lần lượt là 15 và 7. Chủng vi khuẩn Vi khuẩn vùng rễ DT2 được xác định là Bacillus thuringiensis thông qua kết quả giải trình tự vùng gen 16S rRNA và các đặc điểm sinh hoá. Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng của Bacillus spp. trong phòng trừ vi khuẩn P. mirabilis gây thối nhũn hành lá. DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.11214 * Corresponding author. Email: ntlien@ctu.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 11 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 1. Giới thiệu Hành lá được trồng phổ biến ở Việt Nam và thường được dùng như một loại rau gia vị. Hành lá có giá trị dinh dưỡng cao và đem lại hiệu quả kinh tế cho người nông dân [1]. Hành lá có thể được tiêu thụ trong nước và đặc biệt có tiềm năng xuất khẩu [1]. Tuy nhiên, trong quá trình canh tác cây hành thường bị tấn công bởi nhiều mầm bệnh khác nhau. Bệnh thối ướt do vi khuẩn gây ra nhiều thiệt hại lớn trong quá trình canh tác và bảo quản sau thu hoạch các loại hành khác nhau. Các vi khuẩn là tác nhân gây thối ướt hành được ghi nhận thuộc các chi/loài như Pectobacterium spp. (còn được gọi là Erwinia spp.) [2], Burkholderia spp. [2], Pseudomonas aeruginosa [3] và họ vi khuẩn Enterobacteriaceae [4]. Thuốc hoá học đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh hại thực vật [5]. Tuy nhiên, với tình hình biến đổi khí hậu ngày càng gia tăng và sự phụ thuộc quá mức vào thuốc hoá học đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc ở nhiều mầm bệnh [5]. Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng cây trồng (plant growth promoting rhizobacteria – PGPR) giúp tối ưu sự hấp thu dinh dưỡng của cây, tăng cường sức chống chịu với các điều kiện môi trường khắc nghiệt [6]. Đồng thời, PGPR có thể hoạt động như tác nhân kiểm soát sinh học giúp cây chống lại sự tấn công của các mầm bệnh thông qua các cơ chế trực tiếp (như sản sinh các hợp chất kháng sinh, enzyme thuỷ phân) hoặc qua cơ chế gián tiếp (kích thích tính kháng bệnh ở cây trồng) [6]. Nhiều loài thuộc chi Bacillus được ghi nhận về khả năng sản sinh nhiều hợp chất kháng khuẩn như peptide kháng sinh, lipopeptide, bacteriocin với phổ ức chế rộng giúp kiểm soát nhiều mầm bệnh [7]. Hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus spp. đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu giúp chống lại các vi khuẩn gây bệnh ở cây trồng như Ralstonia solanacearum [8], Xanthomonas campestris pv. campestris [9], Pectobacterium caratovum [10]. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn được các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng với vi khuẩn Proteus mirabilis gây thối ướt hành lá. Các chủng vi khuẩn tiềm năng có thể sử dụng như vật liệu cho các nghiên cứu phòng trừ bệnh thối nhũn hành lá trong điều kiện thực tế. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Chủng vi khuẩn Proteus mirabilis SSR được phân lập từ mẫu hành lá biểu hiện triệu chứng thối ướt. Chủng vi khuẩn SSR cho thấy triệu chứng bệnh thối ướt trên cây hành lá khi tiến hành xử lý chủng bệnh nhân tạo. Chủng vi khuẩn SSR được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh, Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ. 2.2. Phân lập vi khuẩn và khảo sát khả năng đối kháng với chủng SSR 2.2.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất vùng rễ Thu thập mẫu đất: Mẫu đất vùng rễ hành lá được thu thập tại các ruộng trồng hành tại An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Vĩnh Long. Tại các ruộng hành, các vị trí cây hành phát triển khoẻ mạnh, không biểu hiện triệu chứng bệnh được chọn để thu mẫu đất. Tại vị trí thu mẫu, dùng dao nhỏ xới quanh bụi hành và nhổ lấy cây hành với phần rễ có đất bao quanh. Phần rễ cây hành được cho vào các túi nylon vô trùng, ghi nhận thông tin và vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm. Phân lập vi khuẩn: Các cây hành thu thập được lắc nhẹ để đất rơi khỏi gốc hành. Các mẫu đất thu thập (10 g) được cho vào 90 mL dung dịch NaCl 0,85% vô trùng, khuấy đều và để lắng ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Phần dịch trong sau lắng (2 mL) được ủ ở nhiệt độ 80°C trong 10 phút trên máy ủ nhiệt, sau đó để nguội [11]. Các mẫu sau khi xử lý nhiệt được pha loãng đến nồng độ 10-4 bằng dung dịch NaCl 0,85% vô trùng. Các nồng độ pha loãng (100 µL) được trải lên các đĩa Petri chứa môi trường Luria Bertani agar (LB agar) (g/L: tryptone 10; cao chiết nấm men 5; NaCl 10; agar 15). Sau 72 giờ ủ ở 30°C, các khuẩn lạc có đặc điểm khác nhau được chọn và cấy chuyển nhiều lần trên môi trường LB agar đến khi các khuẩn lạc phát triển có đặc điểm đồng nhất. Các chủng vi khuẩn phân lập được nhuộm Gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase. Theo mô tả của http://jst.tnu.edu.vn 12 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 Holt [12] vi khuẩn Bacillus có tế bào hình que, Gram dương, có khả năng sản sinh nội bào tử, catalase dương tính, kỵ khí tuỳ nghi. 2.2.2. Khảo sát khả năng đối kháng với chủng SSR của các chủng Bacillus spp. phân lập Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn SSR và vi khuẩn Bacillus spp.: Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trên môi trường LB agar trong 24 giờ. Dùng kim cấy đầu tròn lấy một vòng đầy sinh khối của vi khuẩn chuyển vào ống nghiệm thủy tinh có nắp chứa sẵn 10 mL dung dịch NaCl 0,85% vô trùng. Dịch huyền phù các chủng vi khuẩn thử nghiệm được điều chỉnh về giá trị độ truyền quang ở bước sóng 600 nm (OD600) bằng 0,1. Khảo sát khả năng đối kháng: Huyền phù vi khuẩn SSR (50 µL) và huyền phù vi khuẩn Bacillus (50 µL) được thêm vào các falcon chứa 10 mL môi trường LB lỏng. Đối chứng được bố trí với huyền phù vi khuẩn SSR (50 µL) và 5 mL môi trường LB lỏng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần tương ứng với 3 ống. Các ống được ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trên máy lắc với tốc độ 120 rpm. Sau đó, mật số vi khuẩn SSR ở các nghiệm thức được xác định bằng phương pháp nhỏ giọt mô tả bởi Naghili [13]. Dịch vi khuẩn ở các nghiệm thức khảo sát được pha loãng đến nồng độ 10- 8 với dung dịch NaCl 0,85% vô trùng. Các nồng độ pha loãng (10 µL) được nhỏ giọt lên đĩa môi trường MacConkey agar nhằm ức chế sự phát triển của vi khuẩn Bacillus [14]. Các đĩa được giữ cố định đến khi giọt vi khuẩn khô hoàn toàn và ủ ở 30°C trong 17-20 giờ. Các nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 3-30 khuẩn lạc/giọt được chọn để tính mật số chủng vi khuẩn SSR trong mẫu ban đầu [13]. Mật số vi khuẩn (CFU/mL) = Trung bình số khuẩn lạc của ít nhất 3 giọt × Hệ số pha loãng của nồng độ thoả điều kiện × 100 (1) Hoạt tính đối kháng với chủng SSR của các chủng Bacillus spp. được thể hiện dưới dạng phần trăm ức chế sự phát triển của chủng SSR. 𝐷−𝑑 Phần trăm ức chế sự phát triển của chủng SSR (%) = ( 𝐷 ) × 100 (2) D: Mật số chủng SSR ở nghiệm thức ủ chung với vi khuẩn Bacillus; d: Mật số chủng SSR ở nghiệm thức đối chứng. 2.3. Khảo sát khả năng sản sinh protease, lipase và siderophore 2.3.1. Enzyme protease Huyền phù Bacillus spp. (3 µL) được nhỏ giọt trên môi trường bổ sung sữa gầy (g/L: sữa gầy 28; casein hydrolysate 5; dextrose 1; yeast extract 2,5; agar 20) [15]. Các đĩa được giữ cố định đến khi khô giọt vi khuẩn, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau khi ủ, xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng phân giải chỉ ra khả năng sản sinh protease của các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Chỉ số hoạt động enzyme (EI) = Đường kính vùng phân giải/Đường kính khuẩn lạc [16]. 2.3.2. Enzyme esterase Huyền phù Bacillus spp. (3 µL) được nhỏ giọt trên môi trường bổ sung Tween 20 (g/L: peptone 10, NaCl 5; CaCl2.2H2O 0,1; Tween 80 10 mL; agar 20) [17]. Các đĩa được giữ cố định đến khi khô giọt vi khuẩn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Sau khi ủ, xung quanh khuẩn lạc xuất hiện các hạt kết tủa cho thấy hoạt động của esterase sinh ra bởi các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Chỉ số hoạt động enzyme (EI) = Đường kính vùng phân giải/Đường kính khuẩn lạc [16]. 2.3.3. Siderophore Huyền phù các chủng Bacillus spp. (100 µL) được thêm vào 10 mL LB lỏng và ủ trên máy lắc ở 30°C với tốc độ lắc 120 vòng/phút trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy các chủng Bacillus spp. thử nghiệm (2 mL) được tiến hành thu phần dịch nổi bằng cách ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi sau ly tâm (1 mL) được trộn đều với 1 mL thuốc thử chrome azurol S (CAS) [18]. Sau khi ủ ở điều kiện tối trong 20 phút, độ hấp thụ quang của hỗn hợp được xác định ở bước sóng 630 http://jst.tnu.edu.vn 13 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 nm. Khả năng sản sinh siderophore của các chủng Bacillus spp. thử nghiệm được tính toán theo công thức: (Ar−As)×100 Phần trăm sản sinh siderophore (%) = Ar (3) Trong đó: Ar: độ hấp thụ quang của đối chứng (thuốc thử CAS + LB lỏng) As: độ hấp thụ quang của hỗn hợp mẫu (thuốc thử CAS + dịch nổi sau ly tâm) 2.4. Định danh chủng vi khuẩn đối kháng Chủng Bacillus spp. DT2 với hoạt tính đối kháng cao, có khả năng sản sinh protease, esterase và siderophore được tiến hành giải trình tự vùng 16S rRNA. DNA tổng số của chủng DT2 được ly trích theo mô tả của Chen và Kuo [19]. Vùng gen 16S rRNA của chủng DT2 được khuếch đại với cặp mồi 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1492R (5′-GGCTACCTTGTTACGTA- 3′) [20]. Phản ứng PCR được thực hiện với máy MultiGene Optimax Thermal Cycler, với chu kỳ nhiệt như sau: 5 phút ở 94°C, 35 chu kỳ với 1 phút ở 94°C, 1 phút 58°C, 2 phút ở 72°C và bước cuối cùng 10 phút ở 72°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,5%. Sản phẩm PCR vùng 16S rRNA của chủng DT2 được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại Công ty TNHH DNA sequencing. Trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng DT2 được sử dụng để xây dựng cây phân loại sử dụng Neighbor-joining methods với thuật toán Jukes-Cantor model với độ lặp lại 2000 lần với phần mềm Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA) version 6.0.6. Bên cạnh đó, chủng DT2 được nhuộm với thuốc nhuộm coomassie brilliant blue G-250 theo mô tả của Ammons [21] để xác định khả năng sản sinh các thể protein độc như tinh thể protein (crystal protein), thể ký sinh (parasporal body) của loài Bacillus thuringiensis. 2.5. Phương pháp phân tích kết quả Các số liệu hoạt tính đối kháng, chỉ số hoạt động enzyme và phần trăm sản sinh siderophore được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 và phân tích thống kê bằng phương pháp phân tích phương sai One-way ANOVA với phần mềm Minitab 16. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả phân lập và khảo sát hoạt tính đối kháng với vi khuẩn P. mirabilis Tổng số 45 chủng vi khuẩn được phân lập từ 10 mẫu đất vi khuẩn vùng rễ hành lá. Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập đều có tế bào hình que, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (hình 1a) và có khả năng sản sinh nội bào tử (hình 1b). Đồng thời các chủng vi khuẩn phân lập phát triển được ở điều kiện hiếu khí, nên có thể loại trừ khả năng thuộc chi Clostridium (có khả năng sinh bào tử nhưng chỉ phát triển ở điều kiện kỵ khí bắt buộc). Đặc điểm của các chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập trùng khớp với các mô tả của Holt [12] về chi Bacillus. Vùng rễ hành được ghi nhận có sự hiện diện của nhiều ngành vi sinh vật khác nhau Elusimicrobiota, Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Fusobacteriota, Desulfobacterota, Bacteroidota và các nhóm khác [22]. Bacillus thuộc ngành Firmicutes là một trong những ngành hiện diện phổ biến ở vùng rễ hành. Hình 1. Kết quả nhận diện đặc điểm của các chủng Bacillus spp. phân lập: (a) Nhuộm Gram, (b) Nhuộm bào tử (mũi tên đơn: tế bào sinh dưỡng, mũi tên kép: bào tử) và (c) Thử nghiệm catalase http://jst.tnu.edu.vn 14 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 Trong 45 chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm, 25 chủng vi khuẩn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với chủng P. mirabilis SSR. Phần trăm ức chế sự phát triển của chủng SSR bởi các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng dao động từ 7,36-100%. Sáu chủng vi khuẩn DT2, VL10, VL13, VL15, VL16, VL23 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao, với sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với nhau (hình 2b). Mật số chủng vi khuẩn SSR ở nghiệm thức đồng nuôi cấy mầm bệnh và Bacillus đối kháng thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (hình 2a). Cả mầm bệnh và vi khuẩn được cung cấp một lượng môi trường tương đương nhau, do đó mật số mầm bệnh giảm không do sự thiếu hụt dinh dưỡng khi đồng nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn mà do hoạt tính đối kháng của Bacillus. Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus có thể do khả năng tăng mật số nhanh chóng dẫn đến cạnh tranh không gian và dinh dưỡng với mầm bệnh, hoặc khả năng sinh ra các enzyme thuỷ phân, siderophore hay kháng sinh nhằm tiêu diệt/ức chế sự phát triển của mầm bệnh. Khả năng đối kháng của Bacillus với vi khuẩn gây hại cây trồng đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu. B. velezensis CE100 có khả năng làm giảm tỷ lệ tăng sinh của Pectobacterium carotovorum ở giai đoạn sớm và ở thời gian dài hơn vi khuẩn gây bệnh mất khả năng sống sót [10]. Trong một nghiên cứu khác, Bacillus velezensis F18, HC-5, L73 phân lập từ đất vùng rễ gừng cho thấy khả năng đối kháng mạnh với Ralstonia solanacearum [8]. Các chủng vi khuẩn này mang các đặc điểm kích thích sinh trưởng cây trồng như hoà tan phosphate, kali, tổng hợp IAA và đối kháng với mầm bệnh như tổng hợp siderophore, mang gen sinh tổng hợp dipeptide, bacilysin, polyketide macrolactin, bacillaene, difficidin [8]. Bacillus amyloliquefaciens SS-12.6 và SS38.4 được báo cáo có khả năng đối kháng với nhiều loài vi khuẩn gây hại trên khoai tây, các cơ chế đối kháng được xác định chủ yếu do hoạt động của lipopeptide [23]. Hình 2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế P. mirabilis của các chủng Bacillus phân lập: (a) Kiểm tra mật số chủng SSR ở nghiệm thức đồng nuôi cấy với chủng CT2 và (b) Kết quả phần trăm ức chế sự phát triển của chủng SSR bởi các chủng Bacillus spp. 3.2. Kết quả khảo sát khả năng sản sinh enzyme thuỷ phân và siderophore của các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng Trong số 25 chủng Bacillus thử nghiệm có 13 chủng có khả năng sản sinh protease (hình 3a). Các chủng DT2, DT4 và VL16 cho thấy chỉ số hoạt động protease cao nhất, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhau (bảng 1). Protease sản sinh bởi Bacillus siamensis CSB55 phân lập từ kim chi có khả năng thâm nhập vào màng tế bào vi khuẩn và dẫn đến phá vỡ màng tế bào [24]. Màng tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào vi khuẩn, protease sản sinh bởi các chủng Bacillus đối kháng có thể dẫn đến việc suy yếu tính toàn vẹn của màng tế bào mầm bệnh, từ đó mầm bệnh bị ức chế. Khả năng sản sinh esterase được ghi nhận ở 7/25 chủng Bacillus với khả năng đối kháng (hình 3b). Trong đó, chủng AG5 cho kết quả chỉ số hoạt động esterase cao nhất, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các chủng còn lại (bảng 1). Nhóm enzyme thuỷ phân liên kết este như lipase, esterase có thể tác động đến lipoprotein, lipopolysaccharide và phospholipid bao quanh lớp http://jst.tnu.edu.vn 15 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 peptidoglycan dẫn đến thủy phân lớp kép lipid [25]. Hoạt động phân giải lớp kép phospholipid gây suy yếu màng tế bào, gây rò rỉ nguyên sinh chất, do đó ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Hầu hết các chủng vi khuẩn khảo sát (ngoại trừ chủng CT5) đều có khả năng sản sinh siderophore (hình 3c). Phần trăm sản sinh siderophore bởi các chủng vi khuẩn thử nghiệm dao động từ 3,5-82,0%. Chủng CT6 thể hiện khả năng sản sinh siderophore cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tất cả các chủng còn lại (bảng 1). Theo báo cáo của Shao [26], siderophore đóng vai trò quan trọng trong khả năng ức chế R. solanacearum gây hại trên cà chua của Pseudomonas spp. Các PGPR tổng hợp siderophore có ái lực cao với sắt, các phân tử giàu sắt được PGPR hấp thu hoặc cung cấp cho cây chủ. Do đó, cây trồng có thể sử dụng sắt hiệu quả hơn và mầm bệnh bị ngăn chặn do sự cạn kiệt sắt trong môi trường [27]. Phần lớn các chủng Bacillus đối kháng với chủng SSR có khả năng sản sinh siderophore mạnh, do đó cho thấy khả năng sản sinh siderophore là một cơ chế quan trọng giúp các chủng Bacillus ức chế P. mirabilis gây hại trên hành. Bảng 1. Hoạt tính enzyme thuỷ phân và khả năng sinh siderophore của các chủng Bacillus spp. Chủng Bacillus EI protease EI esterase Phần trăm sản sinh siderophore (%) AG5 0,28d-f 1,46a 20,3f-k g e AG8 0 0 45,3b ef b AG9 0,24 1,24 17,3i-l c-e e AG12 0,42 0 3,5mn g e AG31 0 0 40,4bc CT1 0g 0e 4,5mn CT2 0,29d-f 0e 11,1 CT3 0g 0e 13,2 CT4 0g 0e 8,0mn CT5 0g 0e 0n c-e e CT6 0,44 0 82,0a ef e CT7 0,24 0 12,1j-m ab d DT2 0,82 0,52 28,4d-g DT4 0,91a 0e 18,7h-k DT7 0,38d-f 0e 23,2e-i g e VL2 0 0 6,9m-n g c VL10 0 0,68 33,1cd f c VL12 0,21 0,81 31,9c-e g d VL13 0 0,47 24,6d-i bc e VL15 0,62 0 29,7d-f ab e VL16 0,71 0 27,9d-h VL19 0g 0e 23,5e-i VL21 0g 0e 20,9f-j g e VL22 0 0 20,0g-k cd b VL23 0,45 1,22 25,3d-i Ghi chú: Các giá trị với chữ cái theo sau giống nhau có sự khác khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% theo phép kiểm định Tukey. Hình 3. Kết quả kiểm tra hoạt tính protease (a), esterase (b) và siderophore (c) của một số chủng Bacillus spp. http://jst.tnu.edu.vn 16 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 3.3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn tiềm năng DT2 Số lượng nucleotide phân tích được của trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng DT2 là 1.157 khi sử dụng phần mềm BioEdit. Trình tự vùng 16S của chủng DT2 cho thấy chủng DT2 có độ tương đồng cao với các loài vi khuẩn Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus paramycoides, Bacillus subtilis và Bacillus thuringiensis khi so sánh với ngân hàng dữ liệu của NCBI. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phần mềm MEGA cho thấy chủng DT2 thuộc cùng nhóm với loài B. thuringiensis (Hình 4a). Kết quả nhuộm với thuốc nhuộm coomassive brilliant blue cho thấy chủng DT2 có sự hiện hiện của các thể ký sinh bắt màu đậm với thuốc nhuộm (Hình 4b), tương đồng với đặc điểm của B. thuringiensis. (a) (b) 10 Hình 4. Cây phát sinh chủng loại của chủng DT2 và các loài có quan hệ gần (a) và kết quả nhuộm tinh thể độc của DT2 (mũi tên đơn: bào tử, mũi tên kép: thể ký sinh) (b) 4. Kết luận Vi khuẩn Bacillus spp. phân lập từ đất vùng rễ hành lá có khả năng đối kháng mạnh với P. mirabilis gây bệnh thối nhũn. Khả năng sản sinh siderophore đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus spp. phân lập. Khả năng sản sinh các enzyme thuỷ phân (protease và esterase) có thể tăng hiệu quả ức chế mầm bệnh của vi khuẩn Bacillus. B. thuringiensis DT2 có thể sử dụng như vật liệu cho các nghiên cứu trong tương lai về phòng trừ bệnh thối nhũn hành lá. Lời cảm ơn Trân trọng cảm ơn Trường Đại học Cần Thơ đã tài trợ một phần kinh phí thực hiện đề tài (TSV2024-220). TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] M. C. Hoang and T. H. Ngo, “Selection and development of Korean welsh onion varieties in Northern Vietnam,” Journal of Vietnam Agricutural Science and Technology, vol. 12, no. 85, pp. 22-26, 2017. [2] F. A. Mansour, M. E. Abdallah, S. A. Haroun, A. A. Gomaa, and H. H. Badr., “Occurrence and prevalence of the bacterial onion bulb rot pathogens in Egyp,” Journal of Plant Protection and Pathology, Mansoura University, vol. 2, no. 2, pp. 239-247, 2011. [3] M. H. Abd-Alla, S. R. Bashandy, S. Ratering, and S. Schnell, “First report of soft rot of onion bulbs in storage caused by Pseudomonas aeruginosa in Egypt,” Journal of Plant Interactions, vol. 6, no. 4, pp. 229-238, 2011. [4] M. Ashrafi, M. A. Mirhabibi, N. F. Charkhabi, A. Ravanlou, T. Allahverdipour, and S. N. Zarhgani, “Proteus mirabilis and Klebsiella variicola associated with onion bacterial streak and bulb rot,” Canadian Journal of Plant Pathology, pp. 1-11, 2024, doi: 10.1080/07060661.2024.2366937. [5] S. A. Miller, J. P. Ferreira, and J. T. LeJeune, “Antimicrobial Use and Resistance in Plant Agriculture: A One Health Perspective,” Agriculture, vol. 12, no. 2, p. 289, 2022, doi: 10.3390/agriculture12020289. [6] A. BiBi, S. Bibi, M. A. Al-Ghouti, and M. H. Abu-Dieyeh, “Isolation and evaluation of Qatari soil rhizobacteria for antagonistic potential against phytopathogens and growth promotion in tomato plants,” Scientific reports, vol. 13, no. 1, p. 22050, 2023, doi: 10.1038/s41598-023-49304-w. [7] H. Abriouel, C. M. Franz, N. B. Omar, and A. Gálvez, “Diversity and applications of Bacillus bacteriocins,” FEMS microbiology reviews, vol. 35, no. 1, pp. 201-232, 2011, doi: 10.1111/j.1574- 6976.2010.00244.x. [8] W. Cui, J. Zhang, W. Wang, X. Wu, X. Luo, Y. Zou, K. Chen, and P. He, “Screening native Bacillus strains as potential biological control agents against ginger bacterial wilt and for promoting plant growth,” Biological Control, vol. 192, p. 105510, 2024, doi: 10.1016/j.biocontrol.2024.105510. http://jst.tnu.edu.vn 17 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 11 - 18 [9] H. Mácha, H. Marešová, T. Juříková, M. Švecová, O. Benada, A. Škríba, M. Baránek, Č. Novotný, and A. Palyzová, “Killing Effect of Bacillus velezensis FZB42 on a Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) Strain Newly Isolated from Cabbage Brassica oleracea Convar. Capitata (L.): A Metabolomic Study,” Microorganisms, vol. 9, no. 7, p. 1410, 2021, doi: 10.3390/microorganisms9071410. [10] C. E. H. Maung, V. Choub, J. Y. Cho, and K. Y. Kim, “Control of the bacterial soft rot pathogen, Pectobacterium carotovorum by Bacillus velezensis CE 100 in cucumber,” Microbial pathogenesis, vol. 173(Pt A), 2022, Art. no. 105807, doi: 10.1016/j.micpath.2022.105807. [11] D. Margosch, M. G. Gänzle, M. A. Ehrmann, and R. F. Vogel, “Pressure inactivation of Bacillus endospores,” Applied and environmental microbiology, vol. 70, no. 12, pp. 7321-7328, 2004, doi: 10.1128/AEM.70.12.7321-7328.2004. [12] J. G. Holt, Bergey’s manual of determinative bacteriology 9th Edition, Lippincott Williams and Wilkins, 1994. [13] H. Naghili, H. Tajik, K. Mardani, S. M. R. Rouhani, A. Ehsani, and P. Zare, “Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests,” Veterinary research forum: An international quarterly journal, vol. 4, no. 3, pp. 179-183, 2013. [14] M. A. Elazhary, S. A. Saheb, R. S. Roy, and A. Lagacé, “A simple procedure for the preliminary identification of aerobic gram negative intestinal bacteria with special reference to the Enterobacteriaceae,” Canadian journal of comparative medicine: Revue canadienne de medecine comparee, vol. 37, no. 1, pp. 43-46, 1973. [15] L. P. Geok, C. N. A. Razak, R. N. Z. A. Rahman, M. Basri, and A. B. Salleh, “Isolation and screening of an extracellular organic solvent-tolerant protease producer,” Biochemical Engineering Journal, vol. 13, no. 1, pp. 73-77, 2003. [16] P. Saroj, P. Manasa, and K. Narasimhulu, “Characterization of thermophilic fungi producing extracellular lignocellulolytic enzymes for lignocellulosic hydrolysis under solid-state fermentation,” Bioresources and Bioprocessing, vol. 5, p. 31, 2018. [17] L. Ramnath, B. Sithole, and R. Govinden, “Identification of lipolytic enzymes isolated from bacteria indigenous to Eucalyptus wood species for application in the pulping industry,” Biotechnology reports (Amsterdam, Netherlands), vol. 15, pp. 114-124, 2017. [18] B. Schwyn and J. B. Neilands, “Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores,” Analytical biochemistry, vol. 160, no. 1, pp. 47-56, 1987. [19] W. P. Chen and T. T. Kuo, “A simple and rapid method for the preparation of Gram-negative bacterial genomic DNA,” Nucleic acids research, vol. 21, no. 9, p. 2260, 1993. [20] D. J. Lane, “16S/23S rRNA sequencing,” in Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, Eds. New York: Wiley, 1991, pp. 115-175. [21] D. Ammons, J. Rampersad, and A. Khan, “Usefulness of staining parasporal bodies when screening for Bacillus thuringiensis,” Journal of invertebrate pathology, vol. 79, no. 3, pp. 203-204, 2002, doi: 10.1016/s0022-2011(02)00018-6. [22] R. Rosariastuti, S. Sumani, and S. Hartati, “Analysis of bacterial community from the rhizosphere of shallots (Allium ascalonicum L.) in Brebes, Central Java, using Next Generation Sequencing (NGS) approach,” 9th International Conference on Sustainable Agriculture and Environment, 2022, doi: 10.1088/1755- 1315/1114/1/012065. [23] S. Marković, T. P. Milovanović, A. Jelušić, R. Iličić, O. Medić, T. Berić, and S. Stanković, “Biological control of major pathogenic bacteria of potato by Bacillus amyloliquefaciens strains SS-12.6 and SS-38.4,” Biological control, vol. 182, 2023, Art. no. 105238, doi: 10.1016/j.biocontrol.2023.105238. [24] H. Tarek, S. S. Cho, K. B. Nam, J. M. Lee, S. H. Lee, and J. C. Yoo, “Mode of Action of Antimicrobial Potential Protease SH21 Derived from Bacillus siamensis,” International Journal of Molecular Sciences, vol. 25, no. 13, 2024, Art. no. 7046, doi: 10.3390/ijms25137046. [25] V. Prabhawathi, T. Boobalan, P. M. Sivakumar, and M. Doble, “Antibiofilm properties of interfacially active lipase immobilized porous polycaprolactam prepared by LB technique,” PloS one, vol. 9, no. 5, 2014, Art. no. e96152, doi: 10.1371/journal.pone.0096152. [26] Z. Shao, S. Gu, X. Zhang, J. Xue, T. Yan, S. Guo, T. Pommier, A. Jousset, T. Yang, Y. Xu, Q. Shen, and Z. Wei, “Siderophore interactions drive the ability of Pseudomonas spp. consortia to protect tomato against Ralstonia solanacearum,” Horticulture Research, vol. 11, no. 9, 2024, Art. no. uhae186, doi: 10.1093/hr/uhae186. [27] O. S. Olanrewaju, B. R. Glick, and O. O. Babalola, “Mechanisms of action of plant growth promoting bacteria,” World Journal of Microbiology & Biotechnology, vol. 33, no. 11, p. 197, 2017, doi: 10.1007/s11274-017-2364-9. http://jst.tnu.edu.vn 18 Email: jst@tnu.edu.vn