Đề tài nhánh của KY 01 - 04: Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán viêm não Nhật Bản

Chia sẻ: Lê Thương | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:16

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán viêm não Nhật Bản" giới thiệu tới người đọc quy trình sản xuất kháng nguyên VNNB Nakayama theo phương pháp Sucroza - Axeton, quy trình sản xuất kháng thể virut VNNB gắn HRPO,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài nhánh của KY 01 - 04: Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán viêm não Nhật Bản

Bé Y tÕ ®Ò tµi KY 01 – 04 §Ò tµi nh¸nh cña KY 01 – 04 Nghiªn cøu s¶n xuÊt bé sinh phÈm MAC-ELISA dïng cho chÈn ®o¸n viªm n∙o NhËt b¶n Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh KY 01 – 04 TS. Phan ThÞ Ngµ 6612 27/10/2007 Hµ néi 1991 - 1993
Môc B Nghiªn cøu s¶n xuÊt bé sinh phÈm Mac-elisa Dïng cho chÈn ®o¸n viªm n∙o nhËt b¶n (VNNB) I. §Æt vÊn ®Ò: Thö nghiÖm miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM kh¸ng virut VNNB (IgM antibody Capture ELISA gäi t¾t lµ MAC-ELISA) ®−îc Bundo, K. vµ Igarashi, A. nghiªn cøu vµ ®−a vµo ¸p dông trong chÈn ®o¸n nhanh, sím vµ ®Æc hiÖu bÖnh VNNB. §©y lµ mét ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc míi cã nhiÒu −u ®iÓm næi bËt nh−: - HuyÕt thanh sö dông cho thö nghiÖm kh«ng ph¶i xö lý mµ vÉn tr¸nh ®−îc d−¬ng tÝnh gi¶ víi yÕu tè thÊp khíp. - ChÈn ®o¸n sím bÖnh ngay sau khi m¾c 2 - 4 ngµy ®Çu. ChÈn ®o¸n bÖnh b»ng mét mÉu huyÕt thanh ®¬n. - ChÈn ®o¸n ®Æc hiÖu, cã ®é nh¹y vµ chÝnh x¸c cao. ChÝnh v× vËy mµ ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n huyÕt thanh nµy nhanh chãng ®−îc ¸p dông ë nhiÒu n−íc cã l−u hµnh bÖnh VNNB ®Ó x¸c ®Þnh c¨n nguyªn. §Ó ¸p dông thö nghiÖm MAC-ELISA trong chÈn ®o¸n nhanh vµ sím bÖnh VNNB, th× viÖc sö dông sinh phÈm d−íi d¹ng nh÷ng bé sinh phÈm lµ rÊt thuËn tiÖn cho viÖc ¸p dông thö nghiÖm nµy. Do vËy môc ®Ých nghiªn cøu cña chóng t«i lµ: Nghiªn cøu s¶n xuÊt bé sinh phÈm MAC-ELISA dïng cho chÈn ®o¸n nhanh bÖnh VNNB. II. VËt liÖu: 1. VËt liÖu ®Ó chÕ t¹o sinh phÈm: 1.1. §éng vËt thÝ nghiÖm: - Chuét nh¾t tr¾ng gièng Swiss lo¹i 2 - 3 ngµy tuæi. - Chuét nh¾t tr¾ng gièng Swiss 11 - 13 gam. Do trung t©m nghiªn cøu vµ s¶n xuÊt ®éng vËt thÝ nghiÖm ViÖn VÖ Sinh DÞch TÔ Häc Hµ Néi cung cÊp. 1
1.2. C¸c ho¸ chÊt: - Sucroza - axeton. - axit Boric - Albumin bß. - T¸ d−îc Freund - Horse - Raddish - Peroxidaza - Sephacryl S200 - O-Phenylene Diamine (OPD) - C¸c muèi: + axit citric + axit H2SO4 + KCl + NaH2PO4 + H2O2 + Na2CO3 + NaHCO3 + Na2HPO4. 12H2O. + O-Phenylene diamine + Twcen 20 1.3. Dông cô: - B¬m tiªm 1 ml, 2ml, 5ml. - Pipet 1 ml, 2ml, 5ml, 10ml. - TÊm nhùa lµm ELISA ®¸y b»ng 96 giÕng, - Pipet man lo¹i 20 µl, 100 µl, 1000 µl - Pipet man 8 kªnh 50-250 µl - §Çu tÝp cho c¸c lo¹i pipet man trªn - C¸c dông cô thuû tinh trung tÝnh vµ c¸c ®å dïng phßng thÝ nghiÖm cÇn thiÕt kh¸c. 2
1.4. ThiÕt bÞ phßng thÝ nghiÖm - Buång v« trïng - M¸y nghiÒn n·o - M¸y li t©m l¹nh 40C (10.000 v/p) - Tñ l¹nh 40C, - 200C, - 700C - Tñ Êm 370C - Tñ xÊy - M¸y ®o pH - C©n chÝnh x¸c - M¸y hót ch©n kh«ng - M¸y quay ®iÖn tõ - M¸y ®äc ELISA - M¸y ®«ng kh« sinh phÈm 2. Sinh phÈm 2.1. C¸c sinh phÈm chuÈn - Kh¸ng nguyªn VNNB chñng Nak. Biken NhËt B¶n - IgG chuét kh¸ng virut VNNB chñng Nak. g¾n Peroxydaza cña ViÖn Biken, NhËt B¶n. - Kh¸ng IgM ng−êi ®Æc hiÖu chuçi µ cña cappel USA. s¶n xuÊt. 2.2. C¸c sinh phÈm t¹o bé sinh phÈm MAC-ELISA. - Kh¸ng nguyªn VNNB do phßng thÝ nghiÖm Viªm n·o s¶n xuÊt - HuyÕt thanh mÉu chøng d−¬ng vµ chøng ©m do phßng thÝ nghiÖm Viªm n·o cung cÊp. - IgG chuét kh¸ng virut VNNB g¾n Peroxydaza do phßng thÝ nghiÖm Ho¸ sinh vµ phßng thÝ nghiÖm Viªm n·o s¶n xuÊt. - Kh¸ng IgM ng−êi ®Æc hiÖu chuçi µ cña Cappel USA. 3. MÉu bÖnh phÈm cho kiÓm tra bé sinh phÈm: - C¸c mÉu bÖnh phÈm ®−îc lÊy tõ nh÷ng bÖnh nh©n cã héi chøng n·o cÊp ch−a râ c¨n nguyªn ë mäi løa tuæi (bÖnh nh©n ®iÒu trÞ t¹i c¸c bÖnh viÖn hoÆc c¸c æ dÞch vµ nghi lµ VNNB) 3
- Thêi gian lÊy mÉu: Sau khi m¾c bÖnh 1 - 2 ngµy cho ®Õn 60 ngµy sau. - BÖnh phÈm: HuyÕt thanh bÖnh nh©n lÊy 0,1 ml - 1ml. III. Ph−¬ng ph¸p. 1. Quy tr×nh s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn VNNB Nakayama theo ph−¬ng ph¸p SUCROZA-AXETON: - N·o chuét æ nhiÔm virut VNNB ®−îc nghiÒn ®ång nhÊt 20% trong sucroza 8,5% b»ng m¸y nghiÒn Nissei - NhËt B¶n 2000 v/p trong 5 phót. - Cho mét thÓ tÝch hçn dÞch virut nµy vµo 20 thÓ tÝch axªton l¹nh. - Ly t©m 1.800 v/p trong 15 phót lo¹i bá n−íc næi. - Lµm tan cÆn nµy b»ng mét thÓ tÝch axeton l¹nh nh− trªn ®Ó 40C/60 phót. - Ly t©m 1.800 v/p trong 15 phót lo¹i bá n−íc næi. Hoµ cÆn nµy b»ng axeton l¹nh cho vµo trong tube ly t©m 1.800 v/p trong 15 phót lo¹i bá n−íc næi. - Tr¶i réng cÆn trong tube vµ lµm kh« b»ng m¸y hót ch©n kh«ng tõ 1 - 2 giê. - Lµm tan cÆn b»ng ®Öm Borat pH.9 cã 0,4% Albumin bß ®Ó 40C qua ®ªm. - Ly t©m 10.000 v/p trong 60 phót ë 40C lÊy n−íc næi kiÓm tra hiÖu gi¸ b»ng ph¶n øng ng−ng kÕt hång cÇu (kh¸ng nguyªn dïng cho thö nghiÖm MAC-ELISA hiÖu gi¸ ph¶i ®¹t >1/256). - X¸c ®Þnh hiÖu gi¸ thÝch hîp dïng cho thö nghiÖm MAC-ELISA. - §«ng kh« kh¸ng nguyªn, kiÓm tra l¹i hiÖu gi¸ sau ®«ng kh«. 2. Quy tr×nh s¶n xuÊt kh¸ng thÓ virut VNNB g¾n HRPO: 2.1. Quy tr×nh s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng virut VNNB (Nak): - C¸ch g©y miÔn dÞch cho chuét Swiss 11- 13 gam: + Sè lÇn g©y miÔn dÞch: 5 lÇn, mçi lÇn c¸ch nhau 7 ngµy. + LiÒu g©y miÔn dÞch: 0,2 ml hçn dÞch virut (v¨cxin VNNB) víi t¸ d−îc Freund theo tû lÖ 1/1 + §−êng tiªm: Tiªm vµo phóc m¹c. - LÊy m¸u tim ®Ó kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ (Ýt nhÊt lµ 3 con chuét) sau mòi tiªm thø 4. - KiÓm tra hiÖu gi¸ b»ng ph¶n øng ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu hoÆc b»ng kü 4
thuËt trung hoµ trªn tÕ baß nÕu kÕt qu¶ ®¹t: + Ph¶n øng ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu hiÖu gi¸ > 1/1.000 + Kü thuËt trung hoµ trªn tÕ bµo hiÖu gi¸ > 106 - LÊy m¸u t¸ch huyÕt thanh: LÊy m¸u cho vµo tube ®Ó nghiªng ë nhiÖt ®é phßng cho ®«ng, ®Ò vµo 370C/60p. Råi ®Ó ë 40C qua ®ªm ®Ó t¸ch lÊy huyÕt thanh. 2.2. Quy tr×nh s¶n xuÊt kh¸ng thÓ IgG kh¸ng virut VNNB g¾n HRPO: 2.2.1. Tinh chÕ IgG kh¸ng virut VNNB. a. Pha lo·ng kh¸ng thÓ virut VNNB trong PBS theo tû lÖ 1/2. b. Cho 1 thÓ tÝch lo·ng dung dÞch (NH4)2SO4 b·o hoµ vµo 1 thÓ tÝch kh¸ng thÓ ®· pha lo·ng trªn. c. Quay ®iÖn tõ ë phßng thÝ nghiÖm 20 phót. d. Ly t©m 10.000 v/p trong 20 phót lo¹i bá n−íc næi. e. Lµm tan cÆn b»ng PBS vµ thªm dung dÞch (NH4)2SO4 b·o hoµ ®Ó cã nång ®é cuèi cïng lµ 39%. f. Quay ®iÖn tõ ë phßng thÝ nghiÖm Ýt nhÊt 20 phót. g. Ly t©m 10.000 v/p trong 20 phót. h. Lo¹i bá n−íc næi vµ lµm tan cÆn víi PBS (lµm nh¾c l¹i nh− c¸c b−íc e, f, g, thªm 2 lÇn n÷a. i. Hoµ tan cÆn víi mét l−îng PBS nhá nhÊt, thÈm tÝch trong PBS lo¹i bá (NH4)2SO4 ë 40C qua ®ªm. 5
k. Cho qua cét trao ®æi Ion Sephacryl: S200) ®Ó chän c¸c mÉu cã chøa IgG kh¸ng virut VNNB. l. Hén c¸c mÉu cã chøa IgG, c« ®Æc b»ng ¸p lùc ch©n kh«ng. Kh¸ng thÓ tinh chÕ nµy dïng ®Ó lµm céng hîp enzym. 2.2.2. G¾n IgG kh¸ng virut VNNB tinh khiÕt víi HRPO: ThÈm tÝch IgG 30 mg HRPO pha trong 12,3 ml (100mg) trong dung n−íc cÊt cho 2,5ml 0,1M NaIO dÞch 0,01M Carbonat quay ®iÖn tõ 20 phót ë phßng thÝ pH 9,6 ë 40C qua ®ªm nghiÖm. ThÈm tÝch trong dung dÞch 1M Acetat pH 4,5 ë phßng thÝ nghiÖm qua ®ªm §iÒu chØnh pH tíi 9,5 b»ng dung dÞch 1M Cacbonat pH 9,6 + Quay ®iÖn tõ ë phßng thÝ nghiÖm trong 2 giê (tr¸nh ¸nh s¸ng). §Ó ë 40C t rong 2 giê kh«ng quay ®iÖn tõ. Cho qua cét trao ®æi Ion (Sephacryl: S200). Thu c¸c mÉu vµ ®o ë b−íc sãng 280nm, 403nm. TÝnh tû sè mËt ®é quang häc (OD) cña b−íc sãng 403/280. Hén c¸c mÉu cã tû sè trong kho¶ng 0,3 - 0,6. Thªm 0,1% Albumin bß (chÊt lµm bÒn v÷ng). X¸c ®Þnh hiÖu gi¸ thÝch hîp dïng cho thö nghiÖm MAC-ELISA §«ng kh«. 3. Chän mÉu huyÕt thanh chøng d−¬ng vµ chøng ©m: 3.1. Chän mÉu huyÕt thanh d−¬ng tÝnh: - HuyÕt thanh bÖnh nh©n cã héi chøng n·o cÊp nghi VNNB ®−îc lµm xÐt 6
nghiÖm b»ng kü thuËt HI chän mÉu x¸c ®Þnh d−¬ng tÝnh cã hiÖu gi¸ >1/80. KiÓm tra l¹i b»ng thö nghiÖm MAC-ELISA tõng mÉu huyÕt thanh riªng (cã ®èi chiÕu víi huyÕt thanh mÉu d−¬ng chuÈn cña ViÖn Nagasaki NhËt B¶n). - Nh÷ng mÉu huyÕt thanh tho¶ m·n hai ®iÒu kiÖn: - HiÖu gi¸ HI > 1/80 - MAC - ELISA d−¬ng tÝnh (OD mÉu thö/OD chøng ©m >2). 3.2. Chän mÉu huyÕt thanh ©m tÝnh: - HuyÕt thanh ng−êi lµnh ë vïng kh«ng cã l−u hµnh dÞch VNNB ®−îc lµm xÐt nghiÖm kiÓm tra b»ng kü thuËt HI vµ MAC-ELISA x¸c ®Þnh ©m tÝnh (cã ®èi chiÕu víi huyÕt thanh mÉu ©m chuÈn cña ViÖn Nagasaki). 4. Pha c¸c dung dÞch ®Öm cho bé sinh phÈm. 4.1. Dung dÞch phñ b¶n pH. 9,6: Na2CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g NaN3 0,2 g N−íc cÊt võa ®ñ 100 ml 4.2. Dung dÞch 0,05M Citrat phopat pH 5,0 ®Æc 10 lÇn: axit Citric 5,04 g Na2HPO412H2o 17,90 g 4.3. Pha dung dÞch 0,05M Citrat phophat pH.5,0 ®Æc 10 lÇn cã H2O2: 1 ml dung dÞch Citrat phophat pH.5,0 ®Æc 10 lÇn 0,003 ml H2O2 4.4. Pha dung dÞch axit dõng ph¶n øng: H2SO4 ®Ëm ®Æc 10,6 ml (Chó ý cho tõ tõ axit ®Ëm ®Æc vµo n−íc) 7
4.5. PBS tinh thÓ: NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g (Khi dïng pha trong 1.000 ml n−íc cÊt) * C¸c dung dÞch ®Öm vµ ho¸ chÊt ®−îc ®ãng lä ®ñ dïng cho tõng bé sinh phÈm 96 thö nghiÖm. 5. Cè ®Þnh kh¸ng thÓ IgG kh¸ng IgM ng−êi ®Æc hiÖu chuçi µ trªn phiÕn nhùa 96 ghiÕng: - ChuÈn ®é hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ kh¸ng IgM ng−êi theo ph−¬ng ph¸p cña Bundo, K. vµ Igarashi, A. ®Ó x¸c ®Þnh hiÖu gi¸ thÝch hîp. - Pha kh¸ng thÓ kh¸ng IgM ng−êi trong dung dÞch phñ b¶n pH 9,6 - Cho vµo c¸c giÕng cña b¶n nhùa mçi ghiÕng 100 µl, ®Ó 40C qua ®ªm. - Röa b¶n nhùa b»ng dung dÞch PBS-T 5 lÇn - C¸c b¶n nhùa ®· cè ®Þnh kh¸ng thÓ IgG ®−îc bäc kÝn b»ng giÊy b¹c b¶o qu¶n ë 40C hoÆc -200C. 6. Nguyªn lý thö nghiÖm MAC-ELISA: Nguyªn lý: Thö nghiÖm MiÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM kh¸ng virut viªm n·o NhËt B¶n (IgM Antibody Capture ELISA gäi t¾t lµ MAC-ELISA) lµ mét thö nghiÖm miÔn dÞch gi¸n tiÕp ®Ó x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña kh¸ng thÓ IgM kh¸ng virut VNNB trong huyÕt thanh hoÆc n−íc n·o tuû bÖnh nh©n. 8
Tãm t¾t s¬ ®å: Nguyªn lý kü thuËt MAC-ELISA Pha r¾n 1 2 3 4 5 1. IgG thá kh¸ng IgM ng−êi ®Æc hiÖu chuçi µ. 2. Kh¸ng thÓ IgM cã trong m¸u hoÆc dÞch n·o tuû. 3. Kh¸ng nguyªn VNNB (Nak) 4. IgG chuét kh¸ng vi rót VNNB g¾n Peroxydaza. 5. C¬ chÊt hiÖn mµu OPD. Tiªu chuÈn nhËn ®Þnh d−¬ng tÝnh ®äc b»ng m¸y ®äc ELISA ë b−íc sãng 492 nm. OD chøng d−¬ng ------------------------------------- ≥ 2 OD chøng ©m OD mÉu thö ------------------------------------- ≥ 2 OD chøng ©m IV. KÕt qu¶. B¶ng 1. So s¸nh hiÖu gi¸ c¸c sinh phÈm s¶n xuÊt: Sinh phÈm ViÖn BiKen ViÖn VSDT HiÖu gi¸ - kh¸ng nguyªn > 1/2000 > 1/2000 HiÖu gi¸ - Céng hîp enzym > 1/2000 > 1/2000 9
B¶ng 2. Theo dâi ®iÒu kiÖn vµ thêi gian b¶o qu¶n sinh phÈm: Thêi gian b¶o Sinh phÈm H×nh thøc qu¶n 400C - 200C 1. TÊm nhùa 96 giÕng §· g¾n kh¸ng IgM ng−êi 3 th¸ng 1 n¨m 2. Kh¸ng nguyªn VNNB §«ng kh« 3 th¸ng 3 n¨m 3. HuyÕt thanh ©m §«ng kh« 3 th¸ng 3 n¨m 4. HuyÕnt thanh d−¬ng §«ng kh« 3 th¸ng 3 n¨m 5. IgG chuét kh¸ng virut VNNB §«ng kh« 3 th¸ng 3 n¨m g¾n HRPO 6. O-Phenylene diamine Tinh thÓ 3 th¸ng 1 n¨m 7. §Öm pha c¬ chÊt cã H2O2 (®Æc Dung dÞch 3 th¸ng 10 lÇn) 8. PBS (pha 1 lÝt) Tinh thÓ 12 th¸ng 9. Tween 20 Dung dÞch 12 th¸ng 10. H2SO44N Dung dÞch 12 th¸ng 11. N−íc cÊt 2 lÇn 12 th¸ng B¶ng 3. So s¸nh ®é nhËy cña 2 thö nghiÖm HI vµ MAC-ELISA ®èi víi 173 mÉu m¸u sím (LÊy sau khi m¾c bÖnh 1 - 5 ngµy, trong vô dÞch 1988) Sè mÉu KÕt qu¶ MAC-ELISA HI 37 (+) Cã kh¸ng thÓ 71 (+) (-) 60 (-) (-) 5 (-) Cã kh¸ng thÓ Tæng sè 108/173 (62,42%) 42/173 (24,27%) 10
B¶ng 4: KÕt qu¶ øng dông bé sinh phÈm MAC-ELISA trong chÈn ®o¸n vµ gi¸m s¸t bÖnh Dengue vµ VNNB KÕt qu¶ Lo¹i mÉu bÖnh phÈm Sè mÉu Kh¸ng nguyªn Kh¸ng nguyªn VNNB (NaK) Dengue (D2) M¸u ng−êi lµnh 1992 4 (+) (-) 3 (-) (+) 245 (-) (-) M¸u bÖnh nh©n - Cã chÈn ®o¸n l©m sµng nghi 40 (+) (-) VNNB - Sèt cao kh«ng râ c¨n nguyªn 2 (-) (+) B¶ng 5: Sù ph©n bè VNNB ®−îc x¸c ®Þnh b»ng MAC-ELISA theo løa tuæi (1989 - 1991) Nhãm tuæi 0-4 5-9 10 - 14 15 - 19 > 19 Tæng sè X¸c ®Þnh 174 169 38 2 18 401 VNNB % 43,39 42,14 9,48 0,50 4,49 100 85,53 9,48 4,99 100 11
B¶ng 6: Nh÷ng ®Þa ph−¬ng cã bÖnh nh©n VNNB ®· ®−îc x¸c ®Þnh b»ng MAC-ELISA (1989 - 1991) §Þa ph−¬ng ChÈn ®o¸n l©m sµng X¸c ®Þnh VNNB Hµ Néi Néi thµnh 20 8 Ngo¹i thµnh 138 77 Hµ B¾c 118 68 Hµ S¬n B×nh 117 64 H¶i H−ng 104 66 Hµ Nam §Þnh 30 19 Th¸i B×nh 2 2 VÜnh Phó 28 14 Thanh Ho¸ 5 3 L¹ng S¬n 4 3 B¾c Th¸i 12 9 Qu¶ng Ninh 2 1 Kh«ng x¸c ®Þnh 213 67 Tæng sè 793 401 12
B¶ng 7: Nh÷ng ®Þa ph−¬ng cã bÖnh nh©n VNNB ®· ®−îc x¸c ®Þnh b»ng MAC - ELISA 1992 TØnh/ thµnh phè Sè mÉu xÐt nghiÖm MAC - ELISA (+) Hµ Néi Néi thµnh 7 5 Ngo¹i thµnh 29 24 Th¸i B×nh 52 25 Ninh B×nh 5 5 Thanh Ho¸ 2 2 Nam Hµ 28 25 Hµ B¾c 69 64 VÜnh Phó 30 25 H¶i H−ng 60 51 B¾c Th¸i 4 3 Qu¶ng Ninh 1 1 Hµ T©y 58 50 Hoµ B×nh 4 3 NghÖ An 2 0 Hµ TÜnh 1 1 Lai Ch©u 1 0 L¹ng S¬n 3 2 Tuyªn Quang 2 1 Yªn B¸i 4 1 S¬n La 1 0 Qu¶ng TrÞ 1 1 HuÕ 28 11 Kh«ng râ ®Þa chØ 138 39 Tæng sè 530 339 13
V. NhËn xÐt vµ bµn luËn 1. C¸c sinh phÈm s¶n xuÊt ®¹t hiÖu gi¸ cao, tinh khiÕt ®Ó sö dông cho thö nghiÖm MAC - ELISA hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn (kiÓm tra b»ng ph¶n øng ng−ng kÕt hång cÇu - HA) >1/2000, hiÖu gi¸ c«ng hîp enzym >1/2000 (B¶ng 1) 2. Qua theo dâi ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n sinh phÈm ®· x¸c ®Þnh thêi gian b¶o qu¶n sinh phÈm. - ë 40C trong 3 th¸ng - ë - 200C trong 3 n¨m 3. øng dông bé sinh phÈm MAC-ELISA trong chÈn ®o¸n nhanh vµ sím bÖnh VNNB thÊy cã nh÷ng −u ®iÓm næi bËt nh−: - ChÈn ®o¸n bÖnh víi mét mÉu huyÕt thanh, huyÕt thanh kh«ng ph¶i xö lý, tr¸nh ®−îc d−¬ng tÝnh gi¶, chÈn ®o¸n sím bÖnh. Trong 173 mÉu m¸u ®¬n (lÊy sau khi m¾c 1 - 5 ngµy) thö nghiÖm MAC-ELISA. X¸c ®Þnh d−¬ng tÝnh lµ 108/173 (62,42%) trong khi ®ã thö nghiÖm HI chØ x¸c ®Þnh ®−îc 42/172 (24,27%) mÉu cã kh¸ng thÓ. - §iÒu tra t×nh tr¹ng nhiÔm Èn virut Dengue vµ virut VNNB trong 252 mÉu m¸u lÊy ë ng−êi b×nh th−êng t¹i H¶i H−ng 6/1992. B»ng thö nghiÖm MAC- ELISA cã 245 mÉu ©m tÝnh víi c¶ kh¸ng nguyªn Dengue vµ VNNB. Nh−ng cã 4 mÉu d−¬ng tÝnh víi kh¸ng nguyªn VNNB vµ ©m tÝnh víi kh¸ng nguyªn Dengue, cã 3 m·u d−¬ng tÝnh víi kh¸ng nguyªn Dengue vµ ©m tÝnh víi kh¸ng nguyªn VNNB. (B¶ng 4) øng dông thö nghiÖm MAC-ELISA chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh bÖnh còng cho kÕt qu¶ t−¬ng tù, kh«ng cã sù chÐo gi÷a kh¸ng nguyªn viªm n·o vµ kh¸ng nguyªn Dengue. Nh− vËy MAC-ELISA lµ mét thö nghiÖm ®Æc hiÖu, kh«ng chÐo víi kh¸ng nguyªn cïng nhãm Flavi virut, nã rÊt cã ý nghÜa trong chÈn ®o¸n, gi¸m s¸t bÖnh ë nh÷ng n¬i cã l−u hµnh c¶ virut Dengue vµ virut VNNB nh− ë n−íc ta. 4. Tõ nh÷ng kÕt qu¶ chÈn ®o¸n bÖnh b»ng thö nghiÖm MAC-ELISA ®· x¸c ®Þnh mét sè ®Æc ®iÓm dÞch tÔ vÒ VNNB. 14
- DÞch th−êng x¶y ra vÒ mïa hÌ ®Ønh cao cña dÞch th−êng lµ th¸ng 6, tû lÖ x¸c ®Þnh d−¬ng tÝnh vµo thêi ®iÓm nµy lµ 216/295 (h×nh 1). - Tû lÖ m¾c VNNB cao nhÊt ë nhãm tuæi 0 - 9 (85,53%) b¶ng 5 - KÕt qu¶ x¸c ®Þnh VNNB t¹i c¸c tØnh vµ thµnh phè kh«ng ph¶n ¸nh ®−îc thùc chÊt t×nh h×nh bÖnh VNNB t¹i c¸c n¬i ®ã, nh−ng nã cã ý nghÜa trong viÖc x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña virut VNNB t¹i c¸c ®Þa ph−¬ng ®ã (b¶ng 6 vµ b¶ng 7). VI. KÕt luËn: Qua c¸c kÕt qu¶ ®¹t ®−îc chóng t«i nhËn thÊy: 1. C¸c sinh phÈm s¶n xuÊt ®¹t hiÖu gi¸ cao vµ ®é tinh khiÕt dïng cho thö nghiÖm MAC-ELISA - Kh¸ng nguyªn VNNB hiÖu gi¸ 2000 (ELISA) 2. Thêi gian vµ ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n sinh phÈm - ë ®iÒu kiÖn 40C bé sinh phÈm cã h¹n dïng trong 3 th¸ng - ë ®iÒu kiÖn - 200C bé sinh phÈm cã h¹n dïng 12 th¸ng. 3. Bé sinh phÈm MAC - ELISA ®−îc øng dông trong chÈn ®o¸n bÖnh VNNB cho kÕt qu¶ nhanh, sím chÝnh x¸c. 15