GIẢI TRÌNH TỰ DNA

GI

I TRÌNH T DNA

Ự

ỗ

ị

Ả DNA SEQUENCING TS. BS. Đ Th Thanh Th y ủ

1. GI

I TRÌNH T DNA

Ả

Ự

DNA là m t thí nghi m cho k t

ệ

ế

ộ

ự s p x p các nucleotide trong

ế

i trình t Gi ả qu th t ả ứ ự ắ đo n DNA đó. ạ

Vd:

5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTC CAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGG TCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCA GACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGA GGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACG CTTAATAGAACAANAAA3’

2. HAI PH

NG PHÁP GI

I TRÌNH T DNA

ƯƠ

Ả

Ự

i trình t

DNA

ươ

ả

ọ

ự

ng pháp gi

Ph ng pháp hoá h c gi c a Maxam & Guilbert (1977) ủ Nobel hóa h c 1980 (ph ươ ọ

i trình t ) ự

ả

Walter Gilbert

Ph

i trình t

c a

ươ

ả

ự ủ

ng pháp gi

ng pháp enzyme gi Frederick Sanger (1977) Nobel hoá h c 1958 (c u trúc protein: Insulin) ấ ọ i trình t ) Nobel hóa h c 1980 (ph ự ọ

ươ

ả

2.1. GI

Ả

I TRÌNH T DNA B NG PP HÓA H C Ằ

Ọ

Ự

1. Đánh d u m t đ u c a đo n DNA b ng g c phospho ộ ầ ủ ạ ằ ố

đ ng v phóng x ( ấ ị ạ 32P). ồ

ử ấ 32P b ng hóa ch t ằ ấ

ủ ệ ế ạ ặ

2. X lý các đo n DNA đã đánh d u ạ làm bi n đ i đ c hi u m t ho c hai lo i base c a ộ ổ ặ nucleotide trên đo n DNA ạ

3. Đi n di m u DNA đã x lý trong 4 ng nghi m này trên ệ ố

Autoradiography

ệ ử 4 hàng c a m t gel polyacrylamide bi n tính ẫ ủ ế ộ

2.2. GI

I TRÌNH T DNA B NG PP ENZYM

Ả

Ự

Ằ

ể ạ

ổ

ắ ồ

ả ứ

ợ ổ

ế

ả

ị

D a trên nguyên t c dùng enzyme polymerase đ t o ự m i cho s i khuôn, nh ng do trong s i b sung t ợ ư ợ ừ ddNTP, nên m i khi men ng ph n ng có thêm các ỗ ố polymerase kéo nh m ầ ddNTP vào thì s i b sung s ẽ ợ ổ i và k t qu là s có các s i b sung v i đ b ch n l ớ ộ ẽ ặ ạ dài khác nhau.

dNTP

ddNTP

M i đ

c đánh d u

ồ ượ

ấ

T l

dNTP và ddNTP

ả ứ

ỉ ệ

= 100 : 1

ố

B n ph n ng polymer hoá ố x y ra trong 4 ng riêng ả tệ bi

M I ĐÁNH D U PHÓNG X P

Ạ 35

Ồ

Ấ

A C G T

Sequence 5’ to 3’

T 3’ C G C A G T C C T A G C T T A G C G G 5’

ệ

ấ

ằ

ồ

C G G G C G T

ệ

ằ

ạ

Áp gel đi n di lên phim (m i đánh d u b ng phóng x hay b ng hoá quang), các v ch đi n di trên gel s hi n trên phim.

ạ ẽ ệ

ĐÁNH D U ddNTP Ấ

ẫ ắ

Sequence-specific primer

ứ

c t ng h p m i ớ ợ t c các kích ệ

1. G n ddNTP ng u nhiên, khi x y ra, ẩ p/ ng ng ng. ừ 2. Vì nhi u copy c a ề ủ c t o DNA đích đ ượ ạ đ ng th i, nên các ờ ồ s n ph m DNA ẩ ả đ ượ ổ c a t ủ ấ ả c đ u hi n th ề ướ di n v i t n cùng là ớ ậ ệ các ddNTP

GI

I TRÌNH T B NG ĐI N DI MAO QU N

Ả

Ự Ằ

Ả

Ệ

1. Dùng gel polyacrylamide bi n ế

ả

ể

tính, có đ phân gi i cao, có ộ t các đo n DNA th phân bi ệ ạ khác nhau ch 1 nucleotid. ỉ

2. Gel polyacrylamide th ườ

ứ ng ế

ch a urea (tác nhân làm bi n tính DNA)

3. K THU T GI

I TRÌNH T

Ậ

Ỹ

Ả

Ự

PCR cleanup

S n ph m PCR ẩ

ả

On to sequencing….

S n ph m PCR tinh s ch

ả

ẩ

ạ

+ n

cướ

ồ

Đo n ng đ DNA b ng máy hay

ằ ng qua đi n di

ộ ồ c l ướ ượ

ệ

B c 1: ướ Tinh s ch s n ph m PCR ả ạ ẩ

PCR + DNA đích + Taq polymerase + M i và dNTPs + PCR buffer, etc….

chu kỳ gi i trình t ướ Ph n ng ả ứ ự ả

denaturation

Product extension

Primer annealing

ẩ

ả

PCR machine

i trình t T a s n ph m gi ự lo i b ch t đánh d u th a ừ ấ

ủ ả ạ ỏ

ấ

B c 2: (cycle sequencing reaction)

c g n m t màu khác nhau.

ộ

ượ

ắ ượ

1. M i ddNTP đ 2. S n ph m PCR đ ẩ

c phân lo i d a trên kích ạ ự c (khác nhau 1 nt), khi ch y qua khu v c ạ

ự

ẽ ượ

c phân tích nh chùm tia laser ờ

ng đ huỳnh

ồ

ộ

ạ

ỗ

ắ ượ

ề

đ n 3’, t

ỗ ả th ướ phát hi n s đ ệ và b ph n detector. ộ ậ c ghi nh n g m c 3. D li u đ ậ ượ ữ ệ ườ c và màu s c c a m i đo n DNA. quang thu đ ượ ủ c đ c theo chi u 5’ c a đo n DNA đ ọ ạ ự ủ trái sang ph i. ả ừ

4. Trình t ế

B c 3: Đi n di trên máy gi i trình t ướ ệ ả ự