CH NG HAIƯƠ
K THU T RFLPỸ Ậ
(Restriction Fragment Length Polymorphisms)
I. Gi i thi u ớ ệ
K thu t RFLP là k thu t nghiên c u tính đa hình chi u dài c a các phân đo nỹ ậ ỹ ậ ứ ề ủ ạ
DNA d a trên đi m c t các enzim gi i h n (Restriction Enzyme, RE). Khi DNAự ể ắ ớ ạ ủ
v i enzim gi i h n dung d ch đ m thích h p pH, nhi t đ thích h p s sớ ớ ạ ở ị ệ ợ ở ệ ộ ợ ẽ ẽ
t o ra nh ng phân đo n DNA v i kích th c khác nhau, tạ ữ ạ ớ ướ đó l p nên các b n đừ ậ ả ồ
gen. K thu t này đ c s d ng ph bi n t th p niên 80 đ n nay.ỹ ậ ượ ử ụ ổ ế ừ ậ ế
II. Nguyên t c chungắ
Nguyên t c c a k thu t này d a trên đ đ c hi u c a các enzim c t gi i h nắ ủ ỹ ậ ự ộ ặ ệ ủ ắ ớ ạ
(restriction enzim-RE) đ i v i v trí nh n bi t c a chúng trên DNA b gen. Số ớ ị ậ ế ủ ộ ự
khác bi t v trí c t gi a hai cá th s t o ra nh ng phân đo n c t khác nhau.ệ ị ắ ữ ể ẽ ạ ữ ạ ắ
III. Các enzim gi i h n (RE)ớ ạ
1. Gi i thi uớ ệ
Enzim gi i h n đ c ớ ạ ượ Werner Arber tìm th y vi khu n vào năm 1962.ấ ở ẩ
Ông cho r ng các RE có kh năng r t đ c bi t đó là kh năng nh n bi t DNAằ ả ấ ặ ệ ả ậ ế
ch và DNA l . Enzim này h n ch s nhân lên c a DNA l khi chúng xâm nh pủ ạ ạ ế ự ủ ạ ậ
vào t bào vi khu n b ng cách c t chúng ra thành t ng đo n m t cách đ c hi u,ế ẩ ằ ắ ừ ạ ộ ặ ệ
vì th ông g i là restriction có nghĩa là h n ch . V i phát minh này ông cùng cácế ọ ạ ế ớ
c ng s (ộ ự Daniel Nathans và Hamilton O. Smith) đã giành gi i th ng Nobel vàoả ưở
năm 1978.
Các RE h p thành h th ng b o v t bào ợ ệ ố ả ệ ở ế s h ch (procaryote), m t câuơ ạ ộ
h i đ t ra là vì sao các RE ch c t DNA c a các phage mà không c t DNA c a tỏ ặ ỉ ắ ủ ắ ủ ế
bào vi khu n? Câu tr l i là nh Methylase đây là enzim giúp vi khu n có khẩ ả ờ ờ ẩ ả
năng này, chính enzim này ch u trách nhi m g n nhóm metyl (CHị ệ ắ 3) vào các
nucleotides v trí c t c a các RE trên DNA c a vi khu n vì th b o v DNAở ị ắ ủ ủ ẩ ế ả ệ
c a vi khu n kh i s phân c t c a RE. Tuy v y đôi lúc methylase l i g n nh mủ ẩ ỏ ự ắ ủ ậ ạ ắ ằ
c nhóm metyl vào chính DNA c a phage, đi u này gi i thích vì sao đ i v i cácả ủ ề ả ố ớ
dòng vi khu n kháng phage v n có các t bào b phân h y.ẩ ẫ ế ị ủ
Enzim c t gi i h n đ u tiên đ c phân l p vào năm 1968, cho đ n nay cóắ ớ ạ ầ ượ ậ ế
kho ng 3.400 RE đ c khám phá. Trong s này có kho ng 540 RE đã đ cả ượ ố ả ượ
th ng m i hóa. ươ ạ
2. Tên g i c a enzim c t gi i h nọ ủ ắ ớ ạ
Ch đ u vi t hoa là ch đ u tên vi khu n t đó RE đ c ly trích.ữ ầ ế ữ ầ ẩ ừ ượ
Hai ch k không vi t hoa t ng đ ng v i tên loài c a vi khu n. C 3 ch n yữ ế ế ươ ươ ớ ủ ẩ ả ữ ầ
đ u vi t in nghiêng. K đ n là ch s la mã ch th t RE đ c phát hi n trongề ế ế ế ữ ố ỉ ứ ự ượ ệ
tr ng h p nhi u RE đ c tìm th y trong cùng m t vi khu n.ườ ợ ề ượ ấ ộ ẩ
Đôi khi còn có thêm ch vi t hoa (vi t th ng) đ ch ch ng vi khu n s d ngữ ế ế ẳ ể ỉ ủ ẩ ử ụ
VD : Escherichia coli Ry13
chi loài ch ngủ
EcoRI: là enzym đ u tiên tìm th y trên vi khu n ầ ấ ẩ E. coli
EcoRV: enzym th 5 tìm th y trên vi khu n ứ ấ ẩ E.coli
3. Các lo i enzim c t gi i h nạ ắ ớ ạ
Lo i I:ạ khi enzym nh n bi t trình t nó s di chuy n trên phân t DNA cách đóậ ế ự ẽ ể ử
1000-5000 nu và gi i phóng đ vài ch c nu.ả ộ ụ
Lo i IIạ: enzym nh n bi t trình t và c t ngay v trí đó.ậ ế ự ắ ị
Lo i IIIạ: enzym nh n bi t trình t và c t DNA v trí cách đó 20 nu.ậ ế ự ắ ở ị
III. Quy trình th c hi n RFLP bao g m các b c:ự ệ ồ ướ
+Tách chi t và tinh s ch DNAế ạ
+C t các m u DNA c n phân tích b i REắ ẫ ầ ở
+Phân tách DNA trên gel agarose
+Southern Blotting
Chuy n DNA sang màng nylonể
Ch n đo n dò (probes), đánh d u đo n dòọ ạ ấ ạ
Lai ghép gen (Hybridization)
L p b n đ gen (phân tích đa hình)ậ ả ồ
1. Trích DNA
a. Nguyên t cắ: Thành t bào b phá v b ng bi n pháp c h c và các ch t t yế ị ỡ ằ ệ ơ ọ ấ ẩ
m nh. DNA đ c gi i phóng và làm s ch t p ch t Rnase. DNA đ c k t t a trongạ ượ ả ạ ạ ấ ượ ế ủ
Ethanol 100% và thu l i nh ly tâm.ạ ờ
b. Quy trình: Th c hi n theo qui trình đ c mô t b i Rogers và Bendich (1988)ự ệ ượ ả ở
(qui trình CTAB) g m các b c sau: ồ ướ
- L y lá c a đ i t ng c n nghiên c u.ấ ủ ố ượ ầ ứ
- Kh trùng b m t lá b ng c n 70%, sau đó dùng kéo và k p (đã đ c kh trùng)ử ề ặ ằ ồ ẹ ượ ử
c t lá thành t ng m nh nh r i cho riêng vào các tuýp (m i m u riêng m t tuýpắ ừ ả ỏ ồ ỗ ẫ ộ
kho ng 0,1g).ả
- Ngâm các tuýp và d ng c nghi n m u vào nit l ng trong 10 phút.ụ ụ ề ẫ ơ ỏ
- Cho m u vào máy nghi n, có t n s 27l n/giây, l p l i kho ng 3 l n.ẫ ề ầ ố ầ ậ ạ ả ầ
- Cho thêm 1.000µl Extraction buffer (10ml EB +7µl β-Mercaptoethanol).
- Cho thêm 50µl SDS 10%.
- trong n c 65Ủ ướ oC trong 30 phút. Sau 5 phút tr m t m u m t l n.ở ặ ẫ ộ ầ
- Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.
- L y 800µl d ch trong trên cho vào tuýp m i (b ph n c n)ấ ị ở ớ ỏ ầ ặ
- Cho 800µl Isopropanol vào m i ỗtuýp, l c đ u.ắ ề
- m u -20Ủ ẫ ở oC trong 2 gi .ờ
- Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b n c, l y c n.ỏ ướ ấ ặ
- Cho thêm 400µl TE 0,1 vào, thêm 10µl RNase, 20 phút 37ủ ở oC.
- Cho 400µl CTAB vào, 15 phút 65ủ ở oC.
- Cho 800µl Chloroform/Isoamylalcohol, đ o nh ả ẹ
(12ml Chloroform: 0,5ml Isoamylalcohol)
- Ly tâm 13.000rpm trong 5 phút.
- L y 700µl ph n trong chuy n sang tuýp m i.ấ ầ ể ớ
- Cho 1,4ml Ethanol 96% làm l nh vào, l c nh , đ 15 phút nhi t đ phòng.ạ ắ ẹ ể ở ệ ộ
- Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b n c, l y c n.ỏ ướ ấ ặ
- Cho 700µl Ethanol 70% làm l nh vào, l c nh .ạ ắ ẹ
- Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b n c, l y c n.ỏ ướ ấ ặ
- L p l i l n n a v i Ethanol 70% làm l nh, th m mi ng tuýp trên gi y.ặ ạ ầ ữ ớ ạ ấ ệ ấ
- S y chân không 45ấ ở oC trong 10 phút.
- Cho 200µl TE 0,1 vào, tr m u -20ữ ẫ ở oC.
c. Xác đ nh n ng đ DNA b ng ph ng pháp đo quang phị ồ ộ ằ ươ ổ
Nguyên t c: ắ
- D a vào s h p th m nh ánh sáng t ngo i b c sóng 260 nm và 280 nm c aự ự ấ ụ ạ ử ạ ở ướ ủ
các baz purin và pyrimidin. ơ
- Đ n v OD260 nm t ng ng n ng đ 50mg/ml cho m t dung d ch DNA s i đôi.ơ ị ươ ứ ồ ộ ộ ị ợ
Do đó n ng đ DNA trong m u đ c tính theo công th c sau: ồ ộ ẫ ượ ứ
[DNA] (mg/ml) = OD260nm x 50 x Đ pha loãng ộ
- Đ ki m tra đ tinh s ch c a dung d ch có th đo thêm giá tr OD 280nm. ể ể ộ ạ ủ ị ể ị
- Dung d ch axit nucleic đ c xem là s ch (không l n protein) khi t s : OD260nm/ị ượ ạ ẫ ỷ ố
OD280nm n m trong không 1.8 – 2.ằ
2. Dùng enzim gi i ớh n c t DNAạ ắ
M t s quy t c khi th c hi n ph n ng c t b ng REộ ố ắ ự ệ ả ứ ắ ằ
N ng đ NaCl c a dung d ch đ m, n u ph i s d ng nhi u RE có n ngồ ộ ủ ị ệ ế ả ử ụ ề ồ
đ NaCl c a dung d ch đ m khác nhau thì nên c t v i RE có n ng đ NaCl th pộ ủ ị ệ ắ ớ ồ ộ ấ
tr c r i đ n RE c n NaCl n ng đ cao h n.ướ ồ ế ầ ồ ộ ơ
RE đ c b o qu n trong dung d ch đ m có 50% glycerol -20ượ ả ả ị ệ ở 0C, nên
thêm vào ph n ng sau cùng, th i gian đ bên ngoài càng ng n càng t t.ả ứ ờ ể ắ ố
Th tích ph n ng càng nh càng có hi u qu vì RE và DNA ti p xúc v iể ả ứ ỏ ệ ả ế ớ
nhau càng t t tuy nhiên ph i b o đ m th tích RE không quá 1/10 th tích ph nố ả ả ả ể ể ả
ng vì glycerol nhi u s gây c ch ho t đ ng c a RE.ứ ề ẽ ứ ế ạ ộ ủ