Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được sự đa dạng di truyền và thụ phấn chéo của loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP CAO THỊ VIỆT NGA NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI DẦU SONG NÀNG (DIPTEROCARPUS DYERI PIERRE) Ở RỪNG NHIỆT ĐỚI ĐÔNG NAM BỘ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN MINH TÂM PGS.TS. BÙI VĂN THẮNG Hà Nội, 2018
i LỜI CAM ĐOAN Đề tài nghiên cứu của tôi về “Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ” do tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện, chƣa từng đƣợc công bố trong bất kì công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Ngƣời thực hiện Cao Thị Việt Nga
ii LỜI CÁM ƠN Đề tài nghiên cứu của tôi đƣợc thực hiện tại Phòng Ph n loại Thực nghiệm và Đa dạng ngu n gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam- Viện Hàn l m Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Viện Công nghệ sinh học L m nghiệp –Trƣờng Đại học l m nghiệp Việt Nam. Qua đ y, tôi xin gửi lời cảm ơn ch n thành tới Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài đƣợc tiến hành thuận lợi. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn s u sắc tới TS. NCVCC Nguyễn Minh Tâm và PGS-TS-GVCC Bùi Văn Thắng ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin ch n thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Ph n loại Thực nghiệm và Đa dạng ngu n gen của Bảo tàng và Viện Công nghiệp sinh học L m nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài, điều này khiến tôi thực sự cảm kích và biết ơn. Trong suốt quá trình học tập và công tác, tôi đã nhận đƣợc sự động viên, quan t m và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, Phòng Đào tạo sau đại học trƣờng Đại học L m nghiệp; bạn bè và các đ ng nghiệp, nơi tôi công tác. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những ngƣời th n đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vƣợt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn. Đề tài đƣợc hỗ trợ bởi Quỹ NAFOSTED, # 106.06-2017.14. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Cao Thị Việt Nga
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. Tổng quan c y họ Dầu (Dipterocarpaceace) ........................................... 3 1.2. C y Dầu song nàng ................................................................................. 5 1.3. Đánh giá đa dạng di truyền bằng sinh học ph n tử ................................. 6 1.3.1. Quần thể và tính đa dạng di truyền của quần thể ............................ 6 1.3.2. Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử ................................................................................................................. 8 1.4. Các nghiên cứu đa dạng di truyền họ Dầu ............................................ 12 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 12 1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................ 14 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 19 2.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu .......................................................... 19 2.2. Khu Bảo t n Thiên nhiên và Văn hóa Đ ng Nai .................................. 22 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 27 2.3.1. Các bước nghiên cứu ..................................................................... 27 2.3.2. Khảo sát ngoài thực địa. ................................................................ 28 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ............................................ 28
iv 2.3.4. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền loài Dầu song nàng ........................................................................................ 29 2.3.5. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ......................... 31 2.3.6. Phương pháp điện di ...................................................................... 32 2.3.7. Phân tích số liệu ............................................................................. 33 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 35 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR-SSR...................... 35 3.2. Đánh giá hiệu quả chỉ thị marker SSR .................................................. 37 3.3. Kết quả ph n tích đa dạng di truyền loài Dầu song nàng bằng chỉ thị phân tử SSR ................................................................................................... 38 3.2.1. Tần số allele trong quần thể........................................................... 38 3.2.2. Đa dạng di truyền loài Dầu song nàng .......................................... 42 3.2.3. Hệ số cận noãn ............................................................................... 45 3.2.4. Khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền quần thể ... 47 3.2.5. Mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể Dầu song nàng ................ 48 3.2.6. Phân tích AMOVA .......................................................................... 49 3.3.7. Mức độ khác nhau giữa các quần thể ............................................ 49 3.4. Kết quả phân tích thụ phấn chéo ở mỗi cây trội và quần thể ................ 50 3.5. Một số giải pháp bảo t n loài Dầu song nàng....................................... 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tên đầy đủ 1 RAPD Random amplified polymorphism DNA 2 RFLP Restriction fragment length Polymorphism 3 SSR Simple sequence repeat 4 PCR Polymerase chain reaction 5 DNA Deoxyribo Nucleic Acid
vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Địa điểm thu thập mẫu cho ph n tích đa dạng di truyền ................ 19 Bảng 2.2. Công thức pha đệm rửa (washing buffer) 10ml: ............................ 28 Bảng 2.3. Công thức pha đệm tách chiết (CTAB) 10ml:................................ 28 Bảng 2.4. Trình tự nucleotide các cặp m i SSR dùng trong nghiên cứu........ 30 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 31 Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR .................................................................... 31 Bảng 3.1. Số allele và các giá trị PIC, PD, Rp và MI cho 9 locus đa hình ..... 38 Bảng 3.2. Tần số allele cho mỗi locus của 3 quần thể ở Đông Nam Bộ ........ 41 Bảng 3.3. Đa dạng di truyền loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới ................ 43 Bảng 3.4. Đa dạng di truyền của một số loài Dầu ở Việt Nam ...................... 47 Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền (dƣới) vàhệ số tƣơng đ ng di truyền (trên) theo công thức Nei (1978)............................................................................... 48 Bảng 3.6. Phân tích AMOVA của loài Dầu song nàng ở Đông Nam Bộ ....... 49 Bảng 3.7. Mức độ khác nhau (FST) giữa các quần thể Dầu song nàng ........... 50 Bảng 3.8. Thông số sinh sản của Dầu song nàng............................................ 51
vii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số từ vỏ cây một số mẫu Dầu song nàng thu ở Đông Nam Bộ trên gel agarose 1% ....................................................... 35 Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% ...................... 36 Hình 3.3. Mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể Dầu song nàng .................. 48
1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam có một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, trong đó có khoảng 20% số loài là đặc hữu. Các nhà khoa học dự đoán Việt Nam có khoảng 15.000 loài thực vật, trong đó trên 10.000 đã đƣợc nhận biết. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nh n nhƣ chiến tranh kéo dài, khai thác lạm dụng, du canh du cƣ, chuyển đổi mục đích sử dụng đất đã làm diện tích và chất lƣợng rừng của nƣớc ta bị suy giảm. Các hệ sinh thái rừng cũng bị suy thoái nghiêm trọng. Nhiều loài thực vật rừng quý hiếm đang bị khai thác, chặt hạ trái phép nên đang đứng trƣớc nguy cơ bị đe doạ tuyệt chủng. Các loài cây họ Dầu là những loài c y rừng chiếm ƣu thế và đóng một vai trò sinh thái và kinh tế quan trọng. Hiện nay, có hơn 45 loài đƣợc biết đến thuộc 6 chi ở Việt Nam, chủ yếu là bản địa và đặc hữu. Bởi vì giá trị thƣơng mại và nhu cầu gỗ địa phƣơng, các loài cây họ Dầu đang bị khai thác mạnh. Hơn nữa, trong nhiều năm, áp lực tăng trƣởng kinh tế đã dẫn đến một sự giảm lớn trong khu vực rừng và tăng mức độ ph n mảnh rừng còn sống sót. Những xu hƣớng này có ảnh hƣởng bất lợi đến môi trƣờng sống của c y họ Dầu. Hiện nay, 33 loài c y họ Dầu đang bị đe dọa ở mức độ toàn cầu. Loài c y Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) có th n thẳng, gỗ tốt đƣợc sử dụng nhiều trong sơn kỹ nghệ hay đóng tàu. Ngoài ra, chúng còn đƣợc sử dụng nhƣ một ngu n tinh dầu có giá trị. C y Dầu song nàng ph n bố trong các khu rừng nhiệt đới vùng đất thấp. Ở Việt Nam, do sự giảm của môi trƣờng sống và khai thác quá mức dẫn đến loài câynày đã đƣợc liệt kê là bị đe dọa. Theo sách đỏ Việt Nam năm 2007 Dầu song nàng đƣợc xếp vào bậc VU A1c,d + 2c, d; vì vậy rất cần những nghiên cứu bảo t n phát triển loài c y này. Vì vậy đề tài này nghiên cứu tập trung đánh giá hiện trạng quần thể, mức độ đa dạng di truyền của ba
2 quần thể Dầu song nàng tại rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ bằng kỹ thuật SSR góp phần cho các nhà quản lý đƣa ra các giải pháp bảo t n, phục h i và phát triển bền vững. Mục tiêu, nội dung, ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài - Mục tiêu đề tài: Xác định đƣợc sự đa dạng di truyền và thụ phấn chéo của loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) ở rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ. - Nội dung nghiên cứu:  Ph n tích đa dạng di truyền loài Dầu song nàng trên cơ sở ph n tích 9 cặp m i Microsatellite (SSR)  Xác định các thông số thụ phấn chéo loài Dầu song nàng ở rừng nhiệt đới Mã Đà (Đông Nam Bộ). - Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: Kết quả nghiên cứu là dẫn liệu khoa học đa dạng di truyền loài Dầu song nàng phục vụ cho công tác bảo t n và phục h i loài hữu hiệu ở Việt Nam.
3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan cây họ Dầu (Dipterocarpaceace) Họ Dầu còn đƣợc gọi là Họ Hai cánh có danh pháp khoa học là Dipterocarpaceae g m có 17 chi và khoảng 580 – 680 loài cây thân gỗ chủ yếu ở các rừng mƣa nhiệt đới vùng đất thấp với quả hai cánh. Tên gọi khoa học của họ xuất phát từ chi điển hình là Dipterocarpus, có ngu n gốc từ tiếng Hy Lạp (di là hai, pteron là cánh và karpos là quả, nghĩa là quả có hai cánh). Các chi lớn nhất là Shorea (196 – 360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatica (60 – 65 loài). Nhiều loài chiếm ƣu thế trong các hệ sinh thái rừng, thông thƣờng có thể cây cao tới 40–70 m, đôi khi trên 80 m (Dryobalanops, Hopea và Shorea). Họ Dầu (Dipterocarpaceae) g m 3 phân họ. Monotoideae g m có 3 chi và 30 loài phân bố ở Châu Phi, đảo Madagascar và vùng Amazon thuộc Colombia. Pakaraimoideae g m có 1 loài duy nhất là Pakaraimaea roraimae, ph n bố ở vùng cao nguyên Guiana (Nam Mỹ). Dipterocarpoideae là ph n họ lớn nhất g m có 13 chi và 470 - 650 loài. Khu vực ph n bố bao g m Seychelles, Sri Lanka, Ấn Độ, Đông Nam Á, New Guinea, nhƣng chủ yếu ở miền t y Malesia, tại đ y chúng tạo thành quần thể thống lĩnh trong các cánh rừng vùng đất thấp [1,2,18]. Ở Việt Nam theo danh lục các loài thực vật ở Việt Nam, họ Dầu (Dipterocarpaceae) g m 6 chi, 42 loài và 3 phân loài, trong đó: chi Vên vên (Anisoptera) có 2 loài; chi Dầu (Dipterocarpus) có 11 loài và 2 phân loài; chi Kiền kiền (Hopea) có 11 loài; chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài; chi Táu (Vatica) có 8 loài và 1 phân loài. Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), Việt Nam có 42 loài và 1 phân loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae), trong đó: chi Vên vên (Anisoptera) có 1 loài. Hai loài Vên vên trong danh lục thực vật Việt Nam gộp lại thành 1 loài là Vên vên
4 (A. costata); chi Dầu (Dipterocarpus) có 12 loài, bổ sung loài Dầu cát (D. condorensis) so với Danh lục thực vật Việt Nam; chi Kiền kiền (Hopea) có 11 loài trong đó không nhắc đến loài Sao xanh (H. helferi) nhƣ trong Danh lục thực vật Việt Nam và bổ sung thêm một loài chƣa định danh chính xác là Sao đá (Hopea sp.); chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài và chi Táu (Vatica) có 8 loài với 1 phân loài. Theo tác giả, các loài Sao đá (Hopea sp.), Dầu cát (D. condorensis) đƣợc ghi nhận thực sự t n tại ở Việt Nam trong khi các loài khác là Sao xanh (H. helferi), Kiền kiền nhẵn (A. scaphula) không chắc chắn t n tại ở Việt Nam [1,2]. Về thực trạng của họ Dầu, có 23 loài đƣợc ghi nhận mức bị đe dọa theo IUCN (2001), trong đó 2 loài rất nguy cấp (CR) có 3 loài nguy cấp (EN) và 18 loài đang bị đe dọa (VU). Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), có 11 loài đƣợc xếp hạng đe dọa, trong đó có 1 loài rất nguy cấp (CR), 5 loài nguy cấp (EN) và 5 loài đang bị đe dọa (VU) [1,2,3]. Về sự phân bố, theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), các loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố trong các sinh cảnh rừng khô cây họ Dầu, rừng mƣa mùa thƣờng xanh hoặc nửa rụng lá, rừng kín mƣa mùa thƣờng xanh ẩm [6]. Các loài họ Dầu (Diptercarpaceae) là những loài cây gỗ có giá trị kinh tế cao bởi thân thẳng, gỗ tốt và chiếm lĩnh các sinh cảnh tốt. Khoảng giữa những năm 80 của thế kỷ trƣớc, chúng chiếm đến 25% thị phần thƣơng mại gỗ cứng của thế giới, trong đó hơn 80% là Shorea. Bên cạnh đó, nhựa và các hợp chất của câu họ Dầu cũng có giá trị cao nhƣ resin, oleoresin, lac hoặc chiết xuất các chất béo có bơ từ quả [14]. Theo Viện Điều tra quy hoạch rừng (1995), năm 1959 diện tích các loại rừng có cây họ Dầu ở Đông Nam Bộ là 1146 275 ha (chiếm 49% diện tích toàn vùng). Đến năm 1968 giảm xuống còn 834 050 ha (chiếm 36% diện tích
5 khu vực), năm 1982 giảm còn 416 900 ha (bằng 18% diện tích) và năm 1992 chỉ còn 183 081 ha (8%). Rõ ràng là việc bảo t n các loài cây họ Dầu ở nƣớc ta đã trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết, nó góp phần vào việc bảo t n ngu n gen cây rừng đang có nguy cơ tuyệt chủng ở nƣớc ta. 1.2. Cây Dầu song nàng Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) là cây thuộc họ Dầu có kích thƣớc lớn nhất, phân bố ở các tỉnh phía Nam. Gỗ cứng, khá nặng (tỷ trọng 0.8) có giác lõi phân biệt; lõi màu đỏ n u, đƣợc dùng để đóng tài hoặc chế tạo đ gỗ. C y cũng cho loại nhựa nhƣ Dầu rái, dùng trong kỹ nghệ sơn hay đóng tàu. Hiện nay, nơi cƣ trú của c y đang bị tàn phá và thu hẹp, cây bị khai thác mạnh, có xu hƣớng bị tiêu diệt ở từng vùng lớn, đƣợc phân loại vào nhóm VU A1c,d + 2c,d. Vì vậy, việc nghiên cứu và bảo t n ngu n gen của loài này rất cần thiết [2]. Trong tự nhiên, hạt Dầu song nàng chỉ nảy mầm khi đất đủ ẩm nhờ có mƣa lớn. Nếu không gặp mƣa, chúng sẽ mất sức nảy mầm nhanh chóng sau 1 – 2 tuần kể từ khi rụng xuống đất. Hạt Dầu song nàng chỉ nảy mầm trong bóng râm, không nảy mầm trên nền đất trống có nhiều ánh sáng và khô hạn. Ngoài ra, Dầu song nàng có khả năng sinh sản mạnh bằng ch i gốc, nhƣng chỉ bắt gặp ở những gốc chặt có D0 < 20 cm, sinh sản tốt nhất trên những gốc chặt có đƣờng kính từ 3 – 7 cm và chiều cao dƣới 20 cm. Gốc chặt có khả năng sinh ch i nhiều lần. Điều kiện đất ẩm mát dƣới tán rừng có độ tàn che 0,5 – 0,6 hoặc môi trƣờng trong các lỗ trống là tối ƣu cho tái sinh ch i của dầu song nàng. Cây ch i thƣờng hình thành dƣới tán rừng sau khi khai thác hoặc dƣới tán cây mẹ bị đổ gẫy do gió hay chết tự nhiên. Ngoài ra, theo Lê Văn Long (2016) nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũng nhƣ ƣu hợp của Dầu song nàng trên 6 ô tiêu chuẩn, số loài cây gỗ bắt gặp trong những ƣu hợp Dầu song nàng trên đất xám (43 loài) thấp hơn so với
6 ƣu hợp Dầu song nàng trên đất n u đỏ (49 loài). Những loài cây gỗ ƣu thế và đ ng ƣu thế đối với ƣu hợp Dầu song nàng trên đất xám và đất n u đỏ biến động động từ 6 – 9 loài. Mật độ của ƣu hợp Dầu song nàng trên đất n u đỏ (660 cây/ha) còn ở đất xám (616 cây/ha). Những ƣu hợp Dầu song nàng có khả năng tái sinh tự nhiên khá tốt dƣới tán rừng, quá trình tái sinh diễn ra liên tục theo thời gian, phần lớn cây tái sinh có ngu n gốc hạt và có chất lƣợng tốt. Cây tái sinh Dầu song nàng phân bố trên mặt đất theo dạng phân bố cụm [16]. 1.3. Đánh giá đa dạng di truyền bằng sinh học phân tử 1.3.1. Quần thể và tính đa dạng di truyền của quần thể Quần thể là tập hợp một nhóm cá thể của một loài, sống trong cùng một không gian nhất định, có khả năng sinh sản để tạo ra cơ thể mới hữu thụ. Quần thể là đơn vị tiến hóa của loài trong tự nhiên. Các quần thể khác nhau của cùng một loài đƣợc đặc trƣng bởi mật độ cá thể, kiểu ph n bố và đặc biệt là kích thƣớc của quần thể. Kích thƣớc quần thể là số lƣợng cá thể của quần thể. Trong đó, kích thƣớc tối thiểu là số lƣợng cá thể ít nhất mà quần thể cần có để duy trì và phát triển, kích thƣớc tối đa là giới hạn cuối cùng mà quần thể có thể đạt đƣợc để phù hợp với khả năng cung cấp ngu n sống của môi trƣờng. Kích thƣớc của quần thể phụ thuộc vào mức sinh sản, mức tử vong và sự phát tán của cá thể trong quần thể. Trong tự nhiên, quần thể của các loài luôn có xu hƣớng tự điều chỉnh số lƣợng cá thể để duy trì trạng thái ổn định và phù hợp với môi trƣờng. Tác động của con ngƣời đến môi trƣờng sống thƣờng dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc quần thể và thiết lập những quần thể có kích thƣớc nhỏ, cô lập. Nếu trạng thái này t n tại trong khoảng thời gian dài có thể ảnh hửng đến sự sinh trƣởng và sinh sản của quần thể, cuối cùng làm suy giảm khả năng thích nghi của quần thể với môi trƣờng sống của chúng. Đa dạng sinh học là thuật ngữ thể hiện tính đa dạng của các thể sống,
7 loài và quần thể, tính biến động di truyền giữa chúng và tất cả sự tập hợp phức tạp của chúng thành các quần xã và hệ sinh thái. Đa dạng sinh học là kết quả của quá trình tiến hoá tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao g m cả 3 mức độ hệ sinh thái, loài và di truyền. Đa dạng di truyền thể hiện đa dạng về ngu n gen và genotype của mỗi loài. Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài thích nghi đƣợc với những biến đổi bất lợi của môi trƣờng sống và có khả năng tự phục h i trong môi trƣờng sống của chúng. Nhƣ vậy, đa dạng di truyền đƣợc đề cập đến nhƣ là mức độ đa hình di truyền của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó, hoặc đƣợc phản ánh bởi số alen của quần thể tại một địa điểm và thời gian cụ thể hoặc số allele của một loài trong một phạm vi ph n bố địa lý và lịch sử t n tại của nó. Nơi sống của mỗi loài đƣợc thiết lập trong quá trình hình thành loài. Ph n cắt xảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và bị cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh quan khác không giống ban đầu và không phù hợp cho sự t n tại của loài. Nhƣ vậy, ph n cắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống. Tác nh n g y ra ph n cắt bao g m mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, x y dựng khu d n cƣ và khai thác khoáng sản. Ph n cắt đe doạ đến tính thống nhất sinh thái đã đƣợc hình thành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nh n g y ra sự tuyệt chủng. Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hƣởng đến kích thƣớc quần thể và ph n bố lại các mảnh nơi sống còn lại sẽ ảnh hƣởng đến sự phát tán của loài. Hậu quả của quá trình ph n cắt thƣờng làm suy giảm chức năng hệ sinh thái và cuối cùng mất nơi sống. Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơi sống còn lại dễ bị tổn thƣơng và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môi trƣờng sống của chúng bị thay đổi. Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe
8 dọa tuyệt chủng. Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận noãn giữa các cá thể trong quần thể. Ảnh hƣởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cƣờng độ quan hệ cận noãn cao và cuối cùng giảm khả năng thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trƣờng biến đổi và tăng khả năng nhạy cảm đối với dịch bệnh. 1.3.2. Một số kỹ thuật trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử Bảo t n và quản lý của một loài đòi hỏi thông tin về sự đặc điểm sinh thái và đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể. Để có đƣợc thông tin đó, đặc biệt là một sự hiểu biết tốt hơn về các quá trình di truyền, kỹ thuật sinh học đƣợc yêu cầu. Tiềm năng tiến hóa của loài phụ thuộc vào mức độ khác nhau di truyền của nó. Hiểu biết về đa dạng di truyền sẽ cung cấp những thông tin hữu ích để xây dựng chiến lƣợc bảo t n và sử dụng loài một cách bền vững. Đối với loài thực vật, thụ phấn chéo duy trì tiềm năng lớn cho quá trình trao đổi di truyền sẽ duy trì mức độ cao của đa dạng di truyền trong quần thể và loài [28],[29]. Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con ngƣời nghiên cứu sự sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu và bảo t n đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mới nhƣ tiến hóa phân tử, di truyền bảo t n. Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩn thể và loài thực vật, ngoài kỹ thuật isozym, còn có kỹ thuật ADN với các phƣơng pháp nhƣ RAPD, SSR, ISSR, AFLP, RFLP,...  Kỹ thuật RAPD RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn ADN đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991 (Watson và Barker, 2004). Phƣơng pháp này
9 sử dụng cùng một số m i ngẫu nhiên (m i ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide g m khoảng 8 đến 20 Nucleotide) để thực hiện phản ứng PCR nhằm nh n các đoạn ADN đặc trƣng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu đƣợc g m các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thƣớc và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nh n đƣợc các đoạn khác biệt nhau [5,18,28]. *Ưu điểm của kỹ thuật RAPD Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gen của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lƣợng ADN khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nh n bản cao. Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp. Trong nghiên cứu, kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị ph n tử có độ tin cậy cao [4]. * Những hạn chế của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp). Khả năng nh n bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao  Kỹ thuật RFLP RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn). Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhau phân biệt đƣợc bằng điện di đ , các đoạn cắt còn đƣợc gọi là các “dấu vân
10 tay” đặc trƣng cho từng phân tử ADN. Bản đ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định ngu n gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật [5,18]. Kỹ thuật này đƣợc dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay. Kỹ thuật RFLP đƣợc sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật... Kỹ thuật RFLP đƣợc thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn. DNA của mẫu nghiên cứu sau khi đƣợc tách chiết và tinh sạch sẽ đƣợc cắt với cùng 1 số loại enzyme giới hạn. Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lƣợng và kích thƣớc các đoạn cắt ADN khác nhau, những bộ gen giống nhau thì sẽ cho ra số lƣợng, kích thƣớc các đoạn cắt giống nhau, kích thƣớc vá số lƣợng các đoạn cắt này sẽ quan sát đƣợc trên điện di đ .  Kỹ thuật SSR Chỉ thị SSR (simple sequence repeat) hay còn gọi là vi vệ tinh (Microsatellite), là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ g m 1 – 6bp. Hiện tƣợng các SSR trong cơ thể sinh vật nh n chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật. Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lƣợng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lƣợng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thƣờng có các kiểu lặp lại: - Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau. - Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác.
11 - Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau. Thông thƣờng, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể nhƣ vùng t m động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình ph n bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Phƣơng pháp xác định đa hình SSR là nhờ sự nh n bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn m i bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR đƣợc phát hiện bởi sự nh n đoạn DNA nhờ phản ứng PCR. Kích thƣớc sản phẩm PCR đƣợc xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền của c y tr ng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ đến năng suất, lập bản đ , nghiên cứu locus tính trạng số lƣợng. Thuận lợi to lớn của ph n tích SSR là phƣơng pháp này biểu hiện số lƣợng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khả năng ph n biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus đƣợc kiểm tra làm cho phƣơng pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm ph n tích mối quan hệ di truyền. SSR là marker đ ng trội, do đó, dị hợp tử có thể dễ dàng đƣợc xác định trong quá trình thực nghiệm. tính đ ng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác nhƣ RAPD và AFLP. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những ph n tích phả hệ, sự lai giống, dòng gen trở nên dễ dàng hơn. Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer chi phí cao liên quan đến trình tự m i chính xác cho loài quan t m không hề có sẵn.
12 1.4. Các nghiên cứu đa dạng di truyền họ Dầu 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Để bảo t n và quản lý các loài cây Dầu, các thông tin về đặc điểm sinh thái và đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài là cần thiết, và đóng vai trò quan trọng góp phần đƣa ra các giải pháp bảo t n một cách phù hợp. Nghiên cứu ảnh hƣởng của khai thác chọn dẫn đến mật độ thấp trong tự nhiên đã làm tăng khả năng thụ phấn cận noãn của nhiều loài cây Dầu nhƣ Shorea megistophylla ở Sri Lanka (Murawski et al., 1994), Drybalanops aromatica (Lee, 2000), Shorea curtisii và Dryobalanops aromatica (Wickneswari et al., 2004), Neobalanocarpus heimii (Naito et al., 2005; 2008), Shorea leprosula (Fukue et al., 2007) và S. curtisii (Obayashi et al., 2002) ở rừng nhiệt đới Malaysia. Số lƣợng quả của loài S. siamensis đƣợc sản sinh ở nơi sống bị tác động mạnh thấp hơn ở nơi ít bị tác động (Ghazhoul et al., 1998). Kitamura et al. (1994) đã đề cập đến mức độ thụ phấn chéo là cao (82%) của loài Dryobalanops aromatica ở Brunei. Năm 2006, Lee và cộng sự đã nghiên cứu và phối hợp thống kê các thông số hệ thống trong rừng rậm nhiệt đới của loài Shorea leprosula Miq (Dipterocarpaceae) từ rừng nhiệt đới thấp Malaysia. Cung cấp các đặc điểm sinh học đặc trƣng của loài Shorea leprosula Miq (Dipterocarpaceae) tại rừng nhiệt đới Malaysia. Cui-Ping Cao và cộng sự năm 2009 đã nghiên cứu biến đổi di truyền trong chín loài Shorea (Dipterocarpaceae) ở Indonesia bằng chỉ thị AFLP. Công trình nghiên cứu 274 cây với 84 locus AFLP đa hình tại 2 địa điểm khác nhau. Từ kết quả nghiên cứu độ đa dạng di truyền cho thấy sự khác biệt tần số cao giữa cac loài và giữa các vùng trong các loài. Thông tin trình tự của các dấu hiệu này có khả năng sử dụng để phát triển các dấu hiệu phản ứng chuỗi polymerase cụ thể để xác định danh tính loài [37]. Yoshihiko Tsumura và cộng sự năm 2011 đã nghiên cứu cơ sở dữ liệu