Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:99

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng quy trình nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ THU HÀ 2. TS. NGUYỄN XUÂN VŨ Thái Nguyên - 2020
i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro” là trung thực, được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên. Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép công bố. Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung trong đề tài của mình. Học viên
ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS. Trần Thị Thu Hà và TS. Nguyễn Xuân Vũ đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học Viên
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................vi DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. viii MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................2 Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3 1.1. Giới thiệu về Chi Sói rừng và loài cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) ............................................................................................................................3 1.1.1.Phân loại, phân bố ................................................................................................ 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học ........................................................................................3 1.1.3. Giá trị của cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) .............................. 4 1.2. Cơ sở việc định danh loài và xác định quan hệ di truyển ......................................5 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng.....................................................7 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng trên thế giới ............................. 7 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng ở nước ta .................................8 1.4. Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống).......................................9 1.4.1. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................10 1.4.2. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................ 10 1.4.3. Các phương pháp nuôi cấy mô .........................................................................10 1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật ..............................................11 1.4.5. Các giai đoạn trong nhân giống invitro ............................................................ 15 Chương 2.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........18 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................18
iv 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ..........................................................................................18 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................18 2.3.1. Điều tra đánh giá thực trạng phân bố và thu thập mẫu nghiên cứu ..................18 2.3.2. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái ......................................................................................................................21 2.3.3. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA .......22 2.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Sói rừng ................................................25 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................28 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................29 3.1. Điều tra, đánh giá thực trạng phân bố, giá trị sử dụng của của loài Sói rừng và thu thập mẫu. ........................................................................................... 29 3.2. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái .........34 3.2.1. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Xín Mần .......................34 3.2.2. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Mèo Vạc .......................35 3.2.3. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Quản Bạ ........................36 3.2.4. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Hoàng Su Phì ...............37 3.2.5. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Vị Xuyên ......................38 3.3. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chị thị DNA...................40 3.3.1. kết quả tách chiết DNA tổng số của mẫu Sói rừng nghiên cứu ........................40 3.3.2. Kết quả PCR của mẫu Sói rừng nghiên cứu .....................................................41 3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của mẫu Sói rừng nghiên cứu ..............42 3.3.4. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu ............................................................................................ 43 3.4. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sói rừng .........................................45 3.4.1. Chọn vật liệu khởi đầu ......................................................................................45 3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng .........................................................................................................45 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng ........................................................................................... 47
v 3.4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh đến khả năng ra rễ chồi Sói rừng .......................................................................................55 3.4.5. Nghiên cứu đưa cây ra nhà kính .......................................................................58 3.4.6. Chăm sóc cây giai đoạn in vitro..........................................................................6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................64 1.Kết luận ....................................................................................................................64 2. Kiến nghị .................................................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................66
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ, thuật Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ ngữ viết tắt (Cả tiếng anh và tiếng việt) DNA Deoxyribonucleic acid PCR Plolemerase Chain reaction SR Sói rừng Cs Cộng sự IAA Indole - 3- acetic acid NAA Naphthylacetic acid BAP Benzylaminopurine IBA Indo – 3 – butyric acid MS Murashige Skoog CT Công thức LSD Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa CV Coeficient of Variation – Hệ số biến động
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Đặc điểm phân bố Sói rừng theo tuyến điều tra .........................................31 Bảng 3.2. Đặc điểm mẫu thu thập ...............................................................................33 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần ...........34 Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc ...........35 Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ ...........36 Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hoàng Su Phì ...37 Bảng 3.7. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên ..........38 Bảng 3.8. Danh sách 15 mẫu lá Sói rừng trong nghiên cứu .......................................40 Bảng 3.9. Độ dài trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu .......................................42 Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu và 2 mẫu tham chiếu ...................................................................................................................44 Bảng 3.11. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng (sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................46 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng (sau 4 tuần nuôi cấy) ....................................................................................48 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi sau 4 tuần nuôi cấy (sau 4 tuần nuôi cấy) ...................................................................50 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến hệ số nhận chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) .........................................................................52 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin với IBA đến hệ số nhận chồi sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................................................................54 Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng ...............................................................................................................56 Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng .......................................................................................................................57 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng in vitro sau 8 tuần theo dõi ..........................................................................................59
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Sói rừng .................................................................................................3 Hình 3.1. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần .................................................35 Hình 3.2. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc .................................................36 Hình 3.3. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ .................................................37 Hình 3.4. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hoàng Su Phì .........................................38 Hình 3.5. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên ................................................39 Hình 3.6. kết quả tách chiết DNA tổng số của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu .............41 Hình 3.7. Kết quả PCR của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với cặp mồi ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA .......................................................42 Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra ..............44 Hình 3.9. Kết quả khử trùng mẫu đoạn thân Sói rừng bằng HgCl2 0,1% .................47 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng.............49 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng ................................................................................................................51 Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến đến hệ số nhận chồi cây chồi Sói rừng ........................................................................................................53 Hình 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng ....................................................................................................55 Hình 3.14. Ảnh hưởng của NAA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng.............................. 57 Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng ............................... 58 Hình 3.16. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng ........59 Hình 3.17. Sói rừng giai đoạn sau in vitro ....................................................................8
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây Sói Rừng còn gọi là cây sói nhẵn, cây cửu tiết trà, cây thảo san hô, cây quan âm trà, cây tiếp cốt mộc, cây cửu tiết phong, cây cửu tiết lan, cây sơn hồ tiêu, cây cốt thuộc họ Hoa sói (Chloranthaceae). Sói Rừng là loại cây giàu dược tính nên được khai thác để sử dụng làm thuốc chữa trị nhiều bệnh. Đông y cho rằng, cây sói rừng có vị đắng, cay, tính hơi ấm. Có tác dụng kháng khuẩn tiêu viêm, khu phong trừ thấp, hoạt huyết chỉ thống. Chủ trị viêm phổi, viêm phế quản, viêm ruột thừa cấp tính, viêm dạ dày ruột cấp tính, nhiễm khuẩn, phong thấp đau nhức, đòn ngã tổn thương, gãy xương...Trong dân gian, thường dùng rễ cây này ngâm rượu uống để chữa tức ngực, đau nhức xương khớp; còn dùng toàn cây sắc uống trị cảm mạo, kinh nguyệt không đều và viêm phổi. Lá sắc uống trị ho, giã đắp chữa rắn cắn. Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam và Malaysia. Ở Việt Nam, cây Sói rừng mọc hoang ở khắp nơi, những khu vực đất ẩm ướt, mát, hốc đất trên núi đá. Sói rừng phân bố ở các tỉnh như Hà Giang, Yên Bái, Phú Thọ, Bắc Kạn, ... Điển hình ở Hà Giang có trên 1.100 loài cây dược liệu trong tổng số hơn 5000 loài cây dược liệu của cả nước; được đánh giá là vùng trọng điểm về đa dạng cây dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao và là vùng trọng điểm của nước ta để phát triển cây dược liệu gắn với phát triển du lịch sinh thái vùng cao. Hà Giang có điều kiện tự nhiên, sinh thái rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển nhiều loại cây dược liệu trong đó có cây Sói rừng, đặc biệt trong sản xuất giống, bảo tồn và sản xuất các loài dược liệu quý hiếm. Tuy nhiên, hiện nay các loài cây thuốc quý đang bị khai thác cạn kiệt và nhiều loài đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Vì vậy, việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu, đặc biệt là các loài dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao đã và đang được tỉnh Hà Giang xem là nhiệm vụ trọng tâm và cấp bách theo Kết luận số 71-KL/TW ngày 24/9/2014 của Ban Bí thư Trung ương và triển khai mục tiêu phát triển bền vững nguồn tài nguyên dược liệu của tỉnh và vùng Tây Bắc. Ở nước ta công tác bảo tồn các loài cây dược liệu chưa thực sự gắn với phát triển. Để phát triển, công
2 tác chọn tạo giống, công nghệ nhân và nuôi trồng giống tốt cung cấp nguyên liệu chất lượng cần được quan tâm. Chính vì vậy, việc cải tiến áp dụng công nghệ trong bảo tồn, nhân giống là một giải pháp hữu hiệu giải quyết vấn đề về phát triển dược liệu hiện nay. Theo báo cáo của hầu hết các tỉnh ở vùng núi phía Bắc, việc bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu tại địa phương còn nhiều hạn chế từ giống cho đến trồng và thu hoạch. Giống sử dụng không rõ nguồn gốc, giống tạp, chất lượng chưa cao, nhân giống bằng phương pháp truyền thống nên giống không được đảm bảo cả số lượng và chất lượng. Từ những lý do đó tôi thực hiện nghiên cứu "Nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro” làm cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển loài cây Sói rừng của tỉnh Hà Giang. 2. Mục tiêu nghiên cứu * Mục tiêu chung Xây dựng quy trình nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. * Mục tiêu cụ thể - Điều tra, đánh giá, thu thập mâu nghiên cứu - Nhận dạng được loài cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái - Nhận dạng được đúng loài cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA - Nghiên cứu được chất khử trùng và thời gian khử trùng cho tỷ lệ mẫu vô trùng cao - Nghiên cứu được chất kích thích sinh trưởng phù hợp đến khả năng nhân nhanh chồi cây Sói rừng - Nghiên cứu được chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) cho giai đoạn ra rễ chồi cây Sói rừng - Nghiên cứu được loại giá thể phù hợp cho cây Sói rừng giai đoạn sau in vitro 3. Địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Đại học Nông lâm Thái Nguyên
3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về Chi Sói rừng và loài cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.1.1.Phân loại, phân bố Sói rừng có tên khoa học là: Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai. Giới: Plantae; Bộ: Chloranthales; Họ: Chloranthaceae; Chi: Sarcandra; Loài: Glabra (Đỗ Huy Bích, 2011) [3]. Ngoài ra còn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum, Chlorathus glaber (Thunb.) makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc họ Hoa sói Chloranthaceae. Ở Việt Nam cây Sói rừng còn có một số tên gọi khác như: sói lãng, sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên, thảo sách hồ, tiếp cốt mộc (Võ Văn Chi, 2012) [4]. Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam và Malaysia. Ở Việt Nam cây mọc từ Hà Giang (Vị Xuyên), Sơn La (Mộc Châu), Cao Bằng (Thạch An, Nguyên Bình, Tĩnh Túc), Lạng Sơn (Hữu Lũng, Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Hà Tây), Thừa Thiên Huế, Kom Tum (Đác lây, KonPlong), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc) (Võ Văn Chi, 1996) [5]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học Hình 1.1. Cây Sói rừng
4 Cây Sói rừng có chiều cao 1 - 2 mét, thân nhẵn, các mấu hơi phồng. Nhánh cây tròn, không có lông, các lá mọc đối, phiến dài hình bầu dục hay hình ngọn giáo, chiều dài 7 - 20 cm và rộng 2 - 8 cm với 5 - 7 cặp gân bên. Mép lá có răng cưa nhọn và thô. Cuống lá dài 5 - 8 mm. Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu trắng không có cuống và có một nhị. Bầu nhụy có hình trứng và không có vòi. Cây ra quả mọng nhỏ, hình gần tròn đường kính 3 - 4 mm, khi chín có màu đỏ hay đỏ gạch. Cây ra hoa vào tháng 6 - 7 và quả chín vào tháng 8 - 9. Sói rừng mọc hoang ở vùng núi đất, ở rìa rừng và ven đồi ẩm nhiều nơi và lên đến độ cao 1000m. Thu hái toàn cây vào mùa hạ thu, có thể dùng tươi hoặc phơi khô (Võ Văn Chi, 1997) [5]. 1.1.3. Giá trị của cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) 1.1.3.1. Giá trị kinh tế Sói rừng là cây dược liệu có hiệu quả kinh tế cao đang thu hái ở nhiều tỉnh miền núi nước ta. 1.1.3.2. Giá trị dược liệu Theo Đông y, cây Sói rừng có vị đắng, tính hơi ấm, có tác dụng hoạt huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian, rễ cây được ngâm rượu, uống chữa đau tức ngực. Lá được sắc uống hỗ trợ trị bệnh lao, hoặc giã đắp hỗ trợ trị rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp hỗ trợ trị vết thương, mụn nhọt, phong thấp, đau nhức xương. Theo Perrot và Hurrier (1906), toàn bộ cây sói rừng cũng được dùng để hỗ trợ điều trị bệnh động kinh. Kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy, sói rừng có tác dụng ức chế đối với tụ cầu khuẩn vàng staphylococcus aureus, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn bacillus coli, trực khuẩn mủ xanh bacillus pyocyaneus; trực khuẩhn thương hàns… Lá có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất; rễ và cành tươi có tác dụng mạnh hơn rễ và cành khô. Hỗ trợ điều trị ho, suy nhược, viêm khớp, đau nhức xương, nắn bó gẫy xương làm giảm u bướu, giảm ứ đọng máu, cải thiện chức năng tuyến tụy, hỗ trợ trị đau dạ dầy. Toàn cây Hoa sói rừng có cả tác dụng chống ung thư, lẫn tác dụng kháng khuẩn, nên dùng để hỗ trợ trị ung thư có biến chứng nhiễm khuẩn rất tốt. Đã thấy có hiệu quả tốt hơn đối với các loại ung thư dạ dầy, ung thư gan, ung thư tuyến tụy, ung thư thực quản, bệnh bạch cầu và sarcom lưới dòng lympho (Mai Hải Yến, 2010) [15]. Cây Sói rừng cũng có tác dụng mạnh chống lại ôxi hóa, giúp giải nhiệt, tiêu độc, làm tăng sự sản xuất các tiểu cầu trong máu (từ đó giúp tiêu trừ các huyết khối),
5 tăng tuần hoàn máu và chống viêm. Cũng có các tài liệu cho rằng S. glabra giúp giảm mệt mỏi trong điều trị ung thư và được đề xuất sử dụng như một giải pháp thay thế trong điều trị, nhưng chưa có thử nghiệm nào chứng thực điều này. Sói rừng được sử dụng như một tác nhân dự phòng hóa học, trên bệnh nhân điều trị bằng tác nhân hóa trị liệu, do có cả 2 tác dụng tăng cường miễn dịch và ức chế phát triển của tế bào ung thư. Nước sắc toàn cây sói rừng có tác dụng thực bào, một dạng của tác dụng chống ung thư, nhưng tinh dầu của sói rừng, lại có tác dụng ức chế thực bào, giống như tác dụng không mong muốn của cyclophosphamid, vì vậy trước khi sử dụng sói rừng, nên đun sôi thật kỹ, để loại bỏ tinh dầu. isoilaxidin chiết xuất từ cây sói rừng, có tác dụng ức chế manh bệnh bạch cầu dòng lympho. Một số cách sử dụng cây Sói rừng: Hỗ trợ phòng cảm mạo: Dùng sói rừng 10 – 15g, mùa đông thêm tía tô 6g, mùa hè thêm kim ngân hoa 6g, sắc nước uống thay trà trong ngày. Hỗ trợ điều trị các chứng viêm nhiễm (có tác dụng chống viêm rất tốt): Mỗi ngày dùng 30 - 40g cành lá sói rừng tươi, sắc lấy nước, chia 3 lần uống, liên tục 2 - 3 ngày hoặc có thể kéo dài ngày hơn. Hỗ trợ điều trị đau lưng: Dùng cành lá sói rừng 10 - 15g, sắc với nửa rượu nửa nước, chia ra uống trong ngày. Hỗ trợ điều trị đòn ngã tổn thương, gãy xương, viêm khớp xương do phong thấp: Dùng cây tươi, giã nát, sao rượu, đắp; hoặc dùng 15-30g rễ sắc với nước hoặc ngâm rượu uống. Hỗ trợ điều trị ngoại thương xuất huyết: Dùng cây tươi, giã nát, đắp; hoặc dùng 15 - 30g rễ, ngâm rượu uống. Hỗ trợ điều trị vết thương loét, không liền miệng: Dùng cành lá, lượng thích hợp, nấu nước rửa, ngày 1- 2 lần. Hỗ trợ điều trị bỏng: Dùng lá sói rừng, phơi khô, tán mịn, trộn thêm 2 phần dầu hạt sở hoặc dầu vừng; hàng ngày bôi vào chỗ bị bỏng. 1.2. Cơ sở việc định danh loài và xác định quan hệ di truyển Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất
6 giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướng nghiên cứu được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựa trên việc nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật. Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài. Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan như ti thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như protein, enzyme. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau. Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại protein nào có ý nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hướng nghiên cứu. Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), các kỹ thuật phân tích so sánh trình tự nucleotide các đoạn DNA như phương pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở phản ứng PCR như SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) (Harvey và cộng sự, 1996; Roman và cộng sự, 2003), đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), phân tích trình tự DNA … (Phạm Hồng Sơn, 2006; Lê Duy Thành và cộng sự, 2005) đã giúp giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài [12], [13], [25].
7 Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S hay được dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật. So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào. Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu (Borsch và cộng sự, 2003; Shaw và cộng sự, 2007; Van và cộng sự, 2000) [16]. Trong nhiều năm gần đây, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật (Chase và cộng sự, 2005; Kress và cộng sự, 2008) [17]. 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng trên thế giới Sói rừng có thể được nhân giống hữu tính bằng hạt, hoặc vô tính bằng giâm hom, nuôi cấy mô tế bào. Ở Trung Quốc, S. glabra được nhân giống bằng giâm hom. Cây 2 năm tuổi cho tỷ lệ hom ra rễ đạt 88,7% sử dụng hom nhúng vào dung dịch 200mg/L ABT-1 trong 30 phút (Qiu, 2012; Zhu et al., 2010); 82% khi xử lý với dung dịch 200mg/L IBA (Liu et al., 2008) [24]. Ở Trung Quốc, cây được dùng để chữa một số bệnh ung thư: ung thư tụy, dạ dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo, kinh nguyệt không đều, hoa được dùng để ướp trà. Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật Bản kết luận rằng thành phần hóa học chủ yếu của cây Sói rừng là: sesquiterpen
8 lactose, curmarin, flavonoid (Collons, 1992). Hiện các tài liệu tìm thấy về cây Sói rừng chỉ tập trung nghiên cứu về các hoạt chất hóa học của loài trong hỗ trợ điều trị bệnh. Kang et al., (2008) đã nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết S. glabra và gây chết tế bào gây ung thư biểu mô mũi - họng ở người. Kết quả cho thấy dịch chiết Sói rừng ngăn cản sự phát triển khối u in vivo [22]. Zhu et al., (2010) đã nghiên cứu tạo rễ in vitro trên môi trường MS, kết quả NAA không có tác dụng cải thiện ra rễ. Môi trường tốt nhất cho ra rễ là 1/2MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose30 g/L hoặc 1/4 MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L[29]. Li et al., (2008) đã nhân giống in vitro cây Sói rừng trên môi trường MS, 80 % chồi phát sinh trên môi trường MS+BA 1.0 mg/L. Môi trường cấy chuyển là MS + BA 2.0 mg/L +NAA0 3 mg/L cho hệ số nhân chồi là 6.2. Môi trường tốt nhất cho ra rễ là 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L với tỷ lệ 100 %. Zhu et al., (2007) đã thu được mẫu cấy vô trùng bằng cách nhúng mẫu trong cồn 75% trong 30 giây, sau đó bằng HgCl2 0.1% trong 10 phút. Tiếp đó rửa bằng nước vô trùng và nhúng vào dung dịch 120 mg/l rifampicin trong 4 ngày; Cuối cùng mẫu được nhúng vào HgCl2 0.1% và rửa bằng nước vô trùng và cấy vào môi trường tái sinh chồi [31]. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng ở nước ta Mai Hoàng Oanh (2016) đã nghiên cứu mẫu Sói rừng thu nhận từ Lạng Sơn, tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số. Nhân bản thành công hai vùng gen ITS và rpoC1 bằng phương pháp PCR và tạo dòng thành công hai gen nhân bản được, đã xác định được trình tự nucleotide của 2 đoạn gen rpoC1 và ITS [9]. Bùi Văn Trọng và cs (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây Sói rừng (Sarcandra glaba (Thunb.) Nakai.) tại Lâm Đồng. Nhóm tác giả đã sử dụng NAA ở nồng độ 1% cho kết quả giâm hom Sói rừng tốt nhất đạt 86.67%, hom sống và ra rễ, số lượng rễ trung bình là 5.08 rễ/hom, chiều dài rễ trung bình là 3,68 cm so với đối chứng (66,67%; 3,9; 3,65 cm, tương ứng) [10].
9 Le Hong En et al., (2016) đã nghiên cứu nhân giống Sói rừng bằng giâm hom. Tác giả đã sử dụng IBA, IAA, NAA để nghiên cứu tác dụng của chất kích thích ra rễ. Nồng độ IBA 1-1,5% cho ra rễ tốt nhất. Hom bánh tẻ cho ra rễ tốt hơn các loại hom khác. Nguyễn Quỳnh Anh (2013), đã Nghiên cứu ứng dụng cây Sói rừng ở Cao Bằng để hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư. Tác giả đã nghiên cứu quy trình bào chế và dạng bào chế thành phẩm từ cây Sói rừng. Sau 3 năm nghiên cứu đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, một số hoạt tính sinh học, độc tính và tác dụng điều trị ung thư trên động vật thực nghiệm của bột và lá cây Sói rừng Sarcandra glabra (Thunb) Nakai, thu hái ở vùng rừng núi xã Bạch Đằng, huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng. Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được quy trình Nghiên cứu làm viên tế; Nghiên cứu làm dạng thuốc bột (thuốc tán); Nghiên cứu làm dạng cao thuốc (cao nước) [1]. 1.4. Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống) Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [11]. Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau. Nguyên lý cơ bản của nuôi cấy mô là tính toàn năng của tế bào (Totipotency). Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô - tế bào thực vật. Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
10 1.4.1. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật có những ưu điểm sau (Dương Công Kiên, 2006): - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp từ 1 cây sau khi được nuôi cấy từ 1 – 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây. - Sản phẩm cây đồng nhất: Tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp. - Tiết kiệm không gian: Không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất truyền thống trên đồng ruộng. - Lợi thế về vận chuyển: Cây con có kích thước nhỏ, vì vậy có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi. - Sản xuất được quanh năm: Qúa trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ. 1.4.2. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật - Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều năng lượng,….nên giá thành sản xuất con giống cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. - Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: cây con nuôi cấy có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. 1.4.3. Một số phương pháp nuôi cấy mô Các phương pháp thường được áp dụng phổ biến như sau (Nguyễn Như Khanh, 2011, Vũ Văn vụ, 2009) [14]: - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Trong nuôi cấy mô, một phương thức đơn giản và thường hay được sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Trên thực tế người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm. Đó có thể đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách, mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh.