Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 và bước đầu khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:129

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là sản xuất chế phẩm nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 để ứng dụng chế biến tiêu sọ từ tiêu chín và tiêu đen ở quy mô phòng thí nghiệm. Xây dựng quy trình công nghệ chế biến tiêu sọ từ tiêu đen và tiêu chín bằng chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 nhằm nâng cao chất lượng của sản phẩm hồ tiêu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 và bước đầu khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hiền Trang. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Oanh Kiều PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hiền Trang đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn, biên tập bài báo và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị cũng như kinh phí để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn Phòng Sau Đào tạo, Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Huế đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ nhiệm Khoa, các thầy cô giáo, các sinh viên nghiên cứu khoa học trong khoa Cơ khí - Công nghệ, trường Đại học Nông Lâm Huế đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài luận văn. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Oanh Kiều PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT Nghiên cứu này đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 trên môi trường bán rắn cám - trấu, trên cơ sở đó ứng dụng chế phẩm trong xử lý vỏ tiêu đen và tiêu chín cũng như đánh giá chất lượng của sản phẩm tiêu sọ sau quá trình chế biến. Kết quả cho thấy các điều kiện thích hợp để chủng T. longibrachiatum H18 sinh tổng hợp cellulase và sinh khối cao nhất trên môi trường lỏng ở nồng độ cơ chất CMC: 1% và nồng độ NaNO3: 0,4% ở nhiệt độ 28oC, pH ban đầu là 5,5 sau 144 giờ nuôi cấy. Bổ sung 0,3% tỷ lệ sinh khối vào môi trường bán rắn cám - trấu với tỷ lệ cám : trấu là 7 : 3, nuôi cấy với điều kiện độ ẩm môi trường cám trấu là 55% trong 3 ngày thì tạo được chế phẩm T. longibrachiatum H18 với hoạt độ cellulase cao 5909,7 IU/g. Kết quả phân tích chất lượng chế phẩm T. longibrachiatum H18 không có độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 cho thấy chế phẩm an toàn khi ứng dụng vào sản xuất tiêu sọ. Chế phẩm T. longibrachiatum H18 được ủ với tiêu đen và tiêu chín nguyên liệu có tác dụng đáng kể đến khả năng bóc vỏ trong quá trình sản xuất tiêu sọ so với phương pháp truyền thống (ngâm nước). Hiệu suất bóc vỏ tiêu đen của chế phẩm T. longibrachiatum H18 cao nhất đạt gần 99% sau 4 ngày xử lý, với độ ẩm nguyên liệu tiêu đen ban đầu 45%, nhiệt độ ủ 28oC và hàm lượng chế phẩm bổ sung là 2%. So với quy trình bóc vỏ tiêu theo phương pháp truyền thống, sử dụng chế phẩm T. longibrachiatum H18 ở hàm lượng 2% đã rút ngắn thời gian ủ từ 7 ngày xuống còn 4 ngày. Hiệu suất bóc vỏ tiêu chín gần 100% sau 36 giờ xử lý với tỷ lệ chế phẩm thêm vào là 2%. Sản phẩm tiêu sọ đi từ tiêu đen và tiêu chín được xử lý bằng chế phẩm T. longibrachiatum H18 đạt chất lượng theo quy định của TCVN 7037:2002 với giá trị về hàm lượng tro tương ứng: 2,55% và 2,65%; hàm lượng piperin: 8,50% và 8,70%; hàm lượng tinh dầu: 1,86% và 1,92%, ngoài ra không thấy sự hiện diện của tổng số vi khuẩn hiếu khí (TSVKHK), E. coli, Coliforms và Samonella trong các sản phẩm tiêu sọ. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CÁM ƠN ................................................................................................................. ii TÓM TẮT...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..................................................................................ix MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ........................................................2 Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .............................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Trichoderma longibrachiatum ..............................3 1.1.1. Tổng quan về Trichoderma ...................................................................................3 1.1.2. Tổng quan về Trichoderma longibrachiatum .......................................................7 1.2. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE ............................................................................9 1.2.1. Khái niệm ..............................................................................................................9 1.2.2. Nguồn gốc..............................................................................................................9 1.2.3. Cơ chế tác động ...................................................................................................10 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp cellulase ........................................10 1.2.5. Ứng dụng của cellulase .......................................................................................13 1.3. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT VỚI MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ..........15 1.3.1. Khái niệm, ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt ...........................15 1.3.2. Nguyên liệu sử dụng ..........................................................................................15 1.3.3. Kỹ thuật nuôi cấy.................................................................................................17 1.4. TỔNG QUAN VỀ TIÊU ........................................................................................17 1.4.1. Giới thiệu về cây hồ tiêu......................................................................................17 1.4.2. Tổng quan về hạt tiêu ..........................................................................................18 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v 1.4.3. Tình hình sản xuất hồ tiêu trong nước và trên thế giới .......................................19 1.4.4. Các sản phẩm tiêu trên thị trường .......................................................................21 1.4.5. Quá trình sản xuất tiêu sọ tại Việt Nam ..............................................................23 1.4.6. Chỉ tiêu chất lượng tiêu sọ ...................................................................................24 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .............................................................................................................25 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................................25 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .......................................................................27 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 29 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .......................................................29 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................29 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................29 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................29 2.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 ......................................................................................................29 2.2.2. Nội dung 2: Khảo sát khả năng bóc vỏ hạt tiêu đen và tiêu chín của chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 ................................................................................31 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................32 2.3.1. Phương pháp vi sinh ............................................................................................32 2.3.2. Phương pháp vật lý ..............................................................................................35 2.3.3. Phương pháp hóa lý .............................................................................................35 2.3.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................38 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................45 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................46 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM Trichoderma longibrachiatum H18 ..................................................................46 3.1.1. Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp đến khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp cellulase của Trichoderma longibrachiatum H18 trên môi trường lỏng .....46 3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma longibrachiatum H18 trên môi trường bán rắn (cám - trấu) ...55 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi 3.1.3. Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 và phân tích chất lượng chế phẩm trong quá trình bảo quản .................................62 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BÓC VỎ TIÊU ĐEN VÀ TIÊU CHÍN CỦA CHẾ PHẨM Trichoderma longibrachiatum H18 .................................................68 3.2.1. Kết quả khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu đen của chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18......................................................................................................68 3.2.2. Kết quả khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu chín của chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 .......................................................................................................78 3.2.3. Phân tích một số chỉ tiêu chất lượng sản phẩm của tiêu sọ ................................82 Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................85 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................85 4.2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................................86 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA Analysis of Variance A. niger Aspergillus niger A. oryzae Aspergillus oryzae A. flavus Aspergillus flavus A. fumigatus Aspergillus fumigatus A. tereus Aspergillus tereus B. subtilis Bacillus subtilis CFU Colony-forming unit CMC Carboxylmethyl cellulose CMCase Carboxylmethyl cellulase Cs cộng sự DNS acid dinitro salixylic G gam HđCellulase Hoạt độ cellulase H. avenae Heterodera avenae IPC International Pepper Community IU International Unit Ml mililit µl microlit Nm nanomet Mg miligam MPN Most Probable Number OD Optical Density P. brasilianum Penicillium brasilianum P. palmivora Penicillium palmivora PGA Potato Glucose Agar PDA Potato Dextrose Agar T. hamatum Trichoderma hamatum T. harzianum Trichoderma harzianum T. koningii Trichoderma koningii T. longibrachiatum Trichoderma longibrachiatum T. virens Trichoderma virens T. reesei Trichoderma reesei T. viridae Trichoderma viridae UV Ultra Violet PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học trung bình của cám ......................................................16 Bảng 1.2. Các chỉ tiêu vật lý của hạt tiêu sọ .................................................................24 Bảng 1.3. Các chỉ tiêu hóa học của hạt tiêu sọ ..............................................................24 Bảng 2.1. Tỷ lệ (% tổng khối lượng) và kí hiệu các thành phần cám - trấu trong môi trường nuôi cấy ..............................................................................................................34 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất lượng chế phẩm T. longibrachiatum H18 ..61 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng chế phẩm T. longibrachiatum H18 .61 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra độc tố aflatoxin trong mẫu chế phẩm sau khi bảo quản ....67 Bảng 3.4. Hoạt độ cellulase của chế phẩm T. longibrachiatum H18 sau thời gian bảo quản ........................................................................................................................68 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng piperin và độ ẩm tiêu sọ .........75 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian sấy đến hàm lượng piperin và độ ẩm tiêu sọ........76 Bảng 3.7. Chất lượng của sản phẩm tiêu sọ ..................................................................83 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Các chủng nấm trong nhánh Longibrachiatum thuộc chi Trichoderma phát triển trên môi trường PDA ...............................................................................................4 Hình 1.2. Vai trò của Trichoderma .................................................................................5 Hình 1.3. Khuẩn ty nấm T. longibrachiatum sau 2 ngày nuôi cấy (a) và sau 4 ngày nuôi cấy (b) ............................................................................ Error! Bookmark not defined. Hình 1.4. Mô hình của cellulase ......................................................................................9 Hình 1.5. Cơ chế tác động của cellulase .......................................................................10 Hình 1.6. Cám (a) và trấu (b) ........................................................................................17 Hình 1.7. Cây hồ tiêu và chùm quả tiêu ........................................................................18 Hình 1.8. Tiêu chín, tiêu xanh, tiêu trắng, tiêu đen (từ trái sang phải) ........................19 Hình 1.9. Khối lượng và giá trị xuất khẩu tiêu trắng trong 2 tháng đầu năm 2014 - 2016 ... 20 Hình 1.10. Các nước nhập khẩu tiêu trắng Việt Nam lớn nhất tháng 2/2016 ...............20 Hình 1.11. Dầu tiêu .......................................................................................................21 Hình 1.12. Oleoresin tiêu...............................................................................................21 Hình 1.13. Tiêu bột ........................................................................................................21 Hình 1.14. Tiêu xanh ngâm nước muối .........................................................................22 Hình 1.15. Tiêu xanh đông khô .....................................................................................22 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện thích hợp đến khả năng sinh tổng hợp cellulase và sinh trưởng, phát triển của T. longibrachiatum H18 .. 39 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chế phẩm T. longibrachiatum H18 trên môi trường bán rắn (cám - trấu) ....................................................................................................................40 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu đen của chế phẩm T. longibrachiatum H18 ................................................................................................42 Hình 2.4. Tiêu đen nguyên liệu (a), tiêu đen bổ sung chế phẩm (b), ủ lên men bóc vỏ tiêu (c) ............................................................................................................................43 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu chín của chế phẩm T. longibrachiatum H18 ................................................................................................44 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
x Hình 2.6. Tiêu chín nguyên liệu (a), tiêu chín trước khi bổ sung chế phẩm (b), tiêu chín bổ sung chế phẩm (c) .....................................................................................................45 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp cellulase và sinh trưởng, phát triển của T. longibrachiatum H18 .............................................................47 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaNO3 đến khả năng sinh tổng hợp cellulase và sinh trưởng phát triển của T. longibrachiatum H18 ......................................................48 Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase và sinh trưởng, phát triển của T. longibrachiatum H18 .....................................................50 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase và sinh trưởng, phát triển của T. longibrachiatum H18 .....................................................52 Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase và sinh trưởng, phát triển của T. longibrachiatum H18...................................54 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu (cám - trấu) đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. longibrachiatum H18 ...........................................................56 Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. longibrachiatum H18 ..........................................................................................57 Hình 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm mốc đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. longibrachiatum H18 ................................................................................................58 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. longibrachiatum H18 ................................................................................................60 Hình 3.10. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm T. longibrachiatum H18 sinh cellulase cao trên môi trường bán rắn (cám - trấu)........................................................63 Hình 3.11. Chế phẩm T. longibrachiatum H18 sau 1 ngày (a), 3 ngày (b) và sau khi sấy và nghiền (c) ............................................................................................................64 Hình 3.12. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn ............................................................................65 Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu chế phẩm ban đầu chưa bảo quản ................................66 Hình 3.14. Sắc ký đồ của mẫu chế phẩm sau khi bảo quản trong 2 tháng ở 4oC ..........66 Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu chế phẩm bảo quản sau 4 tháng ở 4oC ................................67 Hình 3.16. Độ ẩm hạt tiêu tương thích với thời gian ngâm...........................................69 Hình 3.17. Ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu đen của chế phẩm T. longibrachiatum H18 ................................................................................................70 Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm T. longibrachiatum H18 đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu đen ..........................................................................................................................71 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
xi Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu đen của chế phẩm T. longibrachiatum H18 ................................................................................................72 Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian khác nhau đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu đen của chế phẩm T. longibrachiatum H18 (TLBVCP) và của phương pháp truyền thống (TLBVTT). ....................................................................................................................73 Hình 3.21. Quy trình chế biến tiêu sọ từ tiêu đen..........................................................77 Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu chín của chế phẩm T. longibrachiatum H18 ................................................................................................78 Hình 3.23. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm T. longibrachiatum H18 đến tỷ lệ bóc vỏ tiêu chín .........................................................................................................................79 Hình 3.24. Quy trình chế biến tiêu sọ từ tiêu chín ........................................................81 Hình 3.25. Tiêu sọ sản xuất theo phương pháp truyền thống, tiêu sọ từ tiêu đen, tiêu sọ từ tiêu chín (từ trái sang phải) .......................................................................................82 Hình 3.26. Tiêu sọ sau khi sấy từ tiêu đen (a) và từ tiêu chín (b) .................................82 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là một nước nông nghiệp, các loại nông sản khá đa dạng, trong đó hồ tiêu là một trong những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực, mang lại giá trị kinh tế cao. Nước ta đứng đầu về sản lượng tiêu nhưng Indonesia lại là nước sản xuất tiêu trắng đứng đầu (tới 80% sản lượng tiêu được chế biến thành tiêu trắng) nhờ phát triển tốt mạng lưới chế biến ở quy mô trang trại (Lưu Thị Lệ Thủy, 2009) [44]. Ở nước ta, tiêu trắng được sản xuất với sản lượng thấp hơn rất nhiều so với tiêu đen trong khi ở các nước trồng hồ tiêu khác xu hướng chung là phát triển sản xuất và chế biến tiêu trắng. Theo số liệu của Hiệp hội hồ tiêu năm 2008, Việt Nam xuất khẩu 90.000 tấn, chiếm khoảng 35% sản lượng tiêu thế giới nhưng chủ yếu là tiêu đen (90%) và một lượng nhỏ tiêu trắng (khoảng 10%) nên giá trị kinh tế không cao, trong khi giá tiêu trắng xuất khẩu trung bình 2 tháng đầu năm 2016 là 12.600 USD/ tấn cao hơn so với giá tiêu đen là 8.800 USD/tấn (gấp 1,5 lần), đây là sự thiệt thòi lớn cho người nông dân và đất nước [101]. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp sản xuất tiêu trắng nhưng chủ yếu là sản xuất theo phương pháp truyền thống, phương pháp hóa học và phương pháp sử dụng chế phẩm vi sinh vật. Việc sản xuất tiêu trắng truyền thống là sản xuất thủ công và bán công nghiệp đi từ tiêu chín và tiêu đen theo phương pháp ngâm nước. Quá trình ngâm lâu tốn thời gian, chưa đảm bảo vấn đề vệ sinh, chất lượng sản phẩm, nguy cơ gây ô nhiễm cao, mất mát lượng lớn piperin, tinh dầu và làm cho sản phẩm có mùi khó chịu, hoặc sử dụng phương pháp hóa học thường gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và giá thành sản phẩm cao. Tiêu sọ sản xuất bằng phương pháp sử dụng chế phẩm vi sinh vật là xu thế tất yếu do khắc phục được những nhược điểm của phương pháp truyền thống như rút ngắn thời gian, đơn giản, không gây ô nhiễm, đảm bảo sản phẩm có chất lượng cao hơn (Lê Hồng Phú và Võ Thị Ngọc Thanh, 2010) [39]. Hạt tiêu gồm vỏ quả và nhân hạt. Lớp vỏ chứa thành phần chủ yếu là cellulose và pectin. Để tách vỏ, ta sử dụng enzyme cellulase, có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật nhưng giá thành đắt, số lượng ít. Cellulase được tổng hợp bằng các nấm mốc thuộc chi Trichoderma như Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma hamatum, Trichoderma reseei, Trichoderma coningii, Trichoderma viridae, đó là những chủng có khả năng sản sinh ra cellulase để phân hủy cellulose. Trichoderma longibrachiatum tiêu biểu cho một trong những nhánh thuộc chi Trichoderma, một loại nấm đất được tìm thấy trên khắp thế giới nhưng chủ yếu ở vùng khí hậu ấm áp (Samuels và cs, 2012), nó là một chủng nấm mốc sinh cellulase cao được ứng dụng sản xuất tiêu sọ (Nguyễn Hiền Trang và cs, 2015) [91], [46], [47]. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 Từ những vấn đề trên, với mong muốn nâng cao chất lượng tiêu sọ đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu, giải quyết các vấn đề còn tồn tại của các phương pháp sản xuất hiện nay, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 và bước đầu khảo sát khả năng bóc vỏ tiêu”. 2. Mục tiêu của đề tài - Sản xuất chế phẩm nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 để ứng dụng chế biến tiêu sọ từ tiêu chín và tiêu đen ở quy mô phòng thí nghiệm. - Xây dựng quy trình công nghệ chế biến tiêu sọ từ tiêu đen và tiêu chín bằng chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 nhằm nâng cao chất lượng của sản phẩm hồ tiêu. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1) Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung ứng dụng của chủng nấm mốc Trichoderma longibrachiatum H18 trong sản xuất tiêu sọ nói riêng và các lĩnh vực trong công nghệ thực phẩm nói chung. 2) Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu về chế phẩm nấm mốc sẽ nâng cao chất lượng chế biến tiêu sọ bằng sử dụng chế phẩm Trichoderma longibrachiatum H18 với phương pháp an toàn với con người và thân thiện môi trường nhằm nâng cao thu nhập của người nông dân thông qua sản phẩm chế biến tiêu sọ. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC Trichoderma longibrachiatum 1.1.1. Tổng quan về Trichoderma 1.1.1.1. Khái niệm về Trichoderma Trichoderma là một chi nấm được mô tả vào năm 1794, bao gồm cả nấm Anamorphic phân lập chủ yếu từ đất và chất hữu cơ phân hủy. Là loại nấm phổ biến nhất, có mặt gần như trong tất cả các loại đất và môi trường sống đa dạng. Các chủng trong chi này bao gồm một phổ rộng chủ yếu trong đất và rất hiệu quả với khả năng phân hủy sinh học cao. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh với thực vật (Samuels, 2004) [90]. 1.1.1.2. Phân loại Quá trình phân loại Trichoderma đã trải qua một sự thay đổi đáng chú ý trong 40 năm kể từ năm 1969. Trong chi Trichoderma có tới 89 loài với khả năng sử dụng rất lớn và đa dạng gây khó khăn cho việc định danh và phân loại do sự tương đồng về hình thái. Cho đến năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc giới nấm (fungi), ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma (Clipson và cs, 2001) [57]. Năm 1991, John Bisset đã xác định và công nhận hơn 40 loài, bao gồm 14 mà ông mô tả là mới. Trichoderma được phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum. Ngày nay, khoảng 150 loài được công nhận và hầu hết trong số đó được mô tả sau năm 2000 (Samuels, 2004) [90]. Trong những năm gần đây, việc phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã góp phần khắc phục được những khó khăn về việc định danh các loài thuộc giống nấm này. Hiện nay, đã có nhiều loài được định danh và một số loài được xem là tác nhân kiểm soát sinh học quan trọng như: T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. virens (Nguyễn Văn Đĩnh, 2007) [12]. 1.1.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa Trichoderma là giống nấm có vách ngăn và cuống sinh bào tử phân nhánh, có dạng hình nón hoặc kim tự tháp. Ở đỉnh cuống sinh bào tử thể bình được tạo thành, các bào tử đính được tạo ra tại các đầu mút của các thể bình, là nơi chúng tích lũy để hình thành các đỉnh bào tử đính. Cuống bào tử của một số loài Trichoderma vẫn chưa được xác định. Tập hợp một nhóm sợi nấm bện vào nhau tạo thành cuống bào tử. Một số loài khác có cuống PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có kích thước khoảng từ 1 - 7µm, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng ra khỏi bề mặt thạch và chúng hoạt động như chồi mầm (Samuels, 2004) [90]. Một trong những đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (T. virens), vàng hay xám. Bào tử nấm chủ yếu là hình cầu, hình elip hay oval. Đa số bào tử đều trơn láng, kích thước không quá 5µm. Khuẩn ty của Trichoderma không màu, có khả năng phát triển nhanh, trên môi trường dinh dưỡng PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử các sợi nấm chuyển sang màu xanh đậm. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch môi trường PGA hóa vàng. Hình 1.1. Các chủng nấm trong nhánh Longibrachiatum thuộc chi Trichoderma, phát triển trên môi trường PDA (Nguồn: Samuels và cs, 2012)[91] Chú thích: a, b: T. aethiopicum; c: T. capillare; d: T. effusum; e, f : T. flagellatum; g, h, i : T. gracile. Tất cả được nuôi cấy thời gian 1 tuần ở 25oC dưới ánh sáng. Riêng b, e, h được nuôi cấy trong bóng tối với ánh sáng gián đoạn. Bào tử được tăng lên khi nuôi cấy ở 35oC so với 25oC ở các chủng giống nhau. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5 Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau. Chúng phát triển tốt ở pH = 4,5 - 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 - 30oC. Một số dòng phát triển tốt ở 35oC. Một số ít phát triển được ở 40oC (Samuels, 2004) [90]. Hình thái khác nhau khi ở nhiệt độ khác nhau. Ở 35oC chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 37oC không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy. Trichoderma là loài nấm mốc sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose). Được ứng dụng để bảo vệ cây trồng chống các nấm mốc và vi khuẩn gây bệnh (Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hòa, 2012) [14]. 1.1.1.4. Ứng dụng của Trichoderma trong các lĩnh vực đời sống Hình 1.2. Vai trò của Trichoderma (Nguồn: Mukherjee, 2013)[79] ➢ Trong nông nghiệp - Cải thiện năng suất cây trồng: Dựa vào các tính chất đặc trưng của loài, nhiều chủng nấm mốc Trichoderma như T. harzianum và T. koningii,… được ứng dụng nhiều vào trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh để cung cấp nguồn phân bón an PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 toàn; phòng trừ các nấm gây thối mốc, bệnh héo rũ; kích thích sự nảy mầm và tăng sức đề kháng của cây trồng. Dương Minh và cs (2006) chọn lọc 3/45 chủng nấm Trichoderma spp. đối kháng tốt với 12 chủng nấm bệnh P. palmivora gây hại cho sầu riêng trong điều kiện in-vitro, khác biệt có ý nghĩa so với sử dụng thuốc trừ bệnh và đối chứng, bón phân hữu cơ có Trichoderma còn giúp tăng năng suất và cải thiện chất lượng trái sầu riêng [31]. - Sử dụng Trichoderma để phòng trừ nấm gây bệnh: Trong số các bệnh hại do nấm gây ra, có những bệnh liên quan đến các bộ phận nằm dưới đất, do đó rất khó điều trị bằng phương pháp hóa học truyền thống. Mặt khác, Trichoderma là loại vi nấm có mặt trong hầu hất các loại đất nông nghiệp, có khả năng kiềm chế các loại nấm khác phát triển, là tác nhân đối kháng tự nhiên của loài nấm gây bệnh và là một tác nhân kiểm soát sinh học (Mukherjee, 2013) [79]. Nguyễn Văn Viên và cs (2012) nghiên cứu áp dụng chế phẩm CP2, CP3, CP4 sản xuất nấm đối kháng T. viride để phòng trừ các bệnh nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ, nấm, Sclerotium rolfsii gây bệnh héo gốc mốc trắng cây khoai tây, lạc, đậu tương [52]. Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hòa (2012) đã chứng minh nấm đối kháng Trichoderma có nhiều tiềm năng trong phòng trừ sinh học nấm S. rolfsii, một loại nấm bệnh hại cây trồng, rất nhiều chủng hạn chế sản sinh hạch nấm S. rolfsii trong đó đáng chú ý chủng ĐR16 có khả năng ức chế hoàn toàn sự hình thành hạch nấm S. rolfsii, làm cho hạch nấm không hình thành được [14]. ➢ Trong lĩnh vực xử lý môi trường Với khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng; giảm bớt sự tập trung của các chất tự do 2,4,6 - trichlorophenol, 4,5 - dicholoroguaico; phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ… nên T. harzianum được sử dụng rộng rãi trong công nghệ xử lý môi trường (Mukherjee, 2013) [79]. ➢ Trong công nghệ thực phẩm Một số loài Trichoderma đã được sử dụng rộng rãi như là một nguồn của các enzyme hoặc các chất chuyển hóa thứ cấp trong các ứng dụng trong các quá trình công nghiệp thực phẩm. Những ngành công nghiệp đồ uống như bia và rượu vang, hương vị, mùi thơm và kết cấu là những khía cạnh chất lượng quan trọng đối với các nhà sản xuất và người tiêu dùng (Styger và cs, 2011) [93]. Các hợp chất Trichoderma mô tả ở trên có thể được áp dụng trong công nghiệp để tăng thêm đặc tính mong muốn như vậy nhằm tăng giá trị thương mại của sản phẩm. Việc bổ sung các enzyme trong bước ngâm là một thực tế phổ biến trong sản xuất rượu vang. Exo-β-1,3-glucanase ở T. harzianum có thể cắt liên kết β-1,3 và β-1,6-glucan, góp phần tăng độ trong của rượu (Mukherjee, 2013) [79]. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 Vi sinh vật có nguồn gốc từ β-glucanases cung cấp ứng dụng công nghiệp và thường được thêm vào bia trong quá trình sản xuất bia để giảm hàm lượng β-glucan, tạo sản phẩm cuối cùng với đặc tính mong muốn, hỗn hợp enzyme từ T. reesei hoạt động hiệu quả hơn tại pH thấp khi so sánh với Humicola (Faulds và cs, 2008) [62]. 1.1.2. Tổng quan về Trichoderma longibrachiatum T. longibrachiatum là một loại nấm mốc thuộc nhánh Longirachitum trong chi Trichoderma. Ngoài việc là một loài riêng biệt, T. longibrachiatum cũng tiêu biểu cho một trong những nhánh thuộc chi Trichoderma trong đó bao gồm 21 loài khác nhau. Nhiều loài từ nhánh này đã được áp dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau bởi vì khả năng của chúng có thể tiết ra một lượng lớn protein và các chất chuyển hóa. T. longibrachiatum là một loại nấm đất được tìm thấy trên khắp thế giới nhưng chủ yếu ở vùng khí hậu ấm áp, nó cũng được biết đến là quần thể nấm mốc trong nhà (Samuels và cs, 2012) [91]. Mặc dù nó đã được mô tả ban đầu từ đất ở Mỹ (Ohio) nhưng lại phổ biến hơn ở vùng nhiệt đới hơn các vùng ôn đới. Mukherjee (2013) phân lập nó từ bên trong một miếng bọt biển liên tục ngập nước, nó cũng thường xuyên được phân lập từ trang trại trồng nấm từ những cây nấm bị nhiễm nấm mốc [79]. Khuẩn lạc của nấm mốc T. longibrachiatum có dạng bột dày, sợi kết hợp thành búi và điểm những hột màu trắng, có khả năng tăng trưởng nhanh. Về màu sắc, sau 2 ngày, ở mặt phải, khuẩn lạc có tơ mịn trắng sau đó chuyển dần sang màu xanh nhạt và tiếp tục chuyển sang màu xanh lục. Khuẩn ty (sợi nấm) không màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử chuyển sang xanh đậm. Các gen mã hóa endo-β-1,4-glucanases và xylanases từ T. longibrachiatum được sử dụng để tái tổ hợp chủng nấm men, sau đó ứng dụng vào quá trình sản xuất để cho ra loại rượu vang Ruby Cabernet với cảm quan tốt, độ ổn định cao trong sáu tháng bảo quản (Pérez-González và cs, 1993) [86]. T. longibrachiatum được Cobas và cs (2013) sử dụng để làm vật thể kháng sinh học để loại bỏ các hydrocarbon thơm đa vòng (PAHs). PAHs có trong dầu mỏ, than đá, nhựa và là sản phẩm phụ của quá trình đốt cháy nhiên liệu bao gồm nhiên liệu hóa thạch. Nó là một chất ô nhiễm, nguyên nhân gây ô nhiễm đất, nước nghiêm trọng và còn được quan tâm vì một số hợp chất đã được xác định là gây ung thư, gây đột biến và quái thai. T. longibrachiatum được bơm vào các miếng bột biển nilon, hình thành nên các màng sinh học kết dính mạnh mẽ với miếng bột biển và kết quả thử nghiệm cho thấy hơn 90% phenanthrene đã được giảm sau 14 giờ trong môi trường nước. Tại PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 phản ứng trong cột thủy tinh, hỗn hợp phenanthrene, benzo anthracene và pyrene ở nhiều nồng độ từ 100 - 400 μM, được xử lý triệt để [58]. Zhang Shuwu và cs (2014) đã dùng T. longibrachiatum để kháng Heterodera avenae, một loại nấm gây bệnh cho cây gây thiệt hại nặng nề về năng suất. Trong nhà kính, T. longibrachiatum làm tiêu giảm đáng kể H. avenae nhiễm trong lúa mì. Quan sát bằng kính hiển vi cho thấy rằng sau khi tiếp xúc lẫn nhau với các u nang, các bào tử của T. longibrachiatum nảy mầm với một số lượng lớn các sợi nấm và sinh sôi nhanh chóng trên bề mặt của u nang. Trong khi đó, bề mặt u nang trở nên không đồng đều, với một số không bào và tách những u nang khác. Cuối cùng các u nang bị hòa tan bởi các chất chuyển hóa của T. longibrachiatum [99]. Bên cạnh đó, Zhang Shuwu và cs (2015) cũng đã tìm ra lợi ích tiềm năng của T. longibrachiatum khi kiểm soát sinh học đối với Meloidogyne incognita, Meloidogyne incognita là một trong những loại ký sinh trong đất và mầm bệnh quan trọng nhất trong dưa chuột trên toàn thế giới [100]. Nhờ khả năng sản sinh ra cellulase nên T. longibrachiatum còn được biết đến với rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn. T. longibrachiatum sử dụng trong công nghiệp khác nhau bao gồm sử dụng cellulase cho các loại vải nhuộm trong ngành dệt may, tăng khả năng tiêu hóa thức ăn gia cầm (Rosales, 2011) [89]. Trước đây, T. reesei được ứng dụng rất nhiều trong sản xuất cellulase nhưng T. longibrachiatum đã được chứng minh với khả năng sản sinh ra cellulase tương đương (Leghlimi, 2013) [72]. Chúng được ứng dụng trong xử lý hạt cà phê và trong sản xuất tiêu sọ (Bùi Văn Miên và Nguyễn Đình Kinh Luân, 2004 ; Nguyễn Hiền Trang và cs, 2015) [29], [45], [46]. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 1.2. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 1.2.1. Khái niệm Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: exoglucanase hay C1 (EC3.2.1.91), endoglucanase hay Cx (EC3.2.1.4) và β-glucosidase (EC3.2.1.21) hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose. Cellulase được ứng dụng để cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc và đường hóa các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol (Trần Thạnh Phong và cs, 2007) [37]. Hình 1.3. Mô hình của cellulase (Nguồn: Mai Xuân Lương, 2005)[24] 1.2.2. Nguồn gốc Cellulase là thành phần cơ bản của khối thực vật. Trong thiên nhiên, thực vật đóng vai trò chủ yếu tổng hợp cellulase và vi sinh vật đóng vai trò chuyển hóa các hợp chất cellulase (Nguyễn Đức Lượng, 2010) [26]. Nấm mốc là một trong những đối tượng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase, amylase và protease mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh như: A. niger, A. flavus, A. fumigatus, A. tereus, T. reesei... (Nguyễn Đức Lượng, 2010) [26]. Khi nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm mốc, Jahangeer và cs (2005) đã tiến hành phân lập được 115 chủng nấm có khả năng tổng hợp cellulase từ rễ cây và mẫu đất nông nghiệp. Chủ yếu là các chủng: Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Rhizopus, Pennicillium và Trichoderma. Trong đó, Aspergillus và Trichoderma là hai chủng có khả năng sinh cellulase mạnh [69]. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma