Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase từ loài trà Shan tuyết Camellia sinensis var. assamica (J.W.Mast.) Kitam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Dương Thị Ngọc Bích

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC

CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE TỪ LOÀI TRÀ SHAN TUYẾT Camellia sinensis var. assamica (J.W.MAST.) Kitam.

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Hà Nội – 2020

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Dương Thị Ngọc Bích

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC

CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE TỪ LOÀI TRÀ SHAN TUYẾT Camellia sinensis var. assamica (J.W.MAST.) Kitam.

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Thị Cúc

Hà Nội – 2020

i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan rằng, các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2020

Học viên

Dương Thị Ngọc Bích

ii

Lời cảm ơn

Luận văn được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể.

Tôi xin chân thành cảm ơn đề tài Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Việt Nam (NAFOSTED) mã số 104.01-2014.02 đã hỗ trợ tôi thực hiện thành công luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Cúc - Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp thuộc phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hoá sinh biển đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo tại Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ, tạo điều kiện và truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn.

Tôi trân trọng và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã động viên và

giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, 28 tháng 5 năm 2020

Học viên

Dương Thị Ngọc Bích

iii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Cộng hưởng từ hạt nhân proton

CC Column chromatography Sắc kí cột

DEPT Phổ DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DMSO Dimethylsulfoxide (CH3)2SO

HMBC

Heteronuclear mutiple Bond Connectivity Tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HSQC

Heteronuclear Single-Quantum Coherence Tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết

Inhibitory concentration at 50% IC50

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm

RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụ pha đảo C-18

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TMS Tetramethylsilane (CH3)4Si

iv

Danh mục các bảng

Bảng 4.1. Số liệu NMR của CA1 và chất tham khảo CA1a .......................... 35

Bảng 4.2. Số liệu NMR của CA2 và chất tham khảo CA1 ............................ 40

Bảng 4.3. Số liệu NMR của CA3 và chất tham khảo ..................................... 47

Bảng 4.4. Số liệu NMR của CA4 và chất tham khảo ..................................... 51

Bảng 4.5. Số liệu NMR của CA5 và chất tham khảo ..................................... 55

Bảng 4.6. Số liệu NMR của CA6 và chất tham khảo .................................... 58

Bảng 4.7. Số liệu NMR của CA8 và chất tham khảo ..................................... 64

Bảng 4.8. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất ........................................................................................................... 71

v

Danh mục các hình vẽ

Hình 1.1. Cây trà Shan tuyết (C. sinensis var. assamica) ................................ 4

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài trà Shan tuyết C. sinensis var. assamica……………………………………………………………………..29 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của CA1 và hợp chất tham khảo CA1a………34

Hình 4.2. Các tương tác HMBC và COSY chính của CA1 ........................... 36

Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CA1 ............................................... 37

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA1 ................................................... 37

Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA1 ................................................... 38

Hình 4.6. Phổ HSQC của hợp chất CA1 ........................................................ 38

Hình 4.7. Phổ HMBC của hợp chất CA1 ....................................................... 39

Hình 4.8. Phổ COSY của hợp chất CA1 ........................................................ 39

Hình 4.9. Cấu trúc hóa học của CA2 và hợp chất tham khảo CA1 ............... 40

Hình 4.10. Các tương tác HMBC và COSY chính của CA2 ......................... 42

Hình 4.11. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CA2 ............................................. 42

Hình 4.12. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA2 .................................................. 43

Hình 4.13. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA2 ................................................. 43

Hình 4.14. Phổ HSQC của hợp chất CA2 ...................................................... 44

Hình 4.15. Phổ HMBC của hợp chất CA2 ..................................................... 44

Hình 4.16. Phổ COSY của hợp chất CA2 ...................................................... 45

Hình 4.17. Phổ NOESY của hợp chất CA2 ................................................... 45

Hình 4.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA3 ......... 46

Hình 4.19. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA3 .................................................. 48

Hình 4.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA3 ................................................. 48

Hình 4.21. Phổ HSQC của hợp chất CA3 ...................................................... 49

vi

Hình 4.22. Phổ HMBC của hợp chất CA3 ..................................................... 49

Hình 4.23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA4 ......... 50

Hình 4.24. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA4 .................................................. 52

Hình 4.25. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA4 ................................................. 52

Hình 4.26. Phổ HSQC của hợp chất CA4 ...................................................... 53

Hình 4.27. Phổ HMBC của hợp chất CA4 ..................................................... 53

Hình 4.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA5 ......... 54

Hình 4.29. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA5 .................................................. 56

Hình 4.30. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA5 ................................................. 56

Hình 4.31. Phổ HSQC của hợp chất CA5 ...................................................... 57

Hình 4.32. Phổ HMBC của hợp chất CA5 ..................................................... 57

Hình 4.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA6 ......... 58

Hình 4.34. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA6 .................................................. 59

Hình 4.35. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA6 ................................................. 60

Hình 4.36. Phổ HSQC của hợp chất CA6 ...................................................... 60

Hình 4.37. Phổ HMBC của hợp chất CA6 ..................................................... 61

Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của CA7 ........................................................... 61

Hình 4.39. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA7 .................................................. 62

Hình 4.40. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA7 ................................................. 63

Hình 4.41. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA8 ......... 63

Hình 4.42. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA8 .................................................. 65

Hình 4.43. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA8 ................................................. 66

Hình 4.44. Phổ HSQC của hợp chất CA8 ...................................................... 66

Hình 4.45. Phổ HMBC của hợp chất CA8 ..................................................... 67

Hình 4.46. Cấu trúc hóa học của CA9 ........................................................... 67

vii

Hình 4.47. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA9 .................................................. 68

Hình 4.48. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA9 ................................................. 69

Hình 4.49. Phổ DEPT của hợp chất CA9 ....................................................... 69

viii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. I

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. II

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..................................... III

DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. IV

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ......................................................................... V

MỤC LỤC .................................................................................................... VIII

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI Camellia ............................................................. 3

1.2. GIỚI THIỆU VỀ CÂY TRÀ SHAN TUYẾT (Camellia sinensis var. assamica) ....................................................................................................... 3

1.2.1. Thực vật học .................................................................................... 3

1.2.2. Đặc điểm thực vật ........................................................................... 4

1.2.3. Bộ phận dùng, tính vị, tác dụng, công dụng ................................... 5

1.2.3.1. Bộ phận dùng ............................................................................... 5

1.2.3.2. Tính vị, tác dụng .......................................................................... 5

1.2.3.3. Công dụng .................................................................................... 5

1.2.4. Tác dụng dược lý ............................................................................. 5

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI Camellia sinensis var. assamica ..... 6

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................. 7

1.3.1.1. Các hợp chất flavonoid ................................................................ 7

1.3.1.2. Các hợp chất terpenoid ............................................................... 14

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................. 17

ix

1.4. TỔNG QUAN VỀ TIỂU ĐƯỜNG ...................................................... 18

1.4.1. Khái quát về bệnh tiểu đường ....................................................... 18

1.4.2. Các thuốc điều trị bệnh tiểu đường ............................................... 19

1.4.2.1. Các thuốc điều trị tiểu đường dùng tiêm .................................... 19

1.4.2.2. Các thuốc điều trị tiểu đường dùng đường uống ....................... 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 25

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 25

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 25

2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất ....... 25

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất .................. 26

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ... 26

2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ............................................................ 27

2.3.1. Hóa chất .................................................................................. 27

2.3.2. Thiết bị .................................................................................... 27

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ...................................................................... 29

3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT ............................................................ 29

3.2. THÔNG SỐ VẬT LÍ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC ... 30

3.2.1. Hợp chất CA1 ................................................................................ 30

3.2.2. Hợp chất CA2 ................................................................................ 31

3.2.3. Hợp chất CA3 ................................................................................ 31

3.2.4. Hợp chất CA4 ................................................................................ 31

3.2.5. Hợp chất CA5 ................................................................................ 31

3.2.6. Hợp chất CA6 ................................................................................ 32

3.2.7. Hợp chất CA7 ................................................................................ 32

3.2.8. Hợp chất CA8 ................................................................................ 32

x

3.2.9. Hợp chất CA9 ................................................................................ 33

3.3. ĐÁNH GIÁ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME α- GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT ................................................. 33

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 34

4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT .......... 34

4.1.1. Hợp chất CA1: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-(4′′′- methoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside (chất mới) ................................ 34

4.1.2. Hợp chất CA2: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-(3′′′,4′′′- dimethoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside (chất mới) ............................. 40

4.1.3. Hợp chất CA3: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D- glucopyranoside ...................................................................................... 46

4.1.4. Hợp chất CA4: Sasastilboside A ................................................... 50

4.1.5. Hợp chất CA5: 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′-O-β-D- glucopyranoside ...................................................................................... 54

4.1.6. Hợp chất CA6: Epicatechin .......................................................... 58

4.1.7. Hợp chất CA7: Epicatechin 3-O-gallate ....................................... 61

4.1.8. Hợp chất CA8: Epigallocatechin 3-O-gallate ............................... 63

4.1.9. Hợp chất CA9: Kaempferol -3-O-β-D-glucopyranoside .............. 67

4.1.10. Danh sách các hợp chất phân lập từ loài trà Shan tuyết (C. sinensis var. assamica) ............................................................................ 70

4.2. HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ...................................................................... 70

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 72

5.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 72

5.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 73

1

MỞ ĐẦU

Xu hướng sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên nói chung, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật để chữa trị một số bệnh nhiệt đới và những bệnh hiểm nghèo đã và đang là mối quan tâm không chỉ của ngành dược ở nước ta mà còn của các nước trong khu vực cũng như các nước trên thế giới.

Việc nghiên cứu, phát hiện các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ thiên nhiên nhằm phục vụ cuộc sống của con người là một trong những nhiệm vụ quan trọng đặt ra cho các nhà khoa học. Nguồn tài nguyên sinh vật của nước ta dồi dào, đặc biệt hệ thực vật Việt Nam vô cùng phong phú. Theo ước tính của các nhà khoa học, số loài thực vật bậc cao có mặt ở nước ta có thể lên tới 12.000 loài trong đó đã biết khoảng 3500 loài là cây thuốc, đây là nguồn nguyên liệu phục vụ cho sản xuất thuốc chữa bệnh.

Chi Trà (Camellia) là một chi thực vật có hoa thuộc họ Chè (Theaceae), có nguồn gốc ở khu vực miền đông và miền nam châu Á. Trên thế giới có khoảng 280 loài. Ở Việt Nam, hiện đã biết 68 loài trong đó có tới 15 loài đặc hữu [1]. Một số loài trong chi Trà đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường như: trà xanh Thái Nguyên, trà đen, trà ô long (từ lá loài Camellia sinensis), trà Shan tuyết (từ lá loài C. sinensis var. assamica), trà hoa vàng (từ lá và hoa loài C. hakodate).... Các loài trong chi Trà có tiềm năng lớn về các chất có hoạt chất sinh học như: tác dụng hạ đường huyết, hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng viêm, ... Tuy nhiên, ở Việt Nam, các loài này mới chỉ có một vài nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Từ những lý do đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase từ loài trà Shan tuyết Camellia sinensis var. assamica (J.W.Mast.) Kitam”. Nghiên cứu này sẽ góp phần làm rõ giá trị cũng như công dụng của loài trà Shan tuyết. Vì vậy, sẽ góp phần tích cực vào việc khai thác và sử dụng một cách hợp lý nguồn tài nguyên thiên nhiên của đất nước. Đề tài bao gồm các mục tiêu sau:

2

1. Phân lập các hợp chất từ loài trà Shan tuyết.

2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.

3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất phân lập được.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI Camellia

Giới : Plantae Bộ : Ericales Họ : Theaceae

Chi : Camellia

Camellia là một chi thực vật có hoa trong họ Theaceae phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở Châu Á. Camellia có nguồn gốc ở vùng Assam (Ấn Độ). Cũng có giả thiết cho rằng cây xuất xứ từ vùng Vân Nam (Trung Quốc) và Bắc Việt Nam.

Trên thế giới có khoảng 280 loài thuộc Chi Camellia, ở Việt Nam, hiện đã biết 68 loài trong đó có tới 15 loài đặc hữu [1]. Các loài trong chi trà là các cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ và thường xanh, cao khoảng 2–20 m. Lá sắp xếp theo kiểu so le, lá đơn, dày, mép lá có khía, thông thường có mặt ngoài bóng láng, dài 3–17 cm. Hoa lớn và dễ thấy, đường kính 1–12 cm, với 5–9 cánh hoa; có màu từ trắng tới hồng hay đỏ, còn màu vàng có ở một số loài. Quả là loại quả nang khô được chia thành 1–5 ngăn, mỗi ngăn chứa 1–8 hạt [2].

1.2. GIỚI THIỆU VỀ CÂY TRÀ SHAN TUYẾT (Camellia sinensis var. assamica)

1.2.1. Thực vật học

Tên khoa học: Camellia sinensis var. assamica (J.W.Mast.) Kitam.

Tên thường gọi: Trà (chè) Shan tuyết hay trà tuyết

Giới : Plantae Bộ : Ericales Họ : Theaceae

Chi : Camellia

4

1.2.2. Đặc điểm thực vật

Trà Shan tuyết có đặc điểm là cây gỗ thường xanh, cao 7-16m, gốc lớn có đường kính 1m, tán rộng khoảng 8m. Trà có lá dài 7-16cm, rộng 2,8- 5,5cm, có chóp nhọn dài thành đuôi, gân bên 9-13 đôi, cuống lá khoảng 0,4- 1cm. Hoa 1-4; lá đài 5, mặt trong không lông; số cánh hoa từ 7-9; nhị nhiều; bầu 3-5 lá noãn, vòi nhụy 3, rời ở đỉnh. Quả nang rộng 3-4 cm.

Trà Shan tuyết là loài cây ưa lạnh, thường gặp ở các vùng núi có độ cao từ 800-1000m. C. sinensis var. assamica phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Mianma, Nam Trung Quốc. Ở nước ta, loài cây này được trồng ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Hà Giang, Yên Bái [3].

Hình 1.1. Cây trà Shan tuyết (C. sinensis var. assamica)

5

1.2.3. Bộ phận dùng, tính vị, tác dụng, công dụng

1.2.3.1. Bộ phận dùng

Búp trà, lá trà non tươi hoặc đã chế biến khô và quả.

1.2.3.2. Tính vị, tác dụng

Trà có vị đắng, chát, hơi ngọt, tính mát, vào kinh can, thận có tác dụng thanh nhiệt, giải khát, tiêu cơm, lợi tiểu, làm cho đầu não được thư thái, da thịt mát mẻ, khỏi chóng mặt, xây xẩm, bớt mụn nhọt, cầm tả lỵ [3].

1.2.3.3. Công dụng

Trà Shan tuyết được chế biến thành trà mạn, trà xanh hoặc trà đen có chất lượng cao dùng làm thức uống. Bên cạnh đó, lá và quả trà tuyết còn được dùng làm thuốc. Ở Vân Nam (Trung Quốc), trà Shan tuyết được dùng để trị đi đái nước tiều vàng, cảm nắng, nóng miệng, khát, sa khí bụng đái, dịch tả khan và bệnh lỵ. Dùng trong dạng thuốc sắc với liều 4-8 g [3].

1.2.4. Tác dụng dược lý

Cũng như các loài thuộc họ trà, trà Shan tuyết là loại nước uống tốt cho sức khỏe. Từ lâu, trà Shan tuyết nói riêng và trà nói chung đã được sử dụng như là một phương thuốc trong y học phương đông. Căn cứ vào các sách đông y dược, ghi chép qua các thời đại và thực tiễn chứng minh chẳng những bảo vệ sức khỏe mà còn có tác dụng điều trị nhiều loại bệnh, nên người ta coi trà là loại thuốc chữa bệnh.

Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác động của lá trà mới được bắt đầu nghiên cứu mạnh mẽ trong thế kỉ 20. Trước đây, tác dụng của trà được cho rằng do tác động của các thành phần caffeine và vitamin C. Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế kỉ 20, việc nghiên cứu chi tiết về trà đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của trà là do sự có mặt của nhiều nhóm hợp chất như: flavonoid, terpenoid, alkaloid, lipid, tinh dầu, acid amin và nhiều sinh tố cùng các nguyên tố vi lượng như P, sắt, iod, Mg, Cu,… tổng cộng trên 300 loại thành phần. Các thành phần này có tác dụng trọng yếu trong phòng và chữa bệnh đối với cơ thể con người.

Một số tác dụng cụ thể của trà Shan tuyết:

6

- Tinh thần nâng cao, đầu óc tỉnh táo: khi đầu óc xây xẩm, tinh thần mệt mỏi, người ta uống một chén trà mới pha, sẽ cảm thấy tinh thần sảng khoái.

- Thanh lợi đầu và mắt: uống trà lâu dài có thể thanh lợi đầu và mắt, đạt tác dụng làm tinh thần sảng khoái, mắt tinh, tai sáng. Trong trà có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng có quan hệ tới thị lực như là: tiền sinh tố A (β − caroten), vitamin B1, B2, và C, đều là những chất cần thiết duy trì thị lực.

- Tiểu thử giải khát: sau khi uống trà nóng, tinh dầu thơm trong trà và caffeine mau phát huy tác dụng, làm giãn huyết quản, mở tuyến mồ hôi, thân thể hơi toát mồ hôi, tán phát nhiệt lượng trong cơ thể, do đó đạt được mục đích tiêu thử giáng thấp thanh nhiệt, sau khi uống trà nóng gia tăng được lượng nước tiểu, làm cho tiểu tiện bài tiết điều hòa, tự nhiên sẽ có bộ phận nhiệt lượng theo đường tiểu tiện tiết ra ngoài, làm cho ra mồ hôi. Ngoài ra, làm co dãn cơ trơn dạ dày, ruột giãn giải co thắt trường vị, cho nên uống trà điều trị được thử nhiệt, sa khí, đau bụng.

- Giảm béo: trà xanh chứa nhiều thành phần như chứa chất dẫn phenol, flavonoid, quereetin cùng nhiều loại sinh tố, nhất là vitamin C với lượng lớn. dẫn chất phenol trong lá trà giáng giải chất mỡ, flavonoid, quereetin hỗ trợ việc giáng thấp cholesterol. Vitamin C hỗ trợ lợi tiểu làm cholesterol bài tiết ra ngoài nhanh chóng. Các vitamin khác cải thiện cơ năng chuyển hóa của cơ thể, hỗ trợ và để phòng mạch máu bị xơ cứng. Trong lá chè có diệp lục (chlorophyll) sau khi vào cơ thể, sẽ loại cholesterol từ thức ăn, ngăn cản tiêu hóa hấp thụ cholesterol trong cơ thể [4].

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI Camellia sinensis var. assamica

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài C. sinensis var. assamica. Thành phần hóa học chủ yếu của chi trà nói chung cũng như của loài trà Shan tuyết nói riêng là các hợp chất flavonoid và terpenoid. Dưới đây là tổng quan nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài C. sinensis var. assamica.

7

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.3.1.1. Các hợp chất flavonoid

(18), catechin-(4α-8)-epigallocatechin (17), procyanidin B-4

Năm 1989, Hashimoto và cộng sự đã phân lập được hai tư flavan từ lá của loài Camellia sinensis var. assamica. Các hợp chất đó được xác định là: assamicain A-C (1-3), (-)-epiafzelechin (4), (-)-epicatechin (5), (-)- epigallocatechin (6), epiafzelechin 3-O-gallate (7), (-)-epicatechin 3-O-gallate (8), (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (9), (-)-epicatechin 3,5-di-O-gallate (10), (-)-epigallocatechin 3,5-di-O-gallate (11), (-)-epigallocatechin 3,3′-di-O- gallate (12), (-)-epigallocatechin 3,4′ di-O-gallate (13), (-)-epigallocatechin 3- O-caffeoate (14), procyanidin B-2 (15), procyanidin C-1 (16), procyanidin B- 3 (19), gallocatechin-(4α-8)-epicatechin (20), prodelphinidin B-4 (21), theaseninsin A (22), theaseninsin B (23) và desfalloyl theasinensin F (24) [5].

8

Các nhà khoa học Trung Quốc đã tách được hai flavan-3-ol thay thế 8- C (25-26), puerin A (25) và puerin B (26), cùng năm hợp chất flavonoid khác (27-31) bao gồm, cinchonain epicatechin-[7,8-bc]-4α-(4-hydroxyphenyl)- dihydro-2(3H)-pyranone (27), cinchonain Ib (28), (-)-epicatechin-8-C-β-D- glucopyranoside (29), gallocatechin (30) và myricetin (31) từ lá cây C. sinensis var. assamica [6].

9

(33),

(-)-gallocatechin-[8,7-e]-4α-(2,4,5-trihydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)- (-)-epigallocatechin-[8,7-e]-4β-(2,4,5-trihydroxyphenyl)- (+)-epigallocatechin-[8,7-e]-4β-(2,4,5- (34),

Từ lá trà C. sinensis var. assamica, Tao và cộng sự đã phân lập được năm hợp chất flavan-3-ol (32-36), puerin C-F (32-35) có tên gọi tương ứng là (+)- gallocatechin-[8,7-e]-4α-(2,4,5-tri-hydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone (32), pyranone dihydro-2(3H)-pyranone trihydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone (35) và (+)-catechin (36) [7].

Năm 2014, Tian và cộng sự đã phân lập được mười bảy hợp chất từ lá trà C. sinensis var. assamica. Các hợp chất này được xác định là: 8- carboxymethyl-(+)-catechin (37), 8-carboxymethyl-(+)-catechin methyl ester

10

(38), 6-carboxymethyl-(+)-catechin (39), 6-carboxyl-(-)-gallocatechin (40), 8- carboxyl-(+)-catechin (41), (+)-catechin-8-O-β-D-glucopyranoside (42), (−)- epicatechin-8-C-β-D-glucopyranoside (43), vicenin-2 (44), isoschaftoside 4′-O-α-L- (45), 2′′-O-β-D-glucopyranosylvitexin quercetin (46),

3-O-β-D-galactopyranoside quercetin (51),

rhamnopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (47), rutin (48), nicotifiorin (49), myricetin 3-O-β-D-glucopyranoside (50), 3-O-β-D- myricetin glucopyranoside (52) và quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside (53). Trong đó, các hợp chất 40 và 42-53 được thử nghiệm hoạt động cấp tính về độ nhạy insulin trong các tế bào mỡ 3T3-L1 biệt hóa, nhưng không có chất nào thể hiện hoạt tính sinh học ở nồng độ 10 μM [8].

Theo nghiên cứu của Wang và cộng sự đã tiến hành phân lập các hợp

chất từ lá trà C. sinensis var. assamica và thu được tám dẫn xuất flavan-3-ol

được thay thế 8-C N-ethyl-2-pyrrolidinone (puerin I-VIII) (54-61). Các hợp

chất này được đánh giá một số hoạt tính sinh học. Kết quả chỉ ra rằng các

purin I-IV có tác dụng bảo vệ tiềm năng đối với các tổn thương tế bào nội mô

11

vi mạch (HMEC) do H2O2 gây ra tốt hơn so với các polyphenol trong các loại

trà khác [9].

Năm 2017, nhóm tác giả Wang đã phân lập được mười sáu hợp chất

flavonoid được xác định là (-)-epiafzelechin (4), (-)-epicatechin (5), (-)-

epigallo-catechin (6), (-)-epiafzelechin-3-O-gallate (7), (-)-epicatechin-3-O-

gallate (8), (–)-epigallo-catechin-3-O-gallate (9), gallocatechin (30), (+)-

catechin (36), (-)-epicatechin-3-O-(Z)-coumarate (62), (-)-epicatechin-3-O-

(E)-coumarate (63), (-)-epicatechin-3-O-(E)-caffeate (64), epicatechin-3-O-p-

hydroxybenzoate (65), epicatechin-3-O-p-hydroxybenzoate (66), (+)-

catechin-3-O-gallate (67), (+)-epiafzelechin-3-O-gallate (68) và (+)-

gallocatechin-3-O-gallate (69) từ dịch chiết nước của trà C. sinensis var.

assamica. Đồng thời, dịch chiết của trà này và các phân đoạn của nó đã được

đánh giá hoạt tính ức chế α-glucosidase và lipase. Hợp chất 9 cho thấy tác

dụng ức chế sucrase với giá trị IC50 là 32.5 µmol/L và ức chế maltase với giá

trị IC50 là 1.3 µmol/L. Các hợp chất 8, 9, 67 và 68 cho thấy hoạt tính ức chế

lipase với các giá trị IC50 lần lượt là 16.0, 13.3, 13.6 và 19.8 μmol/L [10].

12

Theo nghiên cứu của Zhou và cộng sự đã phân lập được mười một hợp chất flavonoid: (-)-epicatechin (5), (-)-epigallocatechin gallate (6), amelliaone A-E (70-74), quercetin (75), (-)-gallocatechin gallate (76), apigenin (77) và amentoflavone (78) từ dịch chiết ethanol của lá trà Camellia sinensis var. assamica. Đồng thời, tác giả cũng đã đánh giá hoạt tính chống oxi hóa, ức chế α-glucosidase và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này. Hợp chất 77 thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 là 10.2 µM, tốt hơn so với acarbose (18.2 µM). Năm flavanone (77-81) thể hiện độc tính tế bào đối với dòng tế bào ung thư ở người HepG2, với giá trị IC50 trong khoảng 50.2 – 123.5 µM [11].

13

(80),

(81), (82),

Gần đây, từ loài trà C. sinensis var. assamica, Cheng và cộng sự đã phân lập được mười flavoalkaloid. Các hợp chất đã được xác định là (-)-6- (5'''S)-N-ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-O-gallate (79), (-)-6-(5'''R)-N- (-)-8-(5'''S)-N-ethyl-2- ethyl-2-pyrrolidinone-epicatechin-3-O-gallate (-)-8-(5'''R)-N-ethyl-2- pyrrolidinone-epicatechin-3-O-gallate pyrrolidinone-epicatechin-3-O-gallate (-)-8-(5'''S)-N-ethyl-2- pyrrolidinone-catechin-3-O-gallate (83), (-)-8-(5'''R)-N-ethyl-2-pyrrolidinone- catechin-3-O-gallate (84) và etc-pyrrolidinone A-D (85-88). Bên cạnh đó, các hợp chất (79-84) đã thể hiện khả năng bảo vệ chống lại sự lão hóa tế bào do glucose trên các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con người (HUVEC) ở 1.0 và 10 µM [12].

14

1.3.1.2. Các hợp chất terpenoid

Từ hạt loài trà Camellia sinensis var. assamica, nhóm tác giả Murakami đã phân lập được tám triterpenoid: assamsaponin A-E (89-93), theasaponin E1 (94), theasaponin E2 (95) và camelliasaponin B1 (96). Hoạt tính bảo vệ dạ dày của các hợp chất thu được đã được đánh giá và kết quả chỉ ra rằng hợp chất 94 thể hiện hoạt tính ức chế tổn thương niêm mạc dạ dày gây ra bởi ethanol trên chuột tốt hơn so với thuốc tham khảo omeprazole [13].

Năm 2000, nhóm tác giả Murakami tiếp tục phân lập được thêm bốn hợp chất assamsaponin F- I (97-100) từ hạt và assamsaponin J (101) từ lá của loại trà Camellia sinensis var. assamica [14].

15

Năm 2000, Lu và cộng sự cũng đã phân lập được ba triterpenoid từ rễ axit 3-O-α-L- trà C. sinensis var. assamica bao gồm: loài

16

(102), axit

arabinopyranosyl(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl-21,22-di-O-angeloyl-R1- 3-O-α-L-arabinopyranosyl(1→3)-β-D- barrigenol-23-oic glucuronopyranosyl-21-O-angeloyl-22-O-2-methylbutanoyl-R1 barrigenol 23- oic (103) và axit 3-O-α-L-arabinopyranosyl (1→3)-β-D-glucuronopyranosyl- 16α-O-acetyl-21-O-angeloyl-22-O-2-methylbutanoyl-R1-barrigenol-23-oic (104) [15].

tám oligoglycoside Theo nghiên cứu của Ohta,

triterpen: floraassamsaponin I-VIII (105-112) được phân lập từ nụ hoa của loài Camellia sinensis var. assamica. Các hợp chất floraassamsaponin II-IV (106- 108) và floraassamsaponin VII (111) đã được thử nghiệm hiệu quả ức chế sự tổng hợp của 42-mer amyloid β-protein (Aβ42), một loại protein gây ra bệnh Alzheimer. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất 107, 108 và 111 có hiệu quả ức chế đối với sự tổng hợp của Aβ42 với phần trăm ức chế (%) tương ứng là 107: 73.4±8.0 (p<0.01), 108: 68.8±8.4 (p<0.01), và 111: 56.9±13.2 (p<0.01) ở nồng độ 100 µM. Trong khi đó, hợp chất 106 có ảnh hưởng yếu hơn với phần trăm ức chế là 18.3±5.4 (p<0.01) ở cùng nồng độ [16].

17

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, chi trà mới chỉ có một vài nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Năm 2014, tác giả Trần Thị Liên đã nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của phụ phẩm trà trong quá trình chế biến trà khô của trà xanh Thái Nguyên. Tác giả đã phân lập được bốn hợp chất từ dịch chiết ethyl acetate của trà: epiafzelechin (4), epicatechin (5), epigallocatechin (6) và catechin (36). Đồng thời, dịch chiết nước từ trà và phân đoạn giàu polyphenol thể hiện hoạt tính kháng oxi hoá DPPH rất tốt, trong đó tốt nhất là phân đoạn giàu polyphenol có giá trị EC50 = 5.0 μg/ml tốt hơn chất đối chứng Resveratrol 1.66 lần và cao trà tổng có giá trị EC50 = 8.9 μg/ml, chất đối chứng (8.3 μg/ml) [17].

Nguyễn Thị Hương và cộng sự đã phân lập được hai saponin triterpene: camellioside I (113) và J (114), và hai glycoside megastigmane: camellistigoside A (115) và B (116) từ lá của loài Camellia bugiamapensis. Tác dụng ức chế của chúng đối với sự sản xuất NO do LPS gây ra trong các tế bào RAW264.7 đã được đánh giá. Trong số các hợp chất này, chỉ có camellioside I (113) cho thấy hoạt tính ức chế sản xuất NO với IC50 = 49.42 ± 1.34 µM, so với chất đối chứng dương là cardamonin (IC50 là 2.20 ± 0.27µM). Thử nghiệm khả năng sống của tế bào chỉ ra rằng hợp chất này ít hoặc không ảnh hưởng đến độc tính tế bào [18].

18

Gần đây, nhóm tác giả Nguyễn Thị Hồng Vân đã tiến hành chiết tách các hợp chất flavonoid từ hoa của loài Camellia chrysantha và thu được các hợp chất: (-)-epicatechin (5), (+)-catechin (36), quercetin (75), quercetin-3- O-methyl ete (117) và kaempferol (118) [19].

1.4. TỔNG QUAN VỀ TIỂU ĐƯỜNG

1.4.1. Khái quát về bệnh tiểu đường

Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao. Bệnh tiểu đường được chia làm hai loại chính sau:

- Tiểu đường tuýp 1 (còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin): cơ thể ngừng sản xuất insulin. Thường gặp ở trẻ em hoặc thiếu niên. Những bệnh nhân bị tiểu đường tuýp 1 cần phải được điều trị bằng insulin mỗi ngày để duy trì cuộc sống.

- Tiểu đường tuýp 2: là một chứng bệnh mạn tính phát triển khi tuyến tụy không sản xuất đủ insulin hoặc khi các mô trong cơ thể không thể sử dụng insulin một cách bình thường. Tiểu đường tuýp 2 rất phổ biến (chiếm trên 90% số trường hợp mắc bệnh), thường gặp ở người trên 40

19

tuổi trong đó người bị bệnh tiểu đường thường dễ bị một số bệnh đi kèm như tăng huyết áp, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đục thuỷ tinh thể... và thường có tuổi thọ ngắn hơn những người khác.

- Tiểu đường thai kỳ: đây là một tình trạng rối loại dung nạp glucose trong quá trình mang thai. Bệnh này làm tăng đường huyết trong thai nhi dẫn đến nguy cơ gây sảy thai, thai lưu, dị tật…

Bệnh tiểu đường thường gây ra những biến chứng nguy hiểm. Những biến chứng cấp tính của bệnh này có thể là hôn mê do tăng đường huyết, hạ đường huyết và tăng keto-axit máu. Các biến chứng lâu dài do bệnh tiểu đường gây ra gồm có các tổn thương thần kinh, tim mạch, thị giác, nguy cơ nhiễm trùng. Nguyên nhân là do lượng đường trong máu quá cao lâu ngày gây thương tổn các mạch máu nhỏ với hậu quả là mù mắt, suy thận, đồng thời thúc đẩy xơ mỡ động mạch (atherosclerosis) làm hẹp các động mạch lớn gây tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim... Ngoài ra, bệnh tiểu đường còn có ảnh hưởng xấu lên dây thần kinh, cơ tim, da, chân và răng lợi. Các biến chứng mãn tính xảy ra sớm hay muộn, nặng hay nhẹ rất khác biệt ở từng bệnh nhân.

1.4.2. Các thuốc điều trị bệnh tiểu đường

Để kiểm soát được đường huyết của các bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường thường kết hợp chế độ ăn phù hợp với dùng thuốc. Thuốc cho bệnh nhân tiểu đường có 2 loại cơ bản là thuốc dùng đường tiêm và thuốc viên uống.

1.4.2.1. Các thuốc điều trị tiểu đường dùng tiêm

- Isulin: Insulin là nội tiết tố của tuyến tuỵ do tế bào β của tiểu đảo Langerhans tiết ra. Insulin có tác dụng điều hoà đường huyết bằng cách đưa glucose qua màng tế bào vào chu trình Krebs. Sự tăng glucose trong máu có thể do thiếu insulin hay do insulin không thể hấp thụ vào các mô. Sự mất cân bằng này dẫn đến bất thường trong chuyển hoá glucid, lipid và protid. Insulin gắn vào receptor đặc hiệu trên màng tế bào, quá trình này sẽ hoạt hoá tyrosin kinase đặc hiệu của receptor ở trong tế bào và kinase này lại hoạt hoá protein kinase khác, bằng phản ứng phosphoryl hoá. Cuối cùng những enzym này có

20

thể phosphoryl hoá nhiều enzym quan trọng khác như glucokinase, glycogen synthetase....

- Amylin: Amylin là một hormon được bài tiết từ tế bào β của tuỵ cùng với insulin đóng vai trò hết sức quan trọng trong cơ chế điều hoà đường huyết. Trong tế bào β, insulin và amylin cùng được chứa trong mép nang tiết và cùng được bài tiết khi tăng đường huyết. Amylin có tác dụng ức chế bài tiết glucagon sau ăn và làm chậm tiêu hoá thức ăn ở dạ dày, chậm hấp thu đường ở ruột vì vậy làm cho đường huyết tăng chậm. Trong khi đó insulin có tác dụng tăng dự trữ glucose ở mỡ, cơ, xương và giảm sản xuất glucose ở gan, giảm tiết glucagon. Cả hai hormon này hoạt động tương trợ nhau giúp kiểm soát đường huyết tốt hơn.

1.4.2.2. Các thuốc điều trị tiểu đường dùng đường uống

Nhiều thuốc có tác dụng hạ đường huyết được đưa vào cơ thể bằng đường uống. Theo cấu trúc và cơ chế tác dụng các chất này được chia thành 5 nhóm sau:

- Các thuốc nhóm dẫn xuất biguanide:

Chất đầu tiên thuộc biguanide tìm thấy có tác dụng hạ đường huyết là

Metformin vào năm 1948. Dẫn xuất biguanid có công thức chung như sau:

Trong nhóm biguanide gồm có: metformin, buformin, phenformin. Vì nguy cơ gây nhiễm acid lactic nên buformin, phenformin ngày nay ít được sử dụng. Cơ chế tác dụng của các thuốc nhóm này như sau:

+ Làm tăng tác dụng của insulin tại thụ thể và hậu thụ thể

+ Tăng sử dụng glucose ở tổ chức ngoại vi, đặc biệt ở tế bào cơ

+ Giảm sinh glucose ở gan

+ Giảm hấp thu glucose ở ruột

21

+ Tăng sự nhạy cảm của insulin ở thụ thể và hậu thụ thể

Chúng không có tác dụng kích thích bài tiết insulin ở tuỵ như các sulfamide chống tiểu đường.

- Các thuốc nhóm dẫn xuất sulfamide:

Khái niệm sulfamide chống tiểu đường xuất hiện từ năm 1942, sau khi Laubatiere thử nghiệm một loại sulfamide kháng khuẩn trên bệnh nhân thương hàn thấy có dấu hiệu hạ đường huyết. Nhưng mãi tới năm 1995 người ta mới thực sự tìm ra những chất có tác dụng điều trị thuộc nhóm dẫn xuất benzen sulfonylurea với các gốc ankyl có công thức chung là:

Chất đầu tiên được đưa vào điều trị là Carbutamide (R1= ̶ NH2, R2 = n ̶ C4H9) được dùng điều trị bệnh tiểu đường dưới dạng thuốc uống vào năm 1955. Sau nhiều năm nghiên cứu người ta thấy rằng không nhất thiết phải có nhóm -NH2 gắn với nhân thơm và khi thay nhóm ̶ NH2 bằng nhóm ̶ CH3, ̶ Cl hay một nhóm thế khác thì vẫn có tác dụng tốt và độc tính giảm đi. Cơ chế tác dụng là kích thích bài tiết insulin. Trong trạng thái sinh lý, đường huyết tăng cao sẽ có hiện tượng khoá kênh K+ ̶ ATP, dẫn tới K+ trong tế bào tăng đột ngột sẽ kích thích hoạt động của kênh Ca++ dưới tác động của AMP vòng, Ca++ vào tế bào tăng. Kích thích quá trình phosphoryl hoá và giải phóng insulin từ nang tiết vào máu. sulfamide có tác dụng như một cái khoá hoạt động trên kênh K+ ̶ ATP và vì vậy có tác dụng kích thích bài tiết insulin.

Cho đến nay có rất nhiều sulfamide hạ đường huyết đã được khám phá và đưa vào điều trị. Dựa vào thời gian duy trì tác dụng (nhanh hoặc kéo dài) và liều dùng mà người ta chia sulfamide hạ đường huyết thành hai thế hệ, thế hệ một và thế hệ hai.

Các sulfamide hạ đường huyết thế hệ một gồm có: carbutamide, tolbutamide, phenbutamide, metabutamide, chlorpropamide, tolcyclamide, acetohexamide, metahexamide, tolazamide.

22

Các sulfamide hạ đường huyết thế hệ hai cũng là các dẫn xuất của sulfonylurea có công thức tổng quát giống như sulfamide hạ đường huyết thế hệ thứ nhất nhưng được tìm ra trong thập kỷ 70 và đầu thập kỷ 80, nó bao gồm các phân tử có cấu trúc nhóm thế phức tạp hơn, có mạch cacbon dài hơn, có hiệu lực tác dụng mạnh hơn và tác dụng kéo dài hơn nên thường mỗi ngày chỉ phải uống một lần. Các sulfamide hạ đường huyết thế hệ hai gồm có glypinamide, gliclazide, glibonuride, glibenclamide, glipizide, glisoxepide, gliquidon, glimepiride.

Trong số các sulfamide hạ đường huyết liệt kê ở trên thì tolbutamide, chlorpropamide và glibenclamide hiện đang được sử dụng phổ biến nhất trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2 ở nước ta.

- Các thuốc nhóm ức chế enzyme α-glucosidase: các thuốc loại này có tác dụng ngăn không cho hấp thu glucose vào máu. Vì thế có ưu điểm là không có nguy cơ gây hạ đường máu, không gây tăng cân (như: insulin và các sulfamid hạ đường huyết khác). Ngày nay trên thị trường xuất hiện một số thuốc ức chế enzyme α-glucosidase có tác dụng gây hạ đường huyết sau đây:

+ Acarbose:

23

Acarbose hoạt động theo cơ chế ức chế cạnh tranh sự phân giải đường phức. Acarbose là một phân tử được tổng hợp từ Actiplanes (vi khuẩn) bằng kỹ thuật sinh học. Hoạt động của nó làm chậm tiêu hóa đường bằng cách ức chế cạnh tranh enzyme α -glucosidase ruột và các yếu tố enzyme ở ruột non có nhiệm vụ tách các đường phức thành các đường đơn. Kết quả là kéo dài thời gian thủy phân các đường đôi dẫn đến việc tiêu hóa các đường này bị chậm lại. Thuốc có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase ở rìa bàn chải niêm mạc ruột non. Ngoài ra còn ức chế các enzym thuỷ phân đường đa ở ruột, do vậy làm giảm hấp thu glucose.

+ Voglibose (Basen): Voglibose là một chất ức chế α-glucosidase được sử dụng để làm giảm mức đường huyết sau ăn ở những người bị tiểu đường. Voglibose làm chậm sự hấp thu glucose do đó làm giảm nguy cơ biến chứng mạch máu vĩ mô.

- Benfluorex: Benfluorex có tác dụng tạo thuận lợi cho sự xâm nhập và sử dụng glucose ở tế bào, không có tác dụng trên sự bài tiết insulin, ngoài ra

24

- Các thuốc nhóm meglitinide: Các thuốc nhóm meglitinide liên kết với kênh K+ (KATP) phụ thuộc ATP trên màng tế bào của các tế bào beta tuyến tụy theo cách tương tự như sulfoamide nhưng có ái lực liên kết yếu hơn và phân ly nhanh hơn từ vị trí gắn SUR1. Điều này làm tăng nồng độ kali nội bào. Sự khử cực này mở các kênh Ca2+ có điện áp. Sự gia tăng canxi nội bào dẫn đến tăng phản ứng tổng hợp insulin trong màng tế bào, và do đó tăng tiết insulin. Hiện nhóm này có 2 hoạt chất chính là repaglinide (Prandin) và nateglinide (Starlix).

còn có tác dụng giảm lipid máu. Thuốc dùng để hỗ trợ cho chế độ ăn kiêng trong bệnh tiểu đường.

- Các thuốc nhóm thiazolidinedione (TZD hay glitazone): Các thuốc nhóm TZD có tác dụng làm tăng nhạy cảm của insulin tại các mô trong cơ thể và giảm rối loạn mỡ máu tương tự như nhóm Biguanide. Nhưng thuốc lại làm tăng tích trữ mỡ dưới da nên thường gây tăng cân cho người bệnh. Mặt khác còn gây giữ nước, do đó cần thận trọng khi sử dụng điều trị cho những người bệnh tim mạch hay viêm gan, men gan tăng cao. Thuốc đang được dùng là rosiglitazone và pioglitazone, nhóm này trước đây có troglitazone nhưng nay đã bị cấm vì tác hại gây độc với gan, dẫn tới suy gan và tử vong.

25

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu lá trà Shan tuyết (Camellia sinensis var. assamica (J.W.MAST.) Kitam.) được thu hái tại Nguyên Bình, Cao Bằng, Việt Nam vào tháng 4/2019. Tên khoa học được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản (NCCT-P86) được lưu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất

 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.

 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.

 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC

(30-50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20

(Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

26

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ NMR đo

trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC.

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD hoặc DMSO-

d6.

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành đường glucose và p- nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng, không bị ức chế sẽ giảm theo. Mật độ quang (OD) của p- nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo ở bước sóng 405 nm và được dùng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của mẫu thử.

Cách tiến hành:

- Sử dụng phiến 96-giếng

- Trong mỗi giếng chứa mẫu nghiên cứu (50 L) đã ủ với enzyme α- glucosidase (100 L) trong 10 phút ở 25oC sau đó bổ sung p- nitrophenyl- α- D-glucopyranoside (50 L), ủ trong 5 phút ở 25oC. Đo OD ở bước sóng 405 nm.

27

- Chất đối chứng dương: Acarbose

- Kết quả được tính theo công thức sau:

% Ức chế =

Trong đó:

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu

thử, có α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử

và α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%);

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử;

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-

glucosidase).

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm.

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên

phần mềm Graphpad Prism 5.0.

2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.3.1. Hóa chất

Dung môi: methanol, dichloromethane, ethyl acetate, acetonitrile, n-

hexan, dichloromethane, acetone, sulfuric acid, nước cất.

2.3.2. Thiết bị

 Bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254S

(Merck)

 Bản mỏng điều chế tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875)

 Đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm

 Chất hấp phụ silica gel (Silica gel 240-430 mesh, Merck)

 Chất hấp phụ pha đảo (ODS hoặc YMC 30-50 m, Fuji Silysia, Nhật Bản)

 Máy fraction collector EYELLA DC-1200

28

 Máy cộng hưởng từ hật nhân Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer.

29

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

Mẫu lá trà Shan tuyết khô (5 kg) được nghiền nhỏ ngâm trong bể siêu âm với methanol ba lần (mỗi lần 15L, 30 phút). Dịch chiết methanol được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 400 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được phân tán vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi tăng dần độ phân cực (dichloromethane, ethyl acetate). Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng dichloromethane (CA1A, 100.0 g), ethyl acetate (CA1B, 70.0 g) và dịch nước (CA1C).

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài trà Shan tuyết C. sinensis var.

assamica

30

Tiếp đó, phần cặn ethyl acetate được đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2/MeOH (50/1, 20/1, 10/1, 2/1, v/v) thu được bốn phân đoạn CA1B1-CA1B4. Phân đoạn CA1B2 được đưa lên cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH/nước (1/1.5, v/v) thu được ba phân đoạn CA1B2A (1.5 g), CA1B2B (1.9 g) và CA1B2C (2.0 g). Phân đoạn CA1B2A được tinh chế trên máy HPLC (cột J’sphere M-80, dài 150 mm×20 mm ID, sử dụng 25% acetonitrile trong nước, tốc độ 3 mL/min) thu được bốn hợp chất CA1 (6 mg), CA3 (98 mg), CA5 (76 mg) và CA9 (30 mg). Phân đoạn CA1B2B được tinh chế trên máy HPLC (cột J’sphere M-80, dài 150 mm×20 mm ID, sử dụng 28% acetonitrile trong nước, tốc độ 3 mL/min) thu được hai hợp chất CA2 (3 mg) và CA4 (30 mg). Phân đoạn CA1B4 được đưa lên cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH/nước (1/2.0, v/v) thu được ba phân đoạn CA1B4A (0.9 g), CA1B4B (3.5 g) và CA1B4C (2.5 g). Phân đoạn CA1B4A và CA1B4B được lần lượt phân tách trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải bằng MeOH/nước (1/1, v/v) thu được CA6 (20 mg) và CA7 (500 mg). Phân đoạn CA1B4C được tinh chế trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (5/1, v/v) thu được CA8 (500 mg).

3.2. THÔNG SỐ VẬT LÍ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC

3.2.1. Hợp chất CA1

Tên: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-(4′′′-methoxy)galloyl]-β-D- glucopyranoside (chất mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử: C28H30O12. Khối lượng phân tử: 558

HR-ESI-MS: m/z 593.1429 [M+Cl] –

1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.1.

Tính toán lý thuyết cho công thức [C28H30O12Cl] –, 593.1426

31

3.2.2. Hợp chất CA2

5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-(3′′′,4′′′-

Tên: dimethoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside (chất mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử: C29H32O12.

Khối lượng phân tử: 572

HR-ESI-MS: m/z 607.1574 [M+Cl] –

1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.2.

Tính toán lý thuyết cho công thức [C29H32O12Cl] –, 607.1582

3.2.3. Hợp chất CA3

Tên: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-glucopyranoside

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử: C20H24O8

1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.3.

Khối lượng phân tử: 392

3.2.4. Hợp chất CA4

Tên: Sasastilboside A

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử: C21H26O8.

1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.4.

Khối lượng phân tử: 406

3.2.5. Hợp chất CA5

Tên: 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử: C20H24O8.

32

1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.5.

Khối lượng phân tử: 392

3.2.6. Hợp chất CA6

Tên: Epicatechin

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C15H14O6.

1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.6

Khối lượng phân tử: 290

3.2.7. Hợp chất CA7

Tên: Epicatechin 3-O-gallate

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C22H18O10

1H-NMR (CD3OD): H 5.05 (br s, H-2),5.55 (H-3), 2.89 (dd, J = 2.0, 17.0 Hz, H-4)/ 3.02 (dd, J = 4.5, 17.0 Hz, H-4), 6.00 (s, H-6/H-8), 6.97 (d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.73 (d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.84 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6′) và 6.98 (s, H-2″/H-6″).

13C-NMR (CD3OD): C 78.5 (C-2), 70.0 (C-3), 26.8 (C-4), 157.8 (C-5), 96.6 (C-6), 157.8 (C-7), 95.9 (C-8), 157.2 (C-9), 99.4 (C-10), 131.4 (C- 1′), 115.1 (C-2′), 145.9 (C-3′), 145.9 (C-4′), 116.0 (C-5′), 119.4 (C-6′), 121.5 (C-1′′), 110.2 (C-2′′/C-6′′), 146.2 (C-3′′/C-5′′), 139.7 (C-4′′) và 167.6 (C-7′′).

Khối lượng phân tử: 442

3.2.8. Hợp chất CA8

Tên: Epigallocatechin 3-O-gallate

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C22H18O11

Khối lượng phân tử: 458

33

1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem Bảng 4.7.

3.2.9. Hợp chất CA9

Tên: Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C21H20O11

1H-NMR (DMSO-d6): H 6.20 (d, J = 1.5 Hz, H-6), 6.43 (d, J = 1.5 Hz, H-8), 8.04 (d, J = 9.0 Hz, H-2′/H-6′) và 6.88 (d, J = 9.0 Hz, H-3′/H-5′).

13C-NMR (DMSO-d6):C 156.2 (C-2), 133.2 (C-3), 177.5 (C-4), 161.2 (C-5), 98.8 (C-6), 164.4 (C-7), 93.7 (C-8), 156.4 (C-9), 103.9 (C-10), 120.9 (C-1′), 130.9 (C-2′/C-6′), 115.1 (C-3′/C-5′), 160.0 (C-4′), 100.9 (C-1′′), 74.2 (C-2′′), 76.4 (C-3′′), 69.9 (C-4′′), 77.5 (C-5′′) và 60.9 (C-6′′).

Khối lượng phân tử: 448

3.3. ĐÁNH GIÁ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME α- GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT

Các hợp chất CA6-CA9 được đánh giá sơ bộ hoạt tính ức chế enzyme

α-Glucosidase

34

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT

4.1.1. Hợp chất CA1: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-

(4′′′-methoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside (chất mới)

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của CA1 và hợp chất tham khảo CA1a

Hợp chất CA1 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử của CA1 được xác định là C28H30O12 dựa trên phổ HR-ESI-MS m/z 593.1429 [M+Cl] – (tính toán theo lý thuyết cho công thức [C28H30O12Cl] – , 593.1426).

Phổ 1H-NMR của hợp chất CA1 thấy xuất hiện tín hiệu bốn proton của một vòng thơm thế p- tại δH 6.65 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 6.82 (2H, d, J = 8.5 Hz), ba proton của một vòng thơm thế 1,3,5- tại δH 6.20 (dd, J = 1.0, 2.0 Hz, 1H), 6.28 (1H, dd, J = 1.0, 2.0 Hz) và 6.36 (1H, dd, J = 2.0, 2.0 Hz), hai proton của một vòng thơm thế 1,3,4,5- tại δH 7.11(2H, s), hai nhóm methylene tại δH 2.58 (1H, m)/2.65 (1H, m) và 2.61 (1H, m)/2.71 (1H, m), một nhóm methoxy ở δH 3.85 (3H, s), và một proton anomeric ở δH 4.69 (1H, d, J = 7.5 Hz). Phổ 13C-NMR và HSQC của CA1 thể hiện tín hiệu của 28 carbon, bao gồm 10 carbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 126.5, 133.8, 141.3, 145.6, 151.8×2, 159.0, 156.3, 159.9 và 167.8), 14 carbon methine (δC 71.8, 74.8, 75.5, 77.8, 102.4, 103.1, 109.2, 110.4×2, 111.1, 116.0×2, 130.6×2), 3 carbon methylene (δC 37.8, 39.2 và 65.1), và một nhóm methoxy (δC 60.7). Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CA1 cho thấy đây tự hợp chất 5,4′- là một dẫn xuất của dihydrostilbene, tương

35

dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-glucopyranoside (CA1a) [20], ngoại trừ sự xuất hiện thêm một nhóm 4′′′-methoxygalloyl tại glc C-6′′.

Bảng 4.1. Số liệu NMR của CA1 và chất tham khảo CA1a

a,c (mult., J = Hz)

δH - 6.20 (dd, 1.0, 2.0) - 6.36 (dd, 2.0, 2.0) - 6.28 (dd, 1.0, 2.0) 2.58 (m)/2.65 (m) 2.61 (m)/2.71 (m) - 6.82 (d, 8.5) 6.65 (d, 8.5) -

C 1 2 3 4 5 6 α α′ 1′ 2′,6′ 3′,5′ 4′ O-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′

4.69 (d, 7.5) 3.45 (m) 3.51 (t, 9.0) 3.42 (m) 3.69 (m) 4.38 (dd, 6.5, 12.0) 4.68 (dd, 2.0, 12.0)

Mgal 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ 7′′′ 4′′′-OMe

# δC 145.5 109.2 159.9 102.6 159.0 110.7 39.4 37.8 133.9 130.4 115.9 156.2 102.1 74.8 77.9 71.2 77.9 62.4

a,b δC 145.6 109.2 159.9 103.1 159.0 111.1 39.2 37.8 133.8 130.6 116.0 156.3 102.4 74.8 77.8 71.8 75.5 65.1 126.5 110.4 151.8 141.3 151.8 110.4 167.8 60.7

- 7.11 (s) - - - 7.11 (s) - 3.85 (s)

ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, Glc, glucopyranosyl; Mgal, 4′′′-methoxygalloyl, #δC của 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-glucopyranoside đo trong CD3OD.

Tương tác trên phổ HMBC giữa H-2′/H-6′ (δH 6.82) và C-4′ (δC 156.3), giữa H-3′/H-5′ (δH 6.65) và C-1′ (δC 133.8)/C-4′ (δC 156.3), giữa H-2 (δH

36

6.20) và C-3 (δC 159.9)/C-4 (δC 103.1)/C-6 (δC 111.1), giữa H-6 (δH 6.28) và C-2 (δC 109.2)/C-4 (δC 103.1) gợi ý vị trí nhóm hydroxy tại C-5 và C-4′. Thủy phân CA1 trong môi trường acid thu được đường D-glucose (xác định theo phương pháp thủy phân đường và phân tích GC) [21], kết hợp với tín hiệu proton glc H-1′′ [δH 4.69 (d, J = 7.5 Hz)] trên phổ 1H-NMR cho phép xác định phân tử đường trong hợp chất CA1 là β-D-glucopyranosyl. Vị trí của đường β-D-glucopyranosyl tại C-3 được xác định dựa trên tương tác HMBC từ glc H-1′′ (δH 4.69) đến C-3 (δC 159.9). Vị trí nhóm 4′′′-methoxygalloyl tại glc C- 6′′ được xác định dựa trên tương tác HMBC từ glc H-6′′ (δH 4.38/4.68) đến C- 7′′′ (δC 167.8). Dựa vào các dữ liệu trên, cấu trúc của CA1 đã được xác định. Đây là một hợp chất mới và có tên gọi là 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O- [6′′-O-(4′′′-methoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside.

Hình 4.2. Các tương tác HMBC và COSY chính của CA1

37

Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CA1

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA1

38

Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA1

Hình 4.6. Phổ HSQC của hợp chất CA1

39

Hình 4.7. Phổ HMBC của hợp chất CA1

Hình 4.8. Phổ COSY của hợp chất CA1

40

4.1.2. Hợp chất CA2: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-

(3′′′,4′′′-dimethoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside (chất mới)

Hình 4.9. Cấu trúc hóa học của CA2 và hợp chất tham khảo CA1

Hợp chất CA2 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử của CA2 được xác định là C29H32O12 dựa vào phổ HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 607.1574 [M+Cl] – (tính toán lý thuyết cho công thức [C29H32O12Cl] –, 607.1582).

Bảng 4.2. Số liệu NMR của CA2 và chất tham khảo CA1

a,c (mult., J = Hz)

δH - 6.20 (dd, 1.5, 1.5) - 6.35 (dd, 1.5, 2.0) - 6.27 (dd, 1.5, 2.0) 2.49 (m)/2.61 (m) 2.61 (m)/2.70 (m) - 6.81 (d, 8.5) 6.65 (d, 8.5) -

C 1 2 3 4 5 6 α α′ 1′ 2′,6′ 3′,5′ 4′ O-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′

# δC 145.6 109.2 159.9 103.1 159.0 111.1 39.2 37.8 133.8 130.6 116.0 156.3 102.4 74.8 77.8 71.8

a,b δC 145.5 109.0 159.9 103.1 159.1 111.0 39.2 37.8 133.8 130.5 116.0 156.3 102.3 74.8 77.8 72.0

4.72 (d, 8.0) 3.45 (dd, 8.0, 9.0) 3.51 (t, 9.0) 3.42 (m)

41

5′′ 6′′

3.72 (m) 4.36 (dd, 7.0, 12.0) 4.77 (dd, 2.0, 12.0)

ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, Glc, glucopyranosyl; Dmgal, 3′′′,4′′′-dimethoxygalloyl, Mgal, 4′′′-methoxygalloyl.

1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ 7′′′ 3′′′-OMe 4′′′-OMe 75.5 65.4 Dmgal 126.5 106.3 154.4 142.3 151.7 112.2 167.6 56.5 61.0 - 7.18 (d, 2.0) - - - 7.25 (d, 2.0) - 3.80 (s) 3.83 (s) 75.5 65.1 Mgal 126.5 110.4 151.8 141.3 151.8 110.4 167.8 60.7

Phổ 1H-NMR của hợp chất CA2 xuất hiện tín hiệu của bốn proton của một vòng thơm thế p- tại δH 6.65 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 6.81 (2H, d, J = 8.5 Hz), ba proton của một vòng thơm thế 1,3,5- tại δH 6.20 (1H, dd, J = 1.5, 1.5 Hz), 6.27 (1H, dd, J = 1.5, 2.0 Hz) và 6.35 (1H, dd, J = 1.5, 2.0 Hz), hai proton của một vòng thơm thế 1,3,4,5- tại δH 7.18 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 7.25 (1H, d, J = 2.0 Hz), hai nhóm methylene tại 2.49 (1H, m)/2.61 (1H, m) và 2.61 (1H, m)/2.70 (1H, m), hai nhóm methoxy tại δH 3.80 (3H, s) và 3.83 (3H, s), và một proton anomeric δH 4.72 (1H, d, J = 8.0 Hz). Phổ 13C-NMR và HSQC cho thấy tín hiệu của 29 carbon, bao gồm 10 carbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 126.5, 133.8, 142.3, 145.5, 151.7, 154.4, 156.3, 159.1, 159.9, 167.6), 14 carbon methine (δC 72.0, 74.8, 75.5, 77.8, 102.3, 103.1, 106.3, 109.0, 111.0, 112.2, 116.0×2, 130.5×2), 3 carbon methylene (δC 37.8, 39.2, 65.4), 2 nhóm methoxy (δC 56.5, 61.0). Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CA2 cho thấy đây là một dẫn xuất dihydrostilbene, tương tự hợp chất CA1, ngoại trừ sự thay thế nhóm 4′′′-methoxygalloyl bằng nhóm 3′′′,4′′′-dimethoxygalloyl.

42

Hình 4.10. Các tương tác HMBC và COSY chính của CA2

Tương tác trên phổ HMBC giữa H-2′/H-6′ (δH 6.81) và C-4′ (δC 156.3), giữa H-3′/H-5′ (δH 6.65) và C-1′ (δC 133.8)/C-4′ (δC 156.3), giữa H-2 (δH 6.20) và C-3 (δC 159.9)/C-4 (δC 103.1)/C-6 (δC 111.0), giữa H-6 (δH 6.27) và C-2 (δC 109.0)/C-4 (δC 103.1) gợi ý vị trí nhóm hydroxy tại C-5 và C-4′. Vị trí của đường β-D-glucopyranosyl tại C-3 được xác định dựa trên tương tác HMBC từ glc H-1′′ (δH 4.72) đến C-3 (δC 159.9). Vị trí nhóm 3′′′,4′′′- dimethoxygalloyl tại glc C-6′′ được xác định dựa trên tương tác HMBC từ glc H-6′′ (δH 4.38/4.68) đến C-7′′′ (δC 167.8). Từ các dữ liệu trên, hợp chất mới CA2 được xác định là 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-(6-O-(3′′′,4′′′- dimethylgalloyl))-β-D-glucopyranoside.

Hình 4.11. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất CA2

43

Hình 4.12. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA2

Hình 4.13. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA2

44

Hình 4.14. Phổ HSQC của hợp chất CA2

Hình 4.15. Phổ HMBC của hợp chất CA2

45

Hình 4.16. Phổ COSY của hợp chất CA2

Hình 4.17. Phổ NOESY của hợp chất CA2

46

4.1.3. Hợp chất CA3: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-

glucopyranoside

Hình 4.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA3

Phổ 1H-NMR của hợp chất CA3 xuất hiện tín hiệu của bốn proton của một vòng thơm thế p- tại δH 6.69 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 6.98 (2H, d, J = 8.5 Hz), ba proton của một vòng thơm thế 1,3,5- tại δH 6.32 (1H, dd, J = 1.5, 2.0 Hz), 6.40 (1H, dd, J = 2.0, 2.0 Hz) và 6.42 (1H, dd, J = 1.5, 2.0 Hz), hai nhóm methylene tại δH 2.76 (2H, m) và δH 2.79 (2H, m), và một proton anomeric tại δH 4.82 (1H, d, J = 7.5 Hz). Phổ 13C-NMR và HSQC của CA3 thấy xuất hiện tín hiệu của 20 carbon, bao gồm 5 carbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 134.0, 145.6, 156.3, 159.2 và 160.0), 12 carbon methine (δC 71.4, 74.9, 78.0×2, 102.2, 102.7, 109.3, 110.8, 116.0×2, 130.4×2), 3 carbon methylene (δC 37.9, 39.4, 62.5). Phân tích số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CA3 cho thấy số liệu phổ của CA3 giống với hợp chất 5,4′- dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-glucopyranoside [20].

Vị trí các nhóm hydroxyl tại C-5 và C-4′ của hợp chất CA3 được xác định bằng tương tác HMBC từ H-6 (δH 6.32) đến C-2 (δC 109.3)/C-4 (δC 102.7)/C-5 (δC 159.2) và từ H-2′ (δH 6.98) đến C-1′ (δC 134.0)/C-3′ (δC 116.0)/C-4′ (δC 156.3)/C-6′(δC 130.4). Tương tác HMBC giữa H-1′′ (δH 4.82) và C-3 (δC 160.0) gợi ý vị trí của β-D-glucopyranosyl tại C-3. Từ các dẫn chứng trên kết hợp với tra cứu tài liệu, cấu trúc hóa học của CA3 được xác định là 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D-glucopyranoside.

47

Bảng 4.3. Số liệu NMR của CA3 và chất tham khảo

a,c (mult., J = Hz)

C 1 2 3 4 5 6 α α′ 1′ 2′,6′ 3′,5′ 4′ O-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′

# δC 145.5 109.2 159.9 102.6 159.0 110.7 39.4 37.8 133.9 130.4 115.9 156.2 102.1 74.8 77.9 71.2 77.9 62.4

a,b δC 145.6 109.3 160.0 102.7 159.2 110.8 39.4 37.9 134.0 130.4 116.0 156.3 102.2 74.9 78.0 71.4 78.0 62.5

ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #δC của 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D- glucopyranoside đo trong CD3OD.

δH - 6.42 (dd, 1.5, 2.0) - 6.40 (dd, 2.0, 2.0) - 6.32 (dd, 1.5, 2.0) 2.76 (m) 2.79 (m) - 6.98 (d, 8.5) 6.69 (d, 8.5) - 4.82 (d, 7.5) 3.44 (m) 3.47 (m) 3.41 (m) 3.41 (m) 3.73 (dd, 5.0, 12.0) 3.91 (dd, 1.0, 12.0)

48

Hình 4.19. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA3

Hình 4.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA3

49

Hình 4.21. Phổ HSQC của hợp chất CA3

Hình 4.22. Phổ HMBC của hợp chất CA3

50

4.1.4. Hợp chất CA4: Sasastilboside A

Hình 4.23. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA4

Hợp chất CA4 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA4 xuất hiện tín hiệu của bốn proton của một vòng thơm thế p- tại δH 7.01 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 7.08 (2H, d, J = 8.5 Hz), ba proton của một vòng thơm thế 1,3,5- tại δH 6.20 (1H, dd, J = 1.5, 2.0 Hz), 6.23 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.24 (1H, d, J = 1.5 Hz), hai nhóm methylene tại δH 2.75 (2H, t, J = 8.0 Hz) và 2.83 (2H, t, J = 8.0 Hz), một nhóm methoxy tại δH 3.70 (3H, s), và một proton anomeric tại δH 4.88 (1H, d, J = 7.5 Hz).

Phổ 13C-NMR và HSQC của CA4 xuất hiện tín hiệu của 21 carbon, bao gồm 5 carbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 137.1, 145.3, 157.3, 159.3 và 162.1), 12 carbon methine (δC 71.4, 74.9, 77.9, 78.0, 99.9, 102.5, 106.7, 109.1, 117.6×2 và 130.4×2), 3 carbon methylene (δC 37.8, 39.3, và 62.5), và một nhóm methoxy (δC 55.5). Từ các phân tích dữ liệu phổ NMR cho thấy cấu trúc hóa học của hợp chất này giống với của hợp chất sasastilboside A [22].

Vị trí của nhóm hydroxy ở C-5 và nhóm methoxy ở C-3 được xác định bằng tương tác HMBC giữa H-2 (δH 6.23) và C-3 (δC 162.1)/C-4 (δC 99.9)/C- 6 (δC 109.1), giữa H-6 (δH 6.24) và C-2 (δC 106.7)/C-4 (δC 99.9)/C-5 (δC 159.3), giữa nhóm methoxy (δH 3.70) và C-3 (δC 162.1). Tương tác HMBC

51

giữa glc H-1′′ (δH 4.88) và C-4′ (δH 157.3) xác định vị trí của β-D- glucopyranosyl ở C-4′. Dựa trên những bằng chứng phổ, hợp chất CA4 được xác định là sasastilboside A.

Bảng 4.4. Số liệu NMR của CA4 và chất tham khảo

a,c (mult., J = Hz)

C 1 2 3 4 5 6 α α′ 1′ 2′,6′ 3′,5′ 4′ 3-OMe O-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′

# δC 145.3 106.7 162.1 99.9 159.3 109.1 39.3 37.8 137.1 130.4 117.6 157.3 55.5 102.5 74.9 78.0 71.4 77.9 62.5

a,b δC 145.3 106.7 162.1 99.9 159.3 109.1 39.3 37.8 137.1 130.4 117.6 157.3 55.5 102.5 74.9 78.0 71.4 77.9 62.5

ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, Glc, glucopyranosyl, #δC của sasatilboside A đo trong CD3OD.

δH - 6.23 (d, 2.0) - 6.20 (dd, 1.5, 2.0) - 6.24 (d, 1.5) 2.75 (t, 8.0) 2.83 (t, 8.0) - 7.08 (d, 8.5) 7.01 (d, 8.5) - 3.70 (s) 4.88 (d, 7.5) 3.47 (m) 3.43 (m) 3.42 (m) 3.48 (m) 3.72 (dd, 5.0, 12.0) 3.91 (dd, 1.5, 12.0)

52

Hình 4.24. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA4

Hình 4.25. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA4

53

Hình 4.26. Phổ HSQC của hợp chất CA4

Hình 4.27. Phổ HMBC của hợp chất CA4

54

4.1.5. Hợp chất CA5: 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′-O-β-D-

glucopyranoside

Hình 4.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA5

Hợp chất CA5 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA5 cho thấy tín hiệu một vòng thơm thế p- tại δH 7.01 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 7.08 (2H, d, J = 8.5 Hz), ba proton của một vòng thơm thế 1,3,5- tại δH 6.13 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.16 (2H, d, J = 2.0 Hz), hai nhóm methylene tại δH 2.71 (2H, t, J = 7.0 Hz) và 2.81 (2H, t, J = 7.0 Hz), và một proton anomeric tại δH 4.88 (1H, d, J = 7.5 Hz).

Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất CA5 xuất hiện tín hiệu của 20 carbon, bao gồm 5 carbon không liên kết trực tiếp với hydro (δC 137.1, 145.3, 157.2 và 159.2×2), 12 carbon methine (δC 71.3, 74.9, 77.9×2, 101.2, 102.4, 108.1×2, 117.6×2 và 130.3×2), 3 carbon methylene (δC 37.8, 39.1 và 62.5).

Để xác định vị trí các nhóm chức của hợp chất CA5, phép đo HMBC được tiến hành. Các tương tác HMBC giữa H-4 (δH 6.13) và C-2/C-6 (δC 108.1)/C-3/C-5 (δC 159.2) gợi ý vị trí nhóm hydroxyl tại C-3 và C-5. Tương tác giữa H-1′′ (δH 4.88) và C-4′ (δC 157.2) gợi ý vị trí đường β-D- glucopyranosyl tại C-4′. Dựa vào những phân tích trên kết hợp so sánh các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CA5 với hợp chất tham khảo 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside [23], cấu trúc của

55

hợp chất CA5 được xác định là 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′-O-β-D- glucopyranoside.

Bảng 4.5. Số liệu NMR của CA5 và chất tham khảo

a,c (mult., J = Hz)

C 1 2 3 4 5 6 α α′ 1′ 2′,6′ 3′,5′ 4′ O-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′

a,b δC 145.3 108.1 159.2 101.2 159.2 108.1 39.1 37.8 137.1 130.3 117.6 157.2 102.4 74.9 77.9 71.3 77.9 62.5

# δC 145.4 108.1 159.3 101.2 159.3 108.1 39.3 38.0 137.1 130.4 117.6 157.4 102.5 74.9 78.1 71.4 78.0 62.5

δH - 6.16 (d, 2.0) - 6.13 (d, 2.0) - 6.16 (d, 2.0) 2.71 (t, 7.0) 2.81 (t, 7.0) - 7.08 (d, 8.5) 7.01 (d, 8.5) - 4.88 (d, 7.5) 3.43 (m) 3.48 (m) 3.43 (m) 3.49 (m) 3.73 (dd, 5.0, 12.0) 3.91 (dd, 1.5, 12.0) ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #δC của 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′-O- β-D-glucopyranoside đo trong CD3OD [23]

56

Hình 4.29. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA5

Hình 4.30. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA5

57

Hình 4.31. Phổ HSQC của hợp chất CA5

Hình 4.32. Phổ HMBC của hợp chất CA5

58

4.1.6. Hợp chất CA6: Epicatechin

Hình 4.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA6

Hợp chất CA6 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của CA6 thấy xuất hiện các tín hiệu proton thơm tại H 5.95 (1H, s), 5.98 (1H, s), 6.79 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.82 (1H, d, J = 8.5 Hz) và 7.00 (1H, s). Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu của hai proton oxymethine tại

H 4.20* và 4.85 (1H, br s), và một proton methylene tại H 2.76 (1H, dd, J = 2.5, 17.0 Hz)/2.88 (1H, dd, J = 4.5, 17.0 Hz). Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất CA6 xuất hiện tín hiệu của 15 carbon đặc trưng cho một hợp chất

flavan, bao gồm 12 carbon của hai vòng thơm tại C 95.9, 96.5, 100.1, 115.3, 115.9, 119.4, 132.2, 145.7, 145.9, 157.3, 157.6 và 157.9; hai carbon

oxymethine tại C 67.4 và 79.8; và một carbon methylene tại C 29.2.

Bảng 4.6. Số liệu NMR của CA6 và chất tham khảo

a,c (mult., J = Hz)

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′

# δC 79.2 67.0 28.7 156.6 95.7 156.8 96.3 157.2 99.7 131.8 114.8 145.1 145.2

a,b δC 79.8 67.4 29.2 157.6 95.9 157.9 96.5 157.3 100.1 132.2 115.3 145.7 145.9

δH 4.85 (br s) 4.20* 2.76 (dd, 2.5, 17.0) 2.88 (dd, 4.5, 17.0) - 5.95 (s) - 5.98 (s) - - - 7.00 (s) - -

59

ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz,* tín hiệu bị chập, #δC của Epicatechin đo trong acetone-d6.

5′ 6′ 115.7 119.1 115.9 119.4 6.79 (d, 8.5) 6.82 (d, 8.5)

Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác giữa H-6 (H 5.95) với C-5 (C

157.6)/C-7 (C 157.9)/C-8 (C 96.5)/C-10 (C 100.1); giữa H-4 (H 2.76/2.88)

với C-2 (C 79.8)/C-3 (C 67.4)/C-9 (C 157.3)/C-10 (C 100.1) gợi ý vị trí của các nhóm hydroxyl tại C-3, C-5 và C-7. Vị trí của các nhóm hydroxyl tại C-

3, C-4 được xác định dựa trên tương tác HMBC giữa H-2(H 7.00) với C-1

(C 132.2)/C-3 (C 145.7)/C-4 (C 145.9)/C-6 (C 119.4) và độ chuyển dịch

hóa học của C-3(C 145.7) và C-4 (C 145.9). Tín hiệu proton tại vị trí H-2 dạng broad singlet khẳng định proton H-2 và H-3 cùng dạng β. Mặt khác, dữ liệu phổ của hợp chất CA6 hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu phổ của

epicatechin đã được công bố [24]. Dựa vào các bằng chứng phổ kết hợp với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất CA6 là epicatechin.

Hình 4.34. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA6

60

Hình 4.35. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA6

Hình 4.36. Phổ HSQC của hợp chất CA6

61

Hình 4.37. Phổ HMBC của hợp chất CA6

4.1.7. Hợp chất CA7: Epicatechin 3-O-gallate

Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của CA7

Hợp chất CA7 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA7 thấy xuất hiện tín hiệu proton thơm tại H 6.00 (2H, s), 6.73 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.84 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz), 6.97 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.98 (2H, s). Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu của hai

62

proton oxymethine tại H 5.05 (1H, br s) và 5.55*(1H), và một proton

methylene tại H 2.89 (1H, dd, J = 2.5, 17.0 Hz)/3.02 (1H, dd, J = 4.5, 17.0 Hz).

Phổ 13C-NMR của hợp chất CA7 thấy xuất hiện tín hiệu 22 carbon bao

gồm: một carbon carbonyl tại C 167.6; mười một carbon không liên kết với

hydro tại C 99.4, 121.5, 131.4, 139.7, 145.9×2, 146.2×2, 157.2, 157.8×2; chín

carbon methine tại C 70.0, 78.5, 95.9, 96.6, 110.2×2, 115.1, 116.0, 119.4; và

một carbon methylene tại C 26.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất CA7 giống với số liệu phổ của epicatechin 3-O-gallate [25] ở các vị trí tương ứng. Từ những phân tích trên, hợp chất CA7 được xác định là epicatechin 3-O-gallate.

Hình 4.39. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA7

63

Hình 4.40. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA7

4.1.8. Hợp chất CA8: Epigallocatechin 3-O-gallate

Hình 4.41. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của CA8

Hợp chất CA8 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của CA8 thấy xuất hiện các tín hiệu proton thơm tại H 6.03 (2H, s), 6.57 (2H, s) và 7.00 (2H, s). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của hai

64

oxymethine tại H 5.00 (1H, br s) và 5.56* (1H), và một proton methylene tại H 2.90 (1H, br d, J = 17.5 Hz)/3.01 (1H, dd, J = 4.5, 17.5 Hz). Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất CA8 xuất hiện tín hiệu của 22 carbon bao gồm: một

carbon carbonyl tại C 167.6; mười hai carbon không liên kết với hydro tại C 99.4, 121.3, 130.7, 133.6, 139.7, 146.1×2, 146.5×2, 157.0, 157.5×2; tám

carbon methine tại C 69.9, 78.4, 95.9, 96.6, 106.9×2 và 110.2×2; và một

carbon methylene tại C 26.6. Phân tích số liệu phổ NMR gợi ý hợp chất CA8 là flavan, tương tự hợp chất tham khảo epigallocatechin 3-O-gallate [26].

Trên phổ HMBC của hợp chất CA8 thấy xuất hiện tương tác giữa H-6

(H 6.03) với C-5 (C 157.5)/C-7 (C 157.5)/C-8 (C 96.6)/C-10 (C 99.4) gợi ý vị trí của các nhóm hydroxyl tại C-5 và C-7. Vị trí của các nhóm hydroxyl tại

C-3, C-4, C-5 được xác định dựa trên tương tác HMBC giữa H-2 (H 6.57)

với C-3 (C 146.5)/C-4 (C 133.6)/C-6 (C 106.9) và giữa H-6 (H 6.57) với

C-2 (C 106.9)/C-4 (C 133.6)/C-5 (C 146.5). Tương tác HMBC giữa H-

2(H 7.00) với C-1 (C 121.3)/C-3 (C 146.1)/C-4 (C 139.7)/C-6 (C

110.2)/C7″ (C 167.6); tương tác giữa H-3 (H 5.56) với C-7″ (C 167.6) gợi ý

vị trí của các nhóm hydroxyl tại C-3, C-4, C-5 và nhóm carbonyl tại C-

7″. Tín hiệu proton tại vị trí H-2 dạng broad singlet khẳng định proton H-2 và H-3 cùng dạng β. So sánh số liệu phổ của hợp chất CA8 với hợp chất tham khảo epigallocatechin 3-O-gallate thấy tương tự. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất CA8 được xác định là epigallocatechin 3-O-gallate.

Bảng 4.7. Số liệu NMR của CA8 và chất tham khảo

a,c (mult., J = Hz)

C 2 3 4 5 6 7 8 9

# δC 78.1 69.2 26.6 157.1 95.8 157.8 96.5 157.4

a,b δC 78.4 69.9 26.6 157.5 95.9 157.5 96.6 157.0

δH 5.00 (br s) 5.56* 2.90 (br d, 17.5) 3.01 (dd, 4.5, 17.5) - 6.03 (s) - 6.03 (s) -

65

ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu bị chập, #δC của epigallocatechin 3-O- gallate đo trong acetone-d6.

10 1′ 2′, 6′ 3′, 5′ 4′ 1″ 2″, 6″ 3″, 5″ 4″ 7″ 99.0 130.7 106.7 146.2 133.1 121.9 110.0 146.2 133.1 166.0 - - 6.57 (s) - - - 7.00 (s) - - - 99.4 130.7 106.9 146.5 133.6 121.3 110.2 146.1 139.7 167.6

Hình 4.42. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA8

66

Hình 4.43. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA8

Hình 4.44. Phổ HSQC của hợp chất CA8

67

Hình 4.45. Phổ HMBC của hợp chất CA8

4.1.9. Hợp chất CA9: Kaempferol -3-O-β-D-glucopyranoside

Hình 4.46. Cấu trúc hóa học của CA9

Hợp chất CA9 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA9 thấy xuất hiện các tín hiệu proton của vòng

thơm thuộc hệ tương tác spin-spin AA′BB′ tại H 6.88 (2H, d, J = 9.0 Hz) và 8.04 (2H, d, J = 9.0 Hz) cho thấy vòng B đối xứng có 1 nhóm thế ở vị trí C-4′.

Trên vòng A, các giá trị tại H 6.20 (1H, d, J = 1.5 Hz) và 6.43 (1H, d, J = 1.5

68

Hz) khẳng định ở vòng A bị thế 4 vị trí. Ngoài ra, trên phổ còn thấy xuất hiện một proton anome tại δH 5.45 (1H, d, J = 7.5 Hz) gợi ý sự có mặt của một đơn vị đường. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất CA9 xuất hiện tín hiệu của

21 carbon bao gồm: chín carbon không liên kết trực tiếp với hydro (C 103.9, 120.9, 133.2, 156.2, 156.4, 160.0, 161.2, 164.4 và 177.5), mười một carbon

methine (C 69.9, 74.2, 76.4, 77.5, 93.7, 98.8, 100.9, 115.1×2 và 130.9×2) và

một carbon methylene (C 60.9).

Số liệu phổ NMR của hợp chất CA9 giống với số liệu phổ của kaempferol -3-O-β-D-glucopyranoside [27] ở các vị trí tương ứng. Từ những phân tích trên cho phép kết luận hợp chất CA9 là kaempferol -3-O-β-D- glucopyranoside.

Hình 4.47. Phổ 1H-NMR của hợp chất CA9

69

Hình 4.48. Phổ 13C-NMR của hợp chất CA9

Hình 4.49. Phổ DEPT của hợp chất CA9

70

4.1.10. Danh sách các hợp chất phân lập từ loài trà Shan tuyết (C.

sinensis var. assamica)

Từ cặn chiết methanol của loài loài trà Shan tuyết (C. sinensis var.

assamica) đã phân lập và xác định được cấu trúc của chín hợp chất:

4.2. HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP

Các hợp chất phân lập từ loài trà Shan tuyết được sàng lọc đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase. Ở nồng độ 200 μM, các hợp chất CA6-CA9 cho thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase với phần trăm ức chế trên 50%. Vì vậy, các hợp chất này được đánh giá ở nồng độ 10, 25, 50, 100 và 200 µM để xác định giá trị IC50. Kết quả cho thấy: các hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ở các mức độ khác nhau. Cụ thể: hợp chất CA7 có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase tốt nhất với giá trị IC50 là 52.98 ± 0.87 µM, các hợp chất CA6, CA8, CA9 có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase yếu hơn với giá trị IC50 tương ứng là: 84.53 ± 0.79 µM, 61.05 ± 1.31 µM, và 123.03 ± 2.08 µM, đối chứng dương acarbose IC50 = 72,4 ± 0,8 µM.

71

Bảng 4.8. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các

hợp chất

Hợp chất IC50 (µM)

84.53 ± 0.79 CA6

52.98 ± 0.87 CA7

61.05 ± 1.31 CA8

123.03 ± 2.08 CA9

72,4 ± 0,8 Acarbose

72

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

1. Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc của chín hợp chất từ loài trà Shan tuyết (Camellia sinensis var. assamica). Trong đó:

(CA1) và

 Hai hợp chất mới: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-[6′′-O-(4′′′- 5,4′- 3-O-(6-O-(3′′′,4′′′-dimethylgalloyl))-β-D-

methoxy)galloyl]-β-D-glucopyranoside dihydroxydihydrostilbene glucopyranoside (CA2).

 Bảy hợp chất đã biết: 5,4′-dihydroxydihydrostilbene 3-O-β-D- (CA3), 3-methoxy-5-hydroxydihydrostilbene 4′-O-β-D- glucopyranoside glucopyranoside (sasastilboside A) (CA4), 3,5-dihydroxydihydrostilbene 4′- O-β-D-glucopyranoside (CA5), epicatechin (CA6), epicatechin-3-O-gallate (CA7), epigallocatechin 3-O-gallate (CA8) và kaempferol -3-O-β-D- glucopyranoside (CA9).

2. Đã tiến hành thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất phân lập được. Kết quả cho thấy: các hợp chất CA6-CA9 có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase, cụ thể: hợp chất CA7 có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase tốt nhất với giá trị IC50 là 52.98 ± 0.87 µM, các hợp chất CA6, CA8, CA9 có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase yếu hơn với giá trị IC50 tương ứng là: 84.53 ± 0.79 µM, 61.05 ± 1.31 µM, và 123.03 ± 2.08 µM.

5.2. KIẾN NGHỊ

Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài trà Shan tuyết (Camellia sinensis var. assamica), chúng tôi nhận thấy:

Hợp chất CA7 có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase tốt nhất. Vì vậy, cần thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế, tác dụng dược lý của hợp chất này.

73

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ninh L.N.H., 2017, Nghiên cứu phân loại chi Camellia L. thuộc họ Chè – Theaceae ở Việt Nam, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, Luận án tiến sĩ.

2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, T. Toàn, 2003, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I.

3. Chi V.V., 2012, Dictionary of Vietnamese medicinal plants, Publishing

House Medicine.

4. Nguyễn Cao Minh, 2010, Nghiên cứu chiết tách caffeine từ lá trà bằng

CO2 lỏng ở trạng thái siêu tới hạn.

5. Fumio Hashimoto, Gen-ichiro Nonaka and Itsuo Nishioka, 1989, Tannins and Related Compounds. LXXVII. Novel Chalcan-flavan Dimers, Assamica A, B and C, and a New Flavan-3-ol and Proanthocyanidins from the Fresh Leaves of Camellia senesis L. var. assamica KITAMURA, Chem. Pharm. Bull., 37(1), pp. 77-85.

6. Zhou Z.H., Zhang Y.J., Xu M., and Yang C.R., 2005, Puerins A and B, from Flavan-3-ols Substituted New 8-C

Two Pu-er Tea, J. Agric. Food Chem., 53, pp. 8614-8617.

7. Tao M.K., Xua M., Zhu H.T., Cheng R.R., Wang D., Yang C.R., and Zhang Y.J., 2014, New Phenylpropanoid-Substituted Flavan-3-ols from Pu-er Ripe Tea, Natural Product Communications, 9 (8), pp. 1167-1170.

8. Tian L.W., Tao M.K., Xu M., Hu J., Zhu H.T., Xiong W.Y., Zhang Y.J., 2014, Carboxymethyl and Carboxyl Catechins from Ripe Pu-er Tea, J. Agric. Food Chem., 62(50), pp. 12229–12234.

9. Wang W., Zhang L., Wang S., Shi S., Jiang Y., Li N., Tu P., 2014, 8-C N- ethyl-2-pyrrolidinone substituted flavan-3-ols as the marker compounds of post-fermentation Chinese formed dark teas the in

74

process provide significant antioxidative activity, Food Chemistry, 152, pp. 539–545.

10. Wang X., Liu Q., Zhu H., Wang H., Kang J., Shen Z., & Chen R., 2017, Flavanols from the Camellia sinensis var. assamica and their hypoglycemic and hypolipidemic activities, Acta Pharmaceutica Sinica B, 7(3), pp. 342–346.

tea and

11. Zhou H., Li H.M., Du Y.M., Yan R.A., Ou S.Y., Chen T.F., Fu L., 2017, C-geranylated flavanones from YingDe black their antioxidant and α -glucosidase inhibition activitie, Food Chemistry, 235, pp. 227–233.

12. Cheng J., Wu F.H., Wang P., Ke J.P., Wan X.C., Qiu M.H., & Bao G.H., 2018, Flavoalkaloids with a Pyrrolidinone Ring from Chinese Ancient Cultivated Tea Xi-Gui, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 66(30), pp. 7948–7957.

13. Murakami T., Nakamura J., Matsuda H., and Yoshikawa M., 1999, Bioactive saponins and glycoside. XV1). Saponin constituents with gastroprotective effect from the seeds of tea plant, Camellia sinensis L. var. assamica pierre, cultivated in Sri Lanka: Structures of Assamponins A, B, C, D, and E, Chem. Pharm. Bull., 47(12), pp. 1759-1764.

14. Murakami T., Nakamura J., Kaguera T., Matsuda H., and Yoshikawa M., 2000, Bioactive saponins and glycoside. XVII1). Inhibitory effect on gastric emptying and accelerating effect on gastrointestinal transit of tea saponins: Structures of Assamponins F, G, H, I, and J from the seeds and leaves on the plant tea, Chem. Pharm. Bull., 48(11), pp. 1720-1725.

15. Lu Y., Umeda T., Yagi A., Sakata K., Chaudhuri T., Ganguly D.K., & Sarma S., 2000, Triterpenoid saponins from the roots of tea plant (Camellia sinensis var. assamica), Phytochemistry, 53(8), pp. 941–946. 16. Ohta T., Nakamura S., Nakashima S., Matsumoto T., Ogawa K., Fujimoto K., Matsuda H., 2015, Acylated oleanane-type triterpene oligoglycosides from the flower buds of Camellia sinensis var. assamica, Tetrahedron, 71(5), pp. 846–851.

75

17. Liên T.T., 2014, Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của phụ phẩm chè trong quá trình chế biến chè khô của loài chè xanh (Camellia sinensis (L.) kuntze) ở Thái Nguyên, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

18. Huong N.T., Vien L.T., Hanh T.T.H., Dang N.H., Thanh N.V., Cuong N.X., Nam N.H., Truong L.H., Ban N.K., Kiem P.V., Minh C.V., 2017, Triterpene saponins and megastigmane glucosides from Camellia bugiamapensis, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 27, pp. 557- 561.

19. Nguyen H., Pham B., Cam I., Phuong D., Le T., Tran T., Pham L., 2019, Flavonoids isolated from the flowers of Camellia chrysantha, Vietnam Journal of Science and Technology, 57, pp. 287-293.

20. Shengi F.W., Wei C.X., Xue K.H., Ke Z.X., 2005, A new stilbene glycoside from Dryopteris sublaeta, Acta Pharmaceutica Sinica, 40, pp. 1131-1134.

21. Nhiem N.X., Tai B.H., Quang T.H., Van Kiem P., Van Minh C., Nam N.H., Kim J.H., Im L.R., Lee Y.M., Kim Y.H., 2011, A new ursane-type triterpenoid glycoside from Centella asiatica leaves modulates the production of nitric oxide and secretion of TNF-a in activated RAW 264.7 cells. Bioorg Med Chem Lett., 21(6), pp. 1777-1781.

22. Cuc N.T., Cuong N.T., Anh L.T., Yen D.T.H., Tai B.H., Thu Trang D., Yen P.H., Kiem P.V., Nam N.H., Minh C.V., Nhiem N.X., 2020, Dihydrostilbene glycosides from Camellia sasanqua and their α- inhibitory activities, Natural Product glucosidase and α-amylase Research, pp. 1-7.

23. Oode C., Shimada W., Izutsu Y., Yokota M., Iwadate T., & Nihei K., 2014, Synthesis of dihydroresveratrol glycosides and evaluation of their activity against melanogenesis in B16F0 melanoma cells, European Journal of Medicinal Chemistry, 87, pp. 862–867.

24. Nishino C., Enoki N., Tawata S., Mori A., Kobayashi K., and Fukushima M., 1987, Antibacterial Activity of Flavonoids against

76

Staphylococcus epidermidis, a Skin Bacterium, Agric. Biol. Chem., 51 (1), pp. 139-143.

25. Khallouki F., Haubner R., Hull W.E., Erben, G., Spiegelhalder B., Bartsch H., & Owen R.W., 2007, Isolation, purification and identification of ellagic acid derivatives, catechins, and procyanidins from the root bark of Anisophyllea dichostyla R. Br., Food and Chemical Toxicology, 45(3), pp. 472–485.

26. Davis A.L., Cai Y., Davies A.P., Lewis J.R., 1996, 1H- and 13C-NMR assignments of some green tea polyphenols, Magnetic Resonance in Chemistry, 34, pp. 887-890.

27. Jayasinghe U.L., Balasooriya B.A., Bandara A.G., Fujimoto Y., 2004, Glycosides from Grewia damine and Filicium decipiens, Natural Product Research, 18, pp. 499-502.