Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica)

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

99
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện nhằm mục tiêu góp phần chứng minh và làm sáng tỏ vai trò chủ đạo của các tác nhân có trong dịch lên men quả táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt là công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp trên đã kháng kháng sinh thông dụng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica)

LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Bùi Thị Việt Hà, chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên ĐH Quốc gia Hà Nội. Người đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ của bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên ĐH Quốc gia Hà Nội. Trong quá trình làm luận văn, tôi đã luôn nhận được sự chỉ bảo trực tiếp và được tạo điều kiện thuận lợi nhất. Đồng thời, tôi chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo tại khoa Sinh học nói chung và bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên ĐH Quốc gia Hà Nội nói riêng đã tận tình dạy dỗ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và toàn thể các bạn trong nhóm. Những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập. Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Minh Thư 1
MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƯỜI 3 1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN 5 1.2.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy 5 1.2.2 Vai trò của M.catarrhalis trong bệnh nhiễm khuẩn hô hấp 5 1.2.3 Tính kháng kháng sinh của M. catarrhalis 8 1.3 CHẤT KHÁNG SINH 10 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 11 1.3.3 Chất kháng khuẩn thực vật 14 1.3.4 Cơ chế kháng khuẩn 15 1.4 CÂY TÁO MÈO VÀ DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ TÁO MÈO 16 1.4.1 Đặc điểm thực vật học 16 1.4.2 Sự phân bố 17 1.4.3 Tác dụng dược lý 17 14.4 Thành phần hóa học 18 1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo 18 Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 NGUYÊN LIỆU 19 2.1.1 Nguồn giống 19 2.1.2 Hóa chất và thiết bị 19 2.2. PHƯƠNG PHÁP 19 2.2.1 Phương pháp lên men quả táo mèo 19 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 19 2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh và enzym 20 2.2.4 Bảo quản giống 21 2.2.5 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học-OD 21 2.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng 21 khuẩn của vi khuẩn 2.2.7 Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và giấm táo mèo 22 2.2.8 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn 25 kháng khuẩn Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN QUẢ TÁO 28 MÈO 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT 29
3.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis 29 3.2.2 Phân loại chủng vi khuẩn đã tuyển chọn 30 3.3. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƯỞNG VÀ HOẠT TÍNH 32 KHÁNG KHUẨN 3.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 32 3.3.2 Nguồn cacbon thích hợp 33 3.3.3 Nguồn nitơ thích hợp 34 3.3.4 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp 36 3.3.5 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 37 3.3.6 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 38 3.3.7 Khả năng sinh enzym ngoại bào của TM5.2 39 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ DỊCH 39 LÊN MEN VI KHUẨN 3.4.1 Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ 40 3.4.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn của dịch lên men vi khuẩn 40 3.4.3 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 41 3.4.4 Sắc ký bản mỏng các phân đoạn kháng khuẩn của dịch lên men chủng TM5.2 42 và dịch chiết táo mèo 3.5 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DỊCH LÊN MEN, DỊCH 42 CHIẾT TÁO MÈO VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN 3.5.1 Sơ bộ thành phần hóa học của cao dịch chiết táo mèo và các phân đoạn 42 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
BẢNG MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT CKS Chất kháng sinh CMC Carboxymethylcellulose DMSO Dimethyl sulfoxide HTKK Hoạt tính kháng khuẩn LB Môi trường Luria Bertani PĐ Phân đoạn TCA Tricloacetic VSV Vi sinh vật
DANH SÁCH BẢNG BIỂU, BIỂU ĐỒ Bảng 1.1: Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng mạn tính 7 Bảng 1.2: Tỷ lệ kháng kháng sinh của M.catarrhalis 9 Bảng 1.3:Tỷ lệ các loài có khả năng sinh CKS 10 Bảng 1.4: So sánh bacteriocin và chất kháng sinh 13 Bảng 2.1: Thông số thiết kế cột nhồi 23 Bảng 3.1: Hoạt tính kháng M.catarrhalis của dịch lên men quả táo mèo 28 Bảng 3.2: Hoạt tính kháng M.catarrhalis của 4 chủng vi khuẩn 29 Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn của chủng TM5.2 lên các chủng vi khuẩn kiểm 29 định Hình 3.1: Vị trí phân loại của chủng TM5.2 với các loài quan hệ họ hàng gần 32 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và hoạt 33 tính kháng khuẩn của chủng TM5.2 Hình 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của TM5.2 trên các môi trường 33
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính 34 kháng khuẩn của TM5.2 Hình 3.3: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính 34 kháng khuẩn của TM5.2 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng 35 khuẩn của TM5.2 Hình 3.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính 35 kháng khuẩn của TM5.2
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng, hoạt tính kháng khuẩn của 36 TM5.2 Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng và HTKK của TM5.2 36 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng 37 khuẩn của TM5.2 Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng 37 khuẩn của TM5.2 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và hoạt 38 tính kháng khuẩn của TM5.2 Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính 39 kháng khuẩn của TM5.2 Bảng 3.10: Khả năng sinh enzym ngoại bào 39 Bảng 3.11: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn tách từ dịch chiết lên 40 men Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của cao dịch chiết táo 41 mèo tại các nồng độ khác nhau Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn M.catarrhalis của các phân đoạn từ 42 dịch chiết táo mèo Bảng 3.14: Kết quả thử định tính các nhóm hợp chất của dịch chiết quả táo mèo 43 và các phân đoạn
MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số 10 bệnh lý nhiễm khuẩn ở các nước có thu nhập thấp. Chương trình toàn cầu về phòng chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đã được WHO phát động, tại Việt Nam chương trình này đã được triển khai từ năm 1984. Kiểm soát và phòng chống bệnh được ưu tiên hàng đầu tại các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, nhưng đã và đang chịu tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh. Bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới. T ỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp trên chiếm phần lớn so với các bệnh về hô hấp khác, là bệnh thường gặp, mắc hàng năm, theo mùa nhưng có thể gây nhiều biến chứng nặng như viêm tai giữa, viêm màng não, áp xe não, áp xe sau thành họng. Khi mắc viêm đường hô hấp trên có thể lây nhiễm xuống đường hô hấp dưới gây viêm khí, phế quản và viêm phổi nặng. Có thể thấy bệnh gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, người già và gây thiệt hại kinh tế. Moraxella catarrhalis là căn nguyên gây ra phần lớn các trường hợp mắc bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, đặc biệt hiện nay được coi như tác nhân gây bệnh viêm tai giữa phổ biến thứ ba sau Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae. Trong khi đó M. catarrhalis hiện đã kháng lại hầu hết các chất kháng sinh thuộc nhóm betalactam, chỉ còn nhạy cảm với cephalosporin thế hệ 2, 3 và ciprofloxacin thuộc họ quinolon. Thực trạng kháng kháng sinh của M. catarrhalis nói riêng, các vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung đã và đang đem đến gánh nặng kinh tế, xã hội trong việc thay thế kháng sinh thế hệ cũ bằng kháng sinh thế hệ mới đắt tiền. Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học hiện đại đem lại một triển vọng lớn cho nền Y học khi tìm kiếm thêm những hợp chất tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng và điều trị bệnh trên. Các hợp chất này góp 8
phần giảm tác dụng phụ không mong muốn của các hợp chất tổng hợp, giảm gánh nặng về mặt kinh tế cho người bệnh và xã hội. Từ ngàn xưa, ông cha ta đã lưu truyền rất nhiều bài thuốc dân gian từ cây, cỏ chữa các bệnh đường hô hấp và rất nhiều bệnh khác. Hiện nay táo mèo và các sản phẩm chế biến từ táo mèo đặc biệt là giấm táo mèo được lan truyền rộng rãi trong cộng đồng như một bài thuốc chống béo phì, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn, giảm chứng suy hô hấp....Trên thế giới cây táo mèo phân bố tại Trung Quốc, Ấn Độ, Myanma, tại Việt Nam tập trung ở các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu và Lâm Đồng. Năm 2010 đã có những nghiên cứu sơ bộ với kết quả khả quan về tác dụng kháng khuẩn, trong đó có M. catarrhalis gây bệnh hô hấp của dịch lên men quả táo mèo đã mở ra một hướng nghiên cứu mới cũng như định hướng ứng dụng của dịch lên men quả táo mèo trong việc hỗ trợ và nâng cao thể trạng cho con người. Với mục tiêu góp phần chứng minh và làm sáng tỏ vai trò chủ đạo của các tác nhân có trong dịch lên men quả táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt là công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đường hô hấp trên đã kháng kháng sinh thông dụng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica)”. 9
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƯỜI Nhiễm khuẩn hô hấp là tình trạng một hoặc một số bộ phận thuộc bộ máy hô hấp bị viêm nhiễm do vi khuẩn hoặc virut gây ra. Về phương diện lâm sàng, nhiễm khuẩn hô hấp gồm hai loại: nhiễm khuẩn hô hấp trên và nhiễm khuẩn hô hấp dưới. Nhiễm khuẩn hô hấp trên không phải là một bệnh lý riêng biệt mà gồm nhiều bệnh lý (các bệnh tai mũi họng) như: + Viêm mũi + Viêm họng + Viêm amidan + Viêm tai giữa + Viêm xoang. Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp dưới được coi là bệnh cảnh nặng nhưng trên thực tế bệnh chiếm tỷ lệ thấp và không dễ mắc. Trong khi đó nhiễm khuẩn hô hấp trên là chứng bệnh thường gặp hàng năm, mắc tái diễn theo mùa, tái mắc nhiều lần trong năm, dễ gây biến chứng nặng nề và chiếm tỷ lệ lớn so với các bệnh về hô hấp khác. Theo thống kê của các tổ chức y tế Hoa Kỳ, trung bình người trưởng thành có thể bị viêm đường hô hấp trên khoảng 2 – 4 lần mỗi năm và con số này cao hơn rất nhiều ở trẻ em, trong đó trẻ có thể nhiễm đến 10 lần. Mỗi năm tại Hoa Kỳ, nhiễm khuẩn hô hấp trên gây giảm khả năng làm việc trong 170 triệu ngày, 23 triệu ngày trẻ phải nghỉ học, 18 triệu ngày phải nghỉ làm. Điều này cho thấy dù là loại bệnh được cho là tự khỏi nhưng chúng đã gây ra những thiệt hại đáng kể không chỉ về sức khỏe mà còn cả về kinh tế xã hội. 10
Đối tượng mắc bệnh chủ yếu là trẻ em. Ước tính trên toàn cầu mỗi năm có khoảng trên 2 tỷ lượt trẻ bị bệnh nhiễm khuẩn hô hấp cấp, chiếm 15 20% số tử vong trong độ tuổi dưới 5. Tại khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam bệnh trên là nguyên nhân cao nhất (25%) gây tử vong ở trẻ, tiếp theo là tiêu chảy và sơ sinh kết hợp với các bệnh khác, còn lại là do các nguyên nhân khác [22]. Ở trẻ em bệnh nhiễm khuẩn hô hấp trên gây biến chứng nặng viêm tai giữa (29 – 50%), viêm xoang (5 – 10%) [38]. Vi sinh vật gây bệnh thường gặp là virut (chiếm 80%) và vi khuẩn (20%), cụ thể như sau: Tác nhân virut gây bệnh gồm có: +) Rhinovirus là một picornavirut, phân lập được hơn 110 serotyp thường gặp hơn cả (khoảng 50%). +) Coronavirus: 2025%. +) Orthomyxovirus: gây bệnh cúm +) Paramyxovirus : virut hợp bào, quai bị.. +) Adenovirus, thường là các typ 1, 2, 3, 5, 6. Tác nhân vi khuẩn thường gặp là Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae và Moraxella catarrhalis [24, 33,37]. Ngoài vi khuẩn trên còn có các vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila. Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp trên gia tăng khi gặp các yếu tố thuận lợi như: + Theo lứa tuổi: chủ yếu ở trẻ em và người già + Sức đề kháng yếu của con người: sinh non, suy dinh dưỡng,.... 11
+ Điều kiện khí hậu, thời tiết: ở Việt Nam có khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh đường hô hấp nói riêng và các bệnh nhiễm khuẩn nói chung phát triển. Việt Nam được coi là một trong các quốc gia có tỷ lệ các bệnh nhiễm khuẩn cao nhất nên việc điều trị và phòng bệnh càng trở nên cần thiết. + Do ô nhiễm môi trường sống, đời sống kinh tế xã hội kém. 1.2. Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP TRÊN 1.2.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy Moraxella catarrhalis lần đầu tiên được mô tả vào năm 1896, gọi là Micrococcus catarrhalis sau đó đổi thành Neisseria catarrhalis đến năm 1984 đổi là Moraxella (Branhamella) catarrhalis thuộc chi Moraxella, họ Moraxellaceae [27]. Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, dạng song cầu khuẩn, sống cộng sinh tại đường hô hấp trên, một số có pili hoặc lông nhung giúp cho chúng có thể bám vào ống hô hấp [38]. Không chỉ sống cộng sinh bình thường trong hệ hô hấp mà M. catarrhalis còn là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với đường hô hấp của con người [36]. Quá trình phân lập M. catarrhalis được tiến hành theo tiêu chuẩn WHO: Bệnh phẩm lấy từ vùng họng của bệnh nhân, tiến hành nhuộm Gram và cuối cùng đem nuôi cấy trong môi trường thạch máu 5% hoặc thạch sôcola với điều kiện 370C + CO2 5% [38]. 1.2.2 Vai trò của Moraxella catarrhalis trong bệnh nhiễm khuẩn hô hấp 12
Nhiều nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã chỉ ra rằng M. catarrhalis là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với đường hô hấp.  Các nghiên cứu trên thế giới: Trên thế giới có nhiều nghiên cứu chỉ ra M. catarrhalis là nguyên nhân phổ biến gây bệnh viêm đường hô hấp. M. catarrhalis là vi khuẩn cộng sinh phổ biến ở vòm họng của trẻ em [41], một nghiên cứu trên 120 trẻ sơ sinh đã cho thấy 66% trẻ một tuổi mang vi khuẩn, tăng lên đến 77,5% ở trẻ hai năm tuổi, điều này cho thấy trẻ em có nguy cơ cao bị các bệnh đường hô hấp, đặc biệt là hô hấp trên [20]. Những nghiên cứu khác cũng cho thấy 48,9% gặp ở trẻ độ tuổi từ 312 [32] và 54% ở trẻ dưới 4 tuổi [22]. Tuy nhiên ở người lớn tỷ lệ này thấp hơn với 1% trong 561 ca phụ nữ trong tuổi lao động nhập viện [32], 5,8% ở người lớn khỏe mạnh và tăng đến 26,5% ở người có độ tuổi trên 60 [48] và tăng cao vào mùa đông. Timothy [47] đã đưa ra các biểu hiện lâm sàng và dịch tễ học của M. catarrhalis, đặc biệt sự liên quan giữa bệnh viêm tai giữa ở trẻ em và bệnh COPD ở người lớn, hai căn bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất gây ra bởi M. catarrhalis. Viêm tai giữa là bệnh hay gặp nhất trong thời thơ ấu của con người và là lý do phổ biến nhất mà trẻ em được kê đơn kháng sinh, trung bình khoảng 80% trẻ em trong 3 năm đầu đời mắc bệnh. Trong đó M. catarrhalis chiếm 1520% nguyên nhân gây các đợt bệnh viêm tai giữa cấp tính, rất nguy hiểm với trẻ em nếu không phát hiện và điều trị kịp thời. M. catarrhalis còn là nguyên nhân gây ra một loạt các bệnh về hô hấp khác như: viêm xoang cấp, viêm vòm họng, viêm phế quản mãn tính. Catlin [26] đã chỉ ra những bằng chứng cho thấy M. catarrhalis đã gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm nội tâm mạc. Đặc biệt trong các báo cáo tổng hợp lại về các bệnh viêm phổi, viêm tai giữa và AIDS chỉ ra rằng M. catarrhalis là nguyên nhân thường gặp gây ra nhiễm trùng máu [44]. Nhiễm trùng bệnh viện là vấn đề đang rất được quan tâm 13
và M. catarrhalis được xác định là một trong những vi khuẩn bị lây truyền, nhất là ở những khu phòng quá tải bệnh nhân và trong những tháng mùa đông.  Các nghiên cứu tại Việt Nam Việt Nam với đặc điểm khí hậu nóng ẩm, trong những năm gần đây lại chịu tác động mạnh của biến đổi khí hậu đã tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển. Trên thế giới, Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ các bệnh nhiễm khuẩn cao nhất, trong đó nhiễm khuẩn đường hô hấp trên chiếm tỷ lệ cao. Ngay từ năm 1984 chương trình chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đã chính thức bắt đầu tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về bệnh hô hấp xác nhận M. catarrhalis là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu. Tại bệnh viện Bạch Mai vào năm 1987 [17] xác nhận tỷ lệ M. catarrhalis chiếm 3,5%, đến năm 1998 Lê Bá Nhàn và cộng sự khi nghiên cứu bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ở trẻ em tại phường Kim Long, thành phố Huế đã phân lập được M. catarrhalis với tỷ lệ 19,2%. Nghiên cứu của Đào Đình Đức và cộng sự [8] tại bệnh viện Bạch Mai trong 5 năm (19901994) cho thấy chủng vi khuẩn này gây nhiễm bệnh hô hấp với tỷ lệ trung bình là 2,2%. Tại trạm y tế phường Huế thành phố Hà Nội, năm 1991 đã phân lập được 36 chủng M. catarrhalis chiếm 18,8% tổng số vi khuẩn gây bệnh cho trẻ em, tại bệnh viện Việt Nam Cuba tỷ lệ lên đến 23,72% [34]. Khi nghiên cứu tác nhân vi sinh gây bệnh viêm phổi cộng đồng tại bệnh viện Chợ Rẫy từ ngày 01/03/2005 đến ngày 30/06/2006 đã cho thấy tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn Gram âm, trong đó tần suất gặp cao là Haemophilus influenzae (25%) sau đó là M. catarrhalis với 17%. Cũng với khảo sát tương tự diễn ra tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương trong khoảng thời gian từ tháng 1/2005 đến tháng 9/2006 do Phạm Hùng Vân phụ trách đã cho kết quả M. catarrhalis chiếm 8% trong tổng số vi sinh vật gây bệnh. Theo Đỗ Quyết [19] từ tháng 6/2007 đến tháng 6/2008 tại khoa lao và bệnh phổi, bệnh viện 103 Hà Nội trên 40 bệnh nhân trong đợt bùng phát bệnh phổi tắc nghẽn mãn 14
tính cho thấy M. catarrhalis chiếm 14,3% nguyên nhân gây bệnh. Cũng theo Nguyễn Minh Hải (2006) [10] tỷ lệ gây bệnh tương tự là 51,6%, theo Nguyễn Ngọc Bích (2007) chiếm 30,75% số vi khuẩn gây bệnh. Thống kê của viện dịch tễ trung ương và bệnh viện nhi Thụy Điển về tình hình nhiễm khuẩn đường hô hấp, M. catarrhalis chiếm tỷ lệ 18,829,6% trong tổng số các chủng phân lập được [2]. Phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh viêm họng mạn tính tại bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương cho bảng kết quả sau [13]: Bảng 1.1: Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh viêm họng mạn tính STT Tên vi khuẩn Số lượng Tỷ lệ (%) 1 M. catarrhalis 51 37,8 2 S.aureus 32 23,7 3 S.pyogenes 20 14,8 4 Klebsiella ssp. 18 13,3 5 P.aeruginosa 14 10,37 6 Tổng cộng 135 100 Những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy M. catarrhalis là một trong những tác nhân chủ yếu gây ra các bệnh hô hấp với tỷ lệ gây bệnh cao và mức độ nguy hiểm của chúng đối với sức khỏe con người, đặc biệt là với trẻ em, người già. Một vấn đề rất được quan tâm và chú trọng nghiên cứu hiện nay chính là tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh hô hấp, trong đó đặc biệt là của M. catarrhalis. 1.2.3 Tính kháng kháng sinh của Moraxella catarrhalis 15
Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới đắt tiền. Cùng với bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, bệnh lây nhiễm qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện, bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp là một trong những nguyên nhân hàng đầu có tỷ lệ mắc và tử vong cao ở các nước đang phát triển. Thực tế việc kiểm soát bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. M. catarrhalis là vi khuẩn Gram âm, có khả năng tổng hợp enzym β lactamaza. Enzym này làm mất hoạt tính kháng sinh của nhóm kháng sinh β lactam bằng cách thủy phân vòng β lactam. Trước đây khi điều trị các bệnh nhiễm khuẩn M. catarrhalis ampicillin vẫn được coi là kháng sinh đặc trị hữu hiệu. Tuy nhiên hiện nay kháng sinh điều trị theo kinh nghiệm này đã được ghi nhận là bị M. catarrhalis đề kháng với tỷ lệ cao lên đến 100% như ở Thái Lan [30], hay 79% như ở Malaysia [46]. Theo báo cáo gần đây cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc thế hệ kháng sinh quinolon mới có phổ kháng rộng của M. catarrhalis cao nhất là với ofloxacin (29,4%), tỷ lệ kháng thấp hơn với ciprofoxacin, levofloxacin, moxiloxacin. Tại Việt Nam, khi phân tích các chủng M. catarrhalis về tỷ lệ và xu hướng của kháng kháng sinh trong số tất cả các vi khuẩn gây bệnh phổ biến trong chương trình Quốc gia giám sát kháng kháng sinh, Phạm Văn Ca [4] cho thấy cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn này thấp vào trước năm 2000(dưới 2,5%), nhưng hiện đã cao hơn 13%. Tỷ lệ kháng kháng sinh ampicillin có xu hướng ngày càng tăng (16,1%). Các kháng sinh có tỷ lệ bị kháng cao nhất là tetracycline và cotrimoxazole với trên 30%. Khi khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh thông dụng thường được dùng trong cộng đồng, dạng uống, Phạm Hùng Vân cho 16
biết có 50% 60% vi khuẩn kháng ampicillin với cơ chế tiết βlactamaza ngày càng tăng và chỉ còn nhạy cảm với cephalosporin thế hệ II, III và ciprofloxacin thuộc họ quinolon. Theo nghiên cứu của Nguyễn Hồng Lâm (2008) – (Bảng 1.2) cho thấy M. catarrhalis đã kháng lại hoặc nhạy cảm thấp với hầu hết kháng sinh thuộc nhóm βlactam nhưng nhạy cảm rất cao với cefoperazol (Cephalosporin thế hệ III) với tỷ lệ 100%, cefotaxime (cephalosporin thế hệ III) đạt tỷ lệ 98,04%, ceftriaxone đạt tỷ lệ 96,08%, cefuroxime (cephalosporin thế hệ III) đạt tỷ lệ 78,43%. Bảng 1.2: Tỷ lệ kháng kháng sinh của M. catarrhalis Tên Ký hiệu Tỷ lệ phần trăm % Số STT kháng Trung Kháng chủng Nhạy (S) sinh gian (I) (R) Amoxicillin / 1 Ac 51 5,99 0 94,11 clavulanic axit 2 Cephalexine Cp 51 1,96 15,69 82,35 3 Cefaclor Cr 51 5,99 19,61 74,5 4 Cefuroxime Cu 51 78,43 21,56 0 5 Cefotaxime Ct 51 98,04 0 1,96 6 Ceftriaxone Cx 51 96,08 3,92 0 7 Cefoperazone Cf 51 100 0 0 8 Ciprofloxacine Ci 51 67,06 13,73 19,22 9 Ofloxacine Of 51 49,14 23,53 27,33 10 Pefloxacine Pef 51 13,7 25,5 60,8 11 Gentamycine Ge 51 11,8 15,7 72,5 17
12 Amikacine Ak 51 33,33 47,05 19,6 13 Doxycycline Do 51 41,2 27,5 31,4 14 Azythromycin Az 51 0 0 100 15 Erythromycin E 51 0 0 100 1.3 CHẤT KHÁNG SINH 1.3.1 Khái niệm Chất kháng sinh là những chất hữu cơ có nguồn gốc từ sinh vật (vi sinh vật, thực vật, động vật), có khả năng diệt hoặc kìm hãm sự phát triển các vi sinh vật khác, các chất kháng sinh thường có tác dụng mạnh ở nồng độ thấp và đặc hiệu lên các vi sinh vật khác nhau [49]. Bảng 1.3: Tỷ lệ các loài có khả năng sinh CKS [9] Sinh vật sinh CKS Số lượng loài Tỷ lệ (%) Vi khuẩn 950 9 Xạ khuẩn 4.600 43 Nấm 1.600 15 Tổng số VSV 7.150 67 Địa y 100 1 Tảo 250 2 Thực vật bậc cao 2.500 23 Động vật 700 7 Tổng số SV bậc cao 3.550 33 Tổng số 10.700 100 1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 18
1.3.2.1 Khái quát lịch sử nghiên cứu Từ rất xa xưa, với sự tìm tòi, khám phá và tích lũy kinh nghiệm thực tiễn, con người đã phát hiện, ứng dụng hiệu quả nhiều nguồn dược liệu vào mục đích điều trị y học. Và một kỷ nguyên mới trong y học đã được mở ra với phát minh vĩ đại của Alexander Fleming vào năm 1928 khi ông phát hiện ra penicillin – một chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm Penicillium notatum [7]. Năm 1942, quy trình sản xuất penicillin G procain được phát minh bởi Howard Florey (1898 1968) và Ernst Chain (19061979). Penicillin lúc này đã được bán như một loại thuốc. Fleming, Florey và Chain đã cùng được trao giải Nobel Y học vào năm 1945 cho thành tựu của mình. Nhà vi sinh vật học Mỹ, Selman Waksman (1888 1973) năm 1943 đã tìm ra chất kháng sinh streptomycin từ vi khuẩn đất, được sử dụng để điều trị các bệnh như lao, viêm màng não. Và đây là một trong những kháng sinh có phổ rộng có khả năng kháng được cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Những năm 19401959 được coi là thời kỳ hoàng kim của chất kháng sinh, hàng loạt chất được tách chiết và xác định: actonomixin (Waksman, 1940), chloramphenicol (Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948), tetracyclin (Lloyd Conover, 1955), nystatin (1957) dùng trong điều trị bệnh nhiễm nấm. Ngày nay, số lượng chất kháng sinh đã được phát hiện lên tới trên 10.000 chất, trong đó hàng trăm chất được dùng trong y học thực tiễn. Năm 1981, amoxicillin ra đời, là một kháng sinh bán tổng hợp và lần đầu tiên được bán vào năm 1998 dưới tên thương mại là amoxicillin, amoxil và trimox. Tại Việt Nam, vào những năm 19511952 giáo sư Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu sản xuất dịch lọc penicillin để rửa vết thương cho các thương binh [7]. Trường đại học Dược Hà Nội đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu, ứng dụng khoa học kỹ thuật để sản xuất các chất kháng sinh như: clotetracilin, 19
oxytetracilin, erythromixin, neomicin,…và cũng đã thu được những kinh nghiệm nhất định. 1.3.2.2 Phân loại Chất kháng sinh được phân loại theo nhiều cách khác nhau, tùy theo mục đích nghiên cứu và cách sử dụng chất kháng sinh. Dựa vào mức độ tác dụng: kháng sinh diệt khuẩn, kháng sinh ức chế kìm hãm vi khuẩn. Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh: chất kháng sinh phổ hẹp, chất kháng sinh phổ rộng. Dựa vào nguồn gốc: chất kháng sinh từ sinh vật: vi sinh vật, thực vật..., chất kháng sinh tổng hợp hay bán tổng hợp. Dựa vào cơ chế tác dụng Dựa vào cấu trúc phân tử và các nhóm chức đặc trưng: đây là nguyên lý cơ bản được sử dụng để phân loại chất kháng sinh vì chúng đóng vai trò quyết định hoạt tính kháng sinh.  Bacteriocin Hiện nay con người đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” bởi tình trạng kháng thuốc, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới [35]. Trong bối cảnh này song song với việc phát triển các chất kháng sinh phổ rộng thì việc nghiên cứu bacteriocin là vấn đề rất đáng được quan tâm. Bacteriocin là peptit hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính kháng khuẩn [29], thuật ngữ này được đề xuất từ năm 1953 [28]. Tiếp tố “in” hoặc “cin” dùng để biểu thị các peptit có hoạt tính kháng khuẩn tiết ra từ vi khuẩn. Tiếp tố này được viết thêm vào tên chi hoặc tên loài. Ví dụ, bacteriocin tiết ra từ 20