Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:98

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng được quy trình sàng lọc và sàng lọc được phân tử aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THANH THỦY NGHIÊN CỨU TẠO APTAMER ĐẶC HIỆU VI KHUẨN Escherichia coli O157:H7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THANH THỦY NGHIÊN CỨU TẠO APTAMER ĐẶC HIỆU VI KHUẨN Escherichia coli O157:H7 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÃ THỊ HUYỀN GS.TS PHẠM VĂN TY Hà Nội – 2013 ii
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của Phòng Công nghệ Tế bào động vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Bộ môn Vi sinh vật học - Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. Trƣớc hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS. Phạm Văn Ty, TS. Lã Thị Huyền đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn, Trƣởng phòng Phòng Công nghệ Tế bào động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị Thu Thủy và ThS. Lê Thị Kim Xuân và các cán bộ tại phòng Công nghệ Tế bào động vật đã giúp đỡ rất nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình tôi học tập tại đây. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giảng dạy tại Khoa Sinh học - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã dạy bảo tôi trong suốt quá trình học tập, trang bị cho tôi nền tảng kiến thức khoa học, phƣơng pháp học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và bạn bè luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Nguyễn Thanh Thuỷ iii
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................ivi DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................... viiii DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................... viii MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 3 1.1. Escherichia coli O157:H7 ...................................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7 .............................................. 3 1.1.2. Đặc tính của E. coli O157:H7 .......................................................... 5 1.1.3. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7 ................. 6 1.1.4. Bệnh do E. coli O157:H7 gây ra ..................................................... 10 1.1.5. Tình hình nghiên cứu E. coli O157:H7 trong và ngoài nƣớc ........ 13 1.2. Aptamer ...............................................................................................14 1.2.1. Giới thiệu chung về aptamer ......................................................14 1.2.2. Ƣu điểm của aptamer so với kháng thể .......................................16 1.2.3. Phƣơng pháp làm giàu phát triển hệ thống phối tử cấp số mũ (SELEX) sàng lọc aptamer ............................................................................. 17 1.2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng aptamer ........................................ 20 1.2.5. Hạt nano vàng .............................................................................22 1.2.6. Chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ....................... 24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 26 2.1. Vật liệu .................................................................................................26 2.1.1. Chủng vi vật và plasmid .................................................................. 26 2.1.2. Hoá chất......................................................................................26 2.1.3. Thiết bị, máy móc .......................................................................26 2.1.4. Môi trƣờng và dung dịch ................................................................. 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................27 2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 27 2.2.2. Phƣơng pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E. coli 0157:H7... .... 28 iv
2.2.3. Phƣơng pháp PCR.......................................................................31 2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ........................................... 35 2.2.5. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose ............................................. 35 2.2.6. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng ................................... 37 2.2.7. Phƣơng pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli ......................... 38 2.2.8. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli ..................... 40 2.2.9. Phƣơng pháp giải trình tự acid nucleic tự động ............................. 42 2.2.10. Phƣơng pháp tạo phức hệ aptamer – hạt nano vàng .................... 44 2.2.11. Phƣơng pháp lai Dot blot ............................................................... 44 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ............................................... .46 3.1. Kết quả sàng lọc aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 ..............46 3.1.1.Chuẩn bị thƣ viện. ........................................................................36 3.1.2. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7 ............................. 50 3.2. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7 ..............52 3.2.1. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7...........................................................................................................…….53 3.2.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 – TOPO........54 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α.......56 3.2.4. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli.......................................57 3.3. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7..............58 3.3.1. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7....58 3.3.2. Kết quả xác định sự liên kết của phức hợp aptamer - hạt nano vàng với E. coli O157:H7.........................................................................................60 3.4. Xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli O157:H7............61 3.4.1. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli.......................................61 3.4.2. Kết quả xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli O157:H7...................................................................................................................62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................78 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................... ......................79 v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair Cặp base Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm soát và phòng CDC Prevention ngừa bệnh dịch Hoa Kỳ DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme DNase EDTA Ethyenediaminetetraacetic acid Axit ethyenediaminetetraacetic E. coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli E. coli Vi khuẩn Escherichia coli Escherichia coli O157:H7 O157:H7 O157:H7 H Hour Giờ HUS Hemolytic uremic syndrome Hội chứng huyết niệu HC Hemorrhagic colitis Viêm kết tràng xuất huyết Kb Kilo base Kb LB Luria Bertani Môi trƣờng LB PCR Polymerase chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Reverse transcriptase Polymerase Phản ứng chuỗi trùng hợp thời RT – PCR chain reaction gian thực RNase Ribonuclease Enzyme Rnase RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic TEM Transmission electron microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua STEC Shiga toxigenic E. coli Escherichia coli sinh độc tố Shiga ssDNA Single strand DNA Sợi đơn DNA dsDNA Double strand DNA Sợi đôi DNA SDS Sodium dodecyl sulphate Natri dodexyl sulphat TAE Tris – acetate – EDTA Tris – acetate – EDTA Taq Polymerase Thermus aquaticus Enzyme polymerase chịu nhiệt polymerase vi
5 – Bromo – Clorua 3 – indodyl – 5 – Bromo – Clorua 3 – indodyl – X – gal β – D – galactoside β – D – galactoside v/ph Round/minute Vòng/phút vii
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 ..................................... 3 Hình 1.2. Cấu trúc của hệ gen vi khuẩn E. coli O157:H7 ............................. 4 Hình 1.3. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trƣờng Endo agar và trên môi trƣờng Fluorocult....................................................................................................................5 Hình 1.4. Cấu trúc của Shiga – like – toxin và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli O157:H7.................................................................................................... 10 Hình 1.5. Hình ảnh cấu trúc của aptamer khi liên kết với protein và neomycin...................................................................................................................15 Hình 1.6. Quy trình phƣơng pháp làm giàu phát triển hệ thống phối tử cấp số mũ (SELEX) ........................................................................................................ 18 Hình 1.7. Sơ đồ aptamer ssDNA ................................................................ 18 Hình 1.8. Cấu tạo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).............................25 Hình 2.1. Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR ..................................... 33 Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ của PCR.........................................................................................................33 Hình 2.3. PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân. ........................ 34 Hình 2.4. Sơ đồ cấu tạo vector tách dòng PCR2.1 – TOPO (Invitrogen) ... 37 Hình 2.5. Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp của F.Sanger. ............ 43 Hình 3.1. Kết quả PCR làm giàu thƣ viện. ................................................. 46 Hình 3.2. Quá trình tạo sợi đơn DNA sử dụng enzym lamda exonuclease.. 48 Hình 3.3. Kết quả tạo ssDNA từ sản phẩm PCR sử dụng enzyme lamda exonuclease............................................................................................................. 48 Hình 3.4. Kết quả PCR sản phẩm sau cắt tạo sợi đơn ................................. 49 Hình 3.5. Kết quả PCR làm giàu sau mỗi vòng sàng lọc với cặp mồi ApF2/ApR2............................................................................................................ 50 Hình 3.6. Quá trình tách dòng sản phẩm sau sàng lọc...................................52 Hình 3.7. Quy trình tách dòng và giải trình tự aptamer ssDNA nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. ...................................................................... 53 viii
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR ................................................... 54 Hình 3.9. Cơ chế hoạt động của TA Cloning kit......................................... 55 Hình 3.10. Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) vào tế bào E. coli DH5α………………….…………………………………………...….. 56 Hình 3.11. Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi ApF2/ApR2 .... 57 Hình 3.12. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang apamer liên kết E. coli O157:H7.. ................................................................................................ 58 Hình 3.13. Kết quả Dot blot giữa phức hợp aptamer 8 - nano vàng với kháng nguyên đích E. coli O157:H7. .................................................................... 59 Hình 3.14. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) phức hệ aptamer-hạt vàng .................................................................................................. 61 Hình 3.15. Kết quả tra sản phẩm tách dòng của aptamer ssDNA 8 ........... 62 Hình 3.16. Trình tự aptamer ssDNA 8. ...................................................... 63 Hình 3.17. Mô hình cấu trúc bậc 2 của aptamer ssDNA 8 đƣợc dự đoán bằng công cụ Mfold........................................................................................................... 64 Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự của aptamer ssDNA 8 với các trình tự aptamer trong ngân hàng gen bằng công cụ FASTA................................................ 64 ix
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7............................ 4 Bảng 1.2. So sánh ƣu điểm của aptamer và kháng thể ................................ 17 Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợpPCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện......................................................................................................................29 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện........... ............................................................................................................ 29 Bảng 2.3. Thành phần hỗn hợp phản ứng tạo ssDNA ................................. 30 Bảng 2.4. Thành phần hỗn hợp PCR khuếch đại các trình tự gen ............... 34 Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện..... ................................................................................................................. 34 Bảng 3.1. Tóm tắt điều kiện nghiêm ngặt tăng dần cho mỗi vòng sàng lọc..............................................................................................................................51 x
MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là vấn đề rất đƣợc quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là vi sinh vật, thƣờng gặp nhƣ Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp., Campylobacter jejuni…. Trong đó, vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm và thƣờng gặp nhất là E. coli O157:H7. Theo báo cáo số 18 năm 2011 trong chuỗi báo cáo đánh giá nguy cơ nhiễm vi sinh vật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lƣơng thế giới (FAO) đã thống kê tỉ lệ ngƣời nhiễm E. coli O157:H7/100.000 dân: Tại Liên minh Châu Âu 1,3 ngƣời; tại Mỹ 1,9 ngƣời; tại Newzeland và Australia 2 ngƣời; tại Argentina 22 ngƣời... E. coli O157:H7 thuộc loài E. coli gây xuất huyết ruột (EHEC - Enterohaemorrhagic E. coli), sinh độc tố Shiga. E. coli O157:H7 là đối tƣợng gây ngộ độc thực phẩm cực kỳ nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu. Chúng gây tiêu chảy phân máu, viêm đại tràng xuất huyết. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể dẫn tới thủng ruột. Độc tố Shiga còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu, suy thận (HUS - haemorrhagic uremic syndrome) dẫn tới tử vong. E. coli O157:H7 là tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhƣng dễ dàng bị lây nhiễm ở nhiều thực phẩm thiết yếu nhƣ nƣớc, rau, thịt sống, thịt chƣa nấu kỹ…Mối nguy E. coli O157:H7 rất lớn do chủng này có liều gây độc thấp (10 – 100 tế bào), gây dịch tiêu chảy, tốc độ lây lan nhanh, sinh độc tố Shiga, tỷ lệ gây tan huyết và suy thận cao, dẫn tới tử vong. Hàng năm, khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ngƣời lớn nhiễm E. coli O157:H7 và dẫn tới hội chứng tán huyết, suy thận, trong đó 50% số bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong. Kể từ khi đƣợc xác định năm 1982 tại Hoa Kỳ, E. coli O157:H7 đã trở thành mầm bệnh quan trọng nhất trong nhóm các bệnh lây lan qua thực phẩm tại Hoa Kỳ cũng nhƣ các nƣớc đã phát triển ở Châu Âu và Nhật Bản. Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An toàn thực phẩm – Bộ Y tế: Năm 2013 có 5.200 trƣờng hợp bị ngộ độc. Trong đó, E. coli là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nên rất đƣợc quan tâm nghiên cứu. Tuy đã có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli nói chung nhƣng 1
về E. coli O157:H7 nói riêng chỉ có một số nghiên cứu nhỏ, phân tán, chƣa thỏa đáng với mức độ nguy hiểm của nó. Để xác định nhanh E. coli O157:H7 còn gặp nhiều khó khăn, mất nhiều thời gian, đòi hỏi các trang thiết bị, máy móc hiện đại, phân tích viên có trình độ chuyên môn cao. Do đó, việc phân tích chính xác E. coli O157:H7 ở nƣớc ta còn hạn chế. Aptamer (thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Latin aptus – phù hợp, tiếng Hy Lạp meros – phần) đƣợc phát hiện từ năm 1990 bởi 2 phòng thí nghiệm độc lập của Ellington và Szostak; Tuerk và Gold). Aptamer có bản chất là acid oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng liên kết chặt chẽ với một phân tử đích cụ thể nhờ sự tƣơng tác cấu trúc trong không gian 3 chiều. Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ ion, phân tử, đại phân tử tới tế bào. Aptamer đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, nghiên cứu y dƣợc, điều trị ung thƣ, tạo thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, nghiên cứu dịch tễ học… Trong một số trƣờng hợp với vai trò nhƣ đầu dò nhận biết phân tử, aptamer có ái lực liên kết thậm chí vƣợt qua các kháng thể đơn dòng. Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc, xác định E. coli O157:H7 một cách nhanh chóng, hạ giá thành nên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo aptamer đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7”. Mục tiêu của đề tài nhằm xây dựng đƣợc quy trình sàng lọc và sàng lọc đƣợc phân tử aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng thƣ viện ssDNA và sàng lọc các aptamer liên kết với vi khuẩn E. coli O157:H7. - Tách dòng và xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Escherichia coli O157:H7 1.1.1. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7 Escherichia coli O157:H7 thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia [5]. Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động (hình 1.1). Kích thƣớc: dài từ 2 - 4 µm, rộng 0.8 - 1µm, có nhiều lông toàn thân và có roi dài khoảng 20 nm. E. coli O157:H7 là sinh vật nhân sơ, DNA có cấu trúc siêu xoắn nằm giữa tế bào, không có màng nhân bao bọc. E. coli O157:H7 có cấu tạo đơn giản bao gồm: Lớp ngoài là thành tế bào,có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS). Lớp trong là màng sinh chất (gồm 1 lớp lipid nằm giữa 2 lớp phospho) bao quanh tế bào chất. Tế bào chất là phần vật chất dạng keo chứa protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lƣợng phân tử thấp [7,8]. Hình 1.1: Cấu tạo tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen nhân dài sấp xỉ 5,5 triệu bp, gồm khoảng 5483 gen và 2 plasmid có chiều dài lần lƣợt là 93 kb và 3,3 kb (hình 1.2 và bảng 1.1). Trong hệ gen nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi khuẩn này là stx1 và stx2 [5,25]. Ở E. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H, trong đó O là kháng nguyên bề mặt, còn H là kháng nguyên lông roi [5,6]. 3
Bảng 1.1: Thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 Hệ gen pO157 pOSAK1 Độ dài 5,498,450 bp 92,721 bp 3,306 bp Tỉ lệ G+C 50.5 % 47.6 % 43.4 % Khung đọc mở (ORF): 5,361 83 3 Vùng mã hóa protein 88.1 % 82.5 % 52.8 % Chiều dài trung bình của các ORF 904 bp 922 bp 579 bp rRNA (16S-23S-5S) 7 0 0 tRNA và tmRNA 103 0 0 Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7 4
1.1.2. Đặc tính của E. coli O157:H7 E. coli O157:H7 là vi sinh vật hiếu kị khí tùy tiện, có khả năng hô hấp và lên men để trao đổi chất. Chúng không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Vi khuẩn này có thể sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 80C đến 460C, nhiệt độ tối ƣu là 370C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 700C. E. coli O157:H7 sinh truởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4 đến 9,0; thậm chí ở 370C trong 2 - 7h, nó vẫn có thể tồn tại đƣợc ở pH = 2,5 [43]; pH tối ƣu khoảng 6 - 7. Vi khuẩn này bị ức chế ở môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ trên 2,5%. E. coli O157:H7 sống kí sinh trong hệ tiêu hóa của ngƣời và động vật. Tuy nhiên khi bị phóng thích ra ngoài môi trƣờng chúng vẫn tiếp tục tồn tại 2 - 3 ngày ở 250C, 10 - 31 ngày ở 80C. Điều này càng làm cho chúng có khả năng lan rộng và xâm nhiễm vào các tế bào vật chủ mới [14]. E. coli O157:H7 có khả năng lên men đƣờng lactose. Trên môi trƣờng Endo agar khuẩn lạc E. coli O157:H7 tròn, lồi, có ánh kim (hình 1.3). Hình 1.3: Hình ảnh khuẩn lạc của E. coli O157:H7 trên môi trƣờng Endo agar và trên môi trƣờng Fluorocult® E. coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobise. Vi khuẩn này không tạo ra  -D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4- methylumbelliferyl--D-glucuronid (MUG) thành 4-methylumbelliferonenên khi chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng Fluorocult® có bổ sung sorbitol và 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG), do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt 5
phân biệt với các E. coli khác có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này [26]. E. coli O157:H7 là loại vi khuẩn có khả năng sinh độc tố. Chúng có khả năng sinh độc tố Shiga hay còn gọi độc tố Vero. Loại độc tố này không gây hại đối với động vật nhƣng lại gây nguy hiểm cho ngƣời nhƣ gây tán huyết, suy thận, thậm chí tử vong [38]. E. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H. Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O: - Bền nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2h. - Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. - Bị hủy bởi formol 5%. - Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24h. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ [7]. Kháng nguyên lông roi H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H [7,20]. 1.1.3. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7 E. coli O157:H7 là vi khuẩn sinh độc tố. Trong hệ gen nhân của vi khuẩn này chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của chúng là stx1 và stx2. Trong đó, stx viết tắt của Shiga – like – toxin [8]. Stx là một ngoại độc tố không bền nhiệt, tác động lên cả ruột và hệ thần kinh trung ƣơng của ngƣời. Ở ruột, E. coli O157:H7 gây tiêu chảy, xuất huyết, đồng thời ức chế hấp thu đƣờng và các acid amin ở ruột non. Theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dƣợc Tp. Hồ Chí 6
Minh, năm 1996: Độc tố theo đƣờng máu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến hệ thần kinh, có thể dẫn đến mê sảng, biến chứng thần kinh trầm trọng: co giật, tê liệt. Stx1 và Stx2 đều có tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tiểu đơn vị B gắn với thụ thể đặc hiệu là một glycolipid kí hiệu Gb3 (thụ thể đặc hiệu của Stx2 là Gb4). Các Gb3 thƣờng thấy ở các tế bào biểu mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào biểu mô mạch [8]. Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một ngoại độc tố, các gen mã hóa nằm trên chromosome. stx1 có tính bảo tồn cao trong khi stx2 rất hay thay đổi về trình tự [19,25]. Tất cả các loại Stx đều có chung một cấu trúc AB5, trong đó một tiểu đơn vị A kết hợp với năm tiểu đơn vị B. Tiểu đơn vị A có hoạt tính N – Glycosidase xúc tác cắt một gốc adenin từ 28S rRNA của tiểu đơn vị ribisome 60S trong các tế bào bị độc tố tác động. Đây là một yếu tố quan trọng trong việc dừng tổng hợp protein trong tế bào đích. Do không tổng hợp đƣợc protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela... hay bất cứ tế bào nào có thụ thể là Gb3, Gb4) sẽ chết. Tiểu đơn vị A gồm hai phần peptit A1 (27,5 kDa) và A2 (4,5 kDa) liên kết với nhau qua liên kết disulfua. Peptit A1 có hoạt tính enzyme và peptit A2 có chức năng gắn tiểu đơn vị A vào 5 tiểu đơn vị B [33]. Năm tiểu phần B của các Stx chứa các vị trí liên kết với glycolipid đặc hiệu trên bề mặt tế bào đích [42]. Cấu trúc phân tử của pentamer Stx1 – B lần đầu tiên đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chụp ảnh X-ray. Qua đó cho thấy một cấu trúc gồm năm tiểu đơn vị trong cách sắp xếp pentameric – tƣơng tự nhƣ cách sắp xếp của các tiểu đơn vị B của enterotoxin không bền nhiệt. Trong một enterotoxin không bền nhiệt, năm tiểu đơn vị bao quanh một ống mà qua đó các dƣ lƣợng cacbon của tiểu đơn vị A có thể đi qua. Khi cấu trúc của Stx hoàn thiện, đầu cuối đuôi cacboxyl của tiểu đơn vị A sẽ đƣợc bao quanh bởi năm tiểu đơn vị B. Trong khi đó, phần còn lại của tiểu đơn vị A nằm tên một mặt của pentamer tiểu đơn vị B. 7
 Cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7: Cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7 là một quá trình gồm nhiều bƣớc (hình 1.4), liên quan đến sự tƣơng tác phức tạp giữa số lƣợng vi khuẩn, khả năng bám vào tế bào, khả năng sinh độc tố của vi khuẩn... và các yếu tố của vật chủ [20]. - E. coli O157:H7 xâm nhập qua đƣờng miệng (chỉ cần liều rất thấp), vi khuẩn phải sống sót trong điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt của dạ dày và phải cạnh tranh với các vi khuẩn khác ở đƣờng ruột để thiết lập sự định cƣ. - Định cƣ vào ống tiêu hoá: E. coli O157:H7 có khả năng bám vào tế bào biểu mô ruột và định cƣ trong ống tiêu hoá ngƣời là một trong những yếu tố quyết định độc lực. Ngƣời ta ƣớc tính liều gây nhiễm của E. coli O157:H7 khoảng 1–100 CFU (colony forming unit) [54]. - Sức đề kháng acid của E. coli O157:H7: Nét đặc trƣng của E. coli O157:H7 là khả năng định cƣ ở ống tiêu hóa ngƣời với số lƣợng cảm nhiễm thấp. E. coli O157:H7 đề kháng đƣợc pH acid của dạ dày. Do đó, chúng vẫn còn sống sót trong các thực phẩm pH thấp [43]. Tính trạng này đƣợc điều hòa bởi gen rpoS [71]. Gen này có khả năng giúp vi khuẩn E. coli O157:H7 kéo dài thời gian sống sót ở pH dƣới 2,5 [54]. Gần đây, đã có nghiên cứu báo cáo tình trạng đột biến của gen này [71]. - Kiểu bám vào tế bào biểu mô ruột: E. coli O157:H7 phải thiết lập sự định cƣ này bằng cách bám vào các tế bào biểu mô ruột. Ngƣời ta đã chứng minh rằng yếu tố bám dính của E. coli O157:H7 đóng vai trò quan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột. Đó là intimin, một protein màng ngoài có trọng lƣợng phân tử 94-97 kDa. Intimin đƣợc mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching and effacing). Intimin bám dính vào tế bào và gây tổn thƣơng, phá hủy, gọi là bệnh tích A/E (attaching and effacing)[20]. Ở E. coli O157:H7 thƣờng gặp dạng -intimin. Có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae và khả năng gây bệnh trầm trọng của E. coli O157:H7 trên ngƣời, nhƣ gây hội chứng HC và HUS. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ của các dòng mang gen eae ở bệnh phẩm ngƣời cao hơn hẳn ở bệnh phẩm của gia súc. Ngoài ra còn có các yếu tố liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác gây bệnh đƣờng 8
ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) và LPS (lipopolysaccharide). - Vai trò của plasmid 60 MDa (pO157) trong sự bám dính của E. coli O157:H7: Vi khuẩn này chứa pO157. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của plasmid liên quan đến yếu tố bám (fimbriae) và sự bám dính với tế bào Henle 407 nhƣng không bám vào tế bào HEp-2. Các kết quả nghiên cứu khẳng định rằng có hiện diện plasmid hay không đều không ảnh hƣởng đến khả năng định cƣ ở kết tràng của STEC và khả năng gây bệnh tích A/E làm tăng tiết nƣớc vào lòng ruột dẫn tới tiêu chảy phân nƣớc [68]. Vi khuẩn E. coli O157:H7 sống sót trong đƣờng ruột, nhân lên và sản sinh Stx. Stx đƣợc hấp thu qua tế bào biểu mô ruột, dẫn truyền vào dòng máu. Điều này cho phép Stx di chuyển đến bề mặt tế bào đích gồm cả tế bào ruột lẫn các nội quan khác mà có thụ thể của chúng [54].  Cơ chế gây bệnh củaStx : Để gây bệnh, trƣớc tiên Stx phải đƣợc tiếp nhận bởi các thụ thể đặc hiệu. Các nghiên cứu cho thấy Stx có tính gây độc trực tiếp lên tế bào ruột do chúng nhắm đến thụ thể Gb3 (globotriaosylceramide), dạng thụ thể glycolipid, trên nhung mao của tế bào biểu mô ruột ở ngƣời (Stx2 có thụ thể là Gb 4). Gb3 hoặc Gb4 còn tìm thấy ở tế bào nội mô thận, tế bào Vero, tế bào Hela... [44]. Sau khi làm tổn thƣơng các tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mô, xâm nhập vào dòng máu và tiến đến các mô đích khác nhau có chứa thụ thể glycolipid, gây tổn thƣơng tế bào nội mạch, tế bào thận (hình 1.4)… Cụ thể là những tiểu đơn vị B sẽ giúp độc tố kết hợp với các thụ thể đặc hiệu này. Sau khi đƣợc chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome, cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Vì không tổng hợp đƣợc protein, những tế bào bị Stx tác động sẽ chết [33]. Hậu quả là gây tiêu chảy, viêm kết tràng xuất huyết và hội chứng huyết niệu. 9
Hình 1.4: Cấu trúc của Shiga – like –toxin và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7 Ảnh hƣởng của các loại Stx trong sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ đã chỉ ra rằng những dòng STEC chỉ sản sinh Stx2 thì gây bệnh trầm trọng hơn so với những dòng STEC chỉ sản sinh Stx1, bệnh càng nặng hơn nếu dòng STEC sản sinh cả Stx1 lẫn Stx2, chẳng hạn nhƣ có thể dẫn tới hội chứng HUS [54]. 1.1.4. Bệnh do E. coli O157: H7 gây ra E. coli O157:H7 là nguyên nhân gây nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng. Chúng chính thức đƣợc xác định lần đầu tiên năm 1982 tại Michigan, Hoa Kỳ [72]. Từ đó 10