Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:173

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là biểu hiện được NK1R tái tổ hợp của người trên dòng tế bào tự nhiên vốn không biểu hiện thụ thể này nhằm sàng lọc hoạt chất và dịch chiết dược liệu hướng đích NK1R. Qua đó, tạo cơ sở xây dựng mô hình biểu hiện cho các GPCR tái tổ hợp khác phục vụ cho các nghiên cứu và phát triển dược phẩm ở Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------- Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------- Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 9420101.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Đinh Đoàn Long 2. PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN Chủ tịch hội đồng đánh giá Thay mặt tập thể cán bộ hướng dẫn Luận án Tiến sĩ PGS.TS. Trịnh Hồng Thái PGS.TS. Đinh Đoàn Long Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đinh Đoàn Long và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí Khoa học - Công nghệ và các báo cáo hội nghị khoa học, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 08 năm 2020 TÁC GIẢ Phạm Thị Hồng Nhung
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này, tôi nhận được rất nhiều sự ủng hộ, giúp đỡ quí báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, cùng bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Đoàn Long và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện luận án. Nghiên cứu này nhận được sự hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu sản xuất một số thụ thể ứng dụng trong sàng lọc và phát triển thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam”, mã số ĐT-PTNTĐ2011-G/04 do PGS.TS. Đinh Đoàn Long chủ trì. Nếu không có sự hỗ trợ tài chính từ đề tài và sự hỗ trợ chuyên môn từ các nhóm nghiên cứu, tôi khó có thể hoàn thành các nội dung nghiên cứu của luận án. Tôi cũng xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các nhóm nghiên cứu do PGS.TS. Võ Thị Thương Lan, PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, TS. Trịnh Tất Cường, PGS.TS. Nguyễn Lai Thành, ThS. Bùi Thị Vân Khánh phụ trách. Các thầy cô và các bạn trong các nhóm nghiên cứu này đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu của mình. Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn ủng hộ và nhiệt tình giúp đỡ cho tôi có điều kiện tốt nhất khi tiến hành các thí nghiệm tại đây. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Bộ môn Di truyền học - Khoa Sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án; đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong các buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án. Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu, tôi cũng luôn nhận được sự ủng hộ, động viên, tạo điều kiện thuận lợi của Ban lãnh đạo Khoa Y Dược -
Đại học Quốc gia Hà Nội cùng sự giúp đỡ của các đồng nghiệp tại Bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc cho sự ủng hộ và giúp đỡ đó. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình tôi, chồng tôi đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, tháng 08 năm 2020 TÁC GIẢ LUẬN ÁN Phạm Thị Hồng Nhung
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC......................................................................................................... 1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ....................................... 5 DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... 8 DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ 9 MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 12 1. ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 12 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................... 14 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................... 14 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ...................................... 15 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN ... 15 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 17 1.1. THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN................................................. 17 1.1.1. Các dạng thụ thể và phối tử ................................................................. 17 1.1.2. Cấu trúc của GPCR .............................................................................. 19 1.1.3. Cơ chế hoạt động của GPCR ............................................................... 21 1.1.4. Các phương pháp phân tích GPCR ..................................................... 23 1.2. TACHIKININ VÀ CÁC THỤ THỂ NEUROKININ ....................... 26 1.2.1. Các phối tử tachykinin ......................................................................... 26 1.2.2. Các dạng thụ thể neurokinin ................................................................ 28 1.3. SỰ BIỂU HIỆN CỦA NK1R TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO ........... 32 1.3.1. Các dạng thụ thể neurokinin-1 ở người............................................... 32 1.3.2. Đáp ứng tế bào được kích hoạt bởi phối tử SP thông qua NK1R ..... 35 1.3.3. Ứng dụng của các chất đối kháng NK1R ........................................... 38 1
1.3.4. Phân tích chức năng thụ thể dựa vào thay đổi nồng độ Ca2+ nội bào ..40 1.4. CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN THỤ THỂ TÁI TỔ HỢP .............. 44 1.4.1. Hệ thống dịch mã phi tế bào ................................................................ 44 1.4.2. Hệ thống biểu hiện ở tế bào nhân sơ ................................................... 45 1.4.3. Hệ thống biểu hiện ở nấm men............................................................ 45 1.4.4. Hệ thống biểu hiện ở các tế bào côn trùng.......................................... 46 1.4.5. Hệ thống biểu hiện ở tế bào động vật có vú........................................ 47 1.5. SƠ LƯỢC VỀ CÁC CÂY THUỐC VÀ HOẠT CHẤT ĐƯỢC THỬ NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU............................................... 50 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 55 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................. 55 2.1.1. Các vector nhân dòng và biểu hiện ..................................................... 55 2.1.2. Các mồi và đoạn oligonucleotide dùng trong nghiên cứu ................. 55 2.1.3. Các dòng tế bào và môi trường nuôi cấy ............................................ 56 2.1.4. Tinh chất và dịch chiết methanol thực vật .......................................... 56 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............... 59 2.2.1. Hóa chất nghiên cứu chính .................................................................. 59 2.2.2. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 60 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 60 2.3.1. Phát triển hệ thống vector SFV biểu hiện NK1R ............................... 62 2.3.2. Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ ....................... 67 2.3.3. Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R của người ..................................... 68 2.3.4. Biểu hiện NK1R tái tổ hợp thông qua lây nhiễm SFV ...................... 69 2.3.5. Đánh giá mức độ biểu hiện và hoạt tính NK1R ................................. 70 2.3.6. Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của một số dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp ............................................... 72 2.3.7. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu........................................... 74 2
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 76 3.1. THIẾT KẾ HỆ VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI ............................................................................................... 76 3.1.1. Thiết kế cặp mồi khuếch đại gen trong PCR ...................................... 76 3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pSFV-KLEPT1.2 ....................................... 78 3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 .................................... 80 3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1 ............................................ 83 3.1.5. Nhân dòng, tách chiết và bảo quản các vector.................................... 85 3.2. TẠO HẠT SFV MANG TRÌNH TỰ NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI......................................................................................................... 87 3.2.1. Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ ....................... 87 3.2.2. Tạo hạt SFV tái tổ hợp từ tế bào BHK-21 ......................................... 88 3.3. ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ................................................................................................. 90 3.4. ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP TRÊN TẾ BÀO BUỒNG TRỨNG CHUỘT HAMSTER TRUNG QUỐC (CHO) ......... 91 3.4.1. Đánh giá động học biểu hiện protein .................................................. 91 3.4.2. Kiểm tra biểu hiện NK1R trên tế bào CHO qua lai Western ............ 92 3.4.3. Phép thử chức năng thụ thể bằng Fura-2AM ..................................... 94 3.5. NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO DỊCH CHIẾT METHANOL VÀ TINH CHẤT CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VIỆT NAM TRÊN NK1R TÁI TỔ HỢP................................................................................................ 95 3.5.1. Xác định các thông số dược lực học của chất chủ vận và chất đối kháng đặc hiệu NK1R .................................................................................... 95 3.5.2. Đánh giá tương tác giữa thụ thể NK1R tái tổ hợp với dịch chiết methanol và tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam ............................ 97 3
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................ 104 4.1. PHÁT TRIỂN VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R CỦA NGƯỜI TRÊN TẾ BÀO CHO ............................................................................... 104 4.2. NGHIÊN CỨU CÁC DẠNG BIẾN THỂ CỦA THỤ THỂ ........... 113 4.3. NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO CÁC HOẠT CHẤT HƯỚNG ĐÍCH THỤ THỂ NK1R TÁI TỔ HỢP.................................. 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 125 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................... 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 129 PHỤ LỤC 4
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 2D/3D Cấu trúc không gian 2 chiều/3 chiều AA Aarachidonic acid AC Adenylate cyclase AM Gốc este của acetoxymethyl AP Aprepitant (chất đối kháng đặc hiệu của NK1R) BHK Dòng tế bào thận chuột Hamster Baby (Baby Hamster Kidney) BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin) cAMP AMP vòng (cyclic adenosine monophosphate) cDNA DNA bổ sung với mRNA được tạo ra từ phản ứng phiên mã ngược (complementary DNA) CHO Dòng tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary) CHO-NK1R Dòng tế bào CHO biểu hiện thụ thể NK1R tái tổ hợp COS Dòng tế bào nguyên bào sợi thận khỉ DMEM Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM Medium) DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribose nucleic acid EC50 Nồng độ hiệu lực 50% (Median effective concentration) EC80 Nồng độ hiệu lực 80% (so với hiệu lực tối đa - 100%) E. coli Chủng vi khuẩn Escherichia coli eGFP Protein huỳnh quang lục mạnh (Enhanced Green Fluorescent Protein) EGFR Thụ thể thúc đẩy tăng trưởng biểu mô (epidermal growth factor receptor) ER Mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum) 5
ERK Các kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (extracellular signal regulated kinases) FBS Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum) FDA Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Agency) Fura-2 Amino acidopolycarboxylic Fura-2AM Fura-2 acetoxymethyl este GPCR Thụ thể kết cặp G-protein (G-protein coupled receptor) HEK Dòng tế bào thận phôi người (Human Embryonic Kidney Cells) HeLa Dòng tế bào ung thư cổ tử cung người IC50 Nồng độ ức chế 50% (Median inhibitory concentration) IC50TB Nồng độ ức chế 50% trung bình IL interleukin IP3 Inositol triphosphate JAK Janus kinase Kd Hằng số phân ly (Dissociation coefficient) Ki Hằng số ức chế (Inhibitory coefficient) LB Môi trường Luria-Bertani (LB medium) LD50 Liều gây chết 50% (50% lethal dose) LX Leukotrienes MAPK Protein kinase hoạt hóa phân bào (mitogen-activated protein kinases) MCS Vị trí nhân dòng đa điểm (Multicloning site) MLC Chuỗi nhẹ của myosin (myosin regulatory light chain) NCBI Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Hoa Kỳ (National Centre for Biotechnology Information) 6
NHS Dịch vụ y tế quốc gia của Anh (National Health Service) NK1R Thụ thể neurokinin 1 (neurokinin-1 receptor) NK1R Trình tự mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 OD Mật độ hấp thụ quang (Optical Density) PBS Đệm PBS (Phosphate buffered saline) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase (Polymerase Chain Reaction) PI3K Phosphoinositide 3-kinase PK Protein kinase PLA2 Phospholipase A2 PLC Phospholipase C pSFV-NK1R Vector pSFV mang trình tự NK1R RNA Ribose nucleic acid RFU Đơn vị huỳnh quang tương đối (Relative fluorescence unit) STAT Protein dẫn truyền tín hiệu và kích hoạt phiên mã (Signal Transducer and Activator of Transcription Protein) SFV Semliki Forest Virus SP Substance P (chất chủ vận đặc hiệu của NK1R) TXA2 Thromboxane A2 U937 Dòng tế bào ung thư bạch cầu đơn nhân người 7
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Cấu trúc các tachikinin của người ........................................................27 Bảng 1.2. Công dụng của các cây thuốc dùng trong nghiên cứu .........................50 Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................55 Bảng 2.2. Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu ......................56 Bảng 2.3. Danh mục cây thuốc trong nghiên cứu và vị trí thu mẫu.....................67 Bảng 2.4. Điều kiện và thành phần của phản ứng nối và tạo DNA đầu bằng nhờ enzyme phân đoạn Klenow ...................................................................63 Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng nối đoạn chèn vào vector pSFV 66 Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng colony PCR sàng lọc khuẩn lạc có vector chứa đoạn chèn đúng chiều ...................................................65 Bảng 2.7. Chế độ xung điện đồng biến nạp RNA hệ SFV vào tế bào BHK-21 bằng thiết bị Gene pulser Xcell II (Biorad) ..........................................69 Bảng 3.1. Thông số của các cặp mồi tự thiết kế ....................................................76 Bảng 3.2. Kết quả tách plasmid ..............................................................................86 8
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây phát sinh chủng loại các họ GPCR người và vị trí của NK1R ..20 Hình 1.2. Cấu trúc chung của 3 họ thụ thể GPCR chính...............................21 Hình 1.3. Truyền tín hiệu từ GPCR qua thay đổi cấu trúc G-protein ...........22 Hình 1.4. Hoạt động của GPCR ....................................................................23 Hình 1.5. Cấu trúc của thụ thể neurokinin-1 .................................................32 Hình 1.6. So sánh cấu trúc và đáp ứng tế bào của thụ thể NK1R có chiều dài đầy đủ và dạng ngắn ......................................................................34 Hình 1.7. Sự dẫn truyền tín hiệu thông qua NK1R .......................................36 Hình 1.8. Sự giải phóng Ca2+ thông qua inositol 1,4,5-trisphosphate ..........41 Hình 1.9. Những con đường duy trì nồng độ Ca2+ tế bào chất ở mức thấp ..42 Hình 1.10. Tế bào cơ trơn nhuộm Fura-2 và kích thích với Angiotensn II ....43 Hình 1.11. Các hệ thống vector biểu hiện xây dựng từ hệ gen SFV ...............48 Hình 1.12. Công thức phân tử và cấu trúc không gian 2 chiều của capsaicin, piperine, rotundine và rutin ...........................................................52 Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ............................................................61 Hình 2.2. Sơ đồ tạo vector cải biến pSFV-KLEPT1.2 .................................62 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm phát triển vector pSFV-KLEPT1.2-NK1 ..........66 Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm phát triển vector pSFV-EGFP-NK1 .................67 Hình 2.5. Cách bố trí phép thử chức năng NK1R trên đĩa 96 giếng .............73 Hình 3.1. Vị trí các mồi dùng nhân dòng đoạn chèn NK1R trong vector pSFV2-EGFP-NK1 và pSFV-KLEPT1.2-NK1 ............................77 Hình 3.2. Kết quả giải trình tự đoạn cải tiến trong vector pSFV-KLEPT1.2 ...79 Hình 3.3. Kết quả điện di trình tự NK1R thu được thông qua PCR trên khuôn pJET1.2-NK1 và plasmid pSFV-KLEP1.2 ...................................80 9
Hình 3.4. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pSFV- KLEPT1.2-NK1 ............................................................................81 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt mở vòng pSFV2 và pEGFP-NK1 bằng XhoI và NotI ..................................85 Hình 3.6. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pSFV-EGFP- NK1.......................................................................................................84 Hình 3.7. Kiểm tra chất lượng DNA plasmid được mở vòng và sản phẩm RNA được phiên mã in vitro trên gel agraose 1% ........................87 Hình 3.8. Ảnh chụp từ kính hiển vi soi nổi tế bào BHK sau chuyển gen 18 giờ và 42 giờ ..................................................................................88 Hình 3.9. Biểu hiện NK1R trên một số dòng tế bào .....................................90 Hình 3.10. Ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào CHO được lây nhiễm SFV mang trình tự mã eGFP tái tổ hợp .................................................92 Hình 3.11. Ảnh chụp từ kính hiển vi tế bào CHO không nhiễm virus và tế bào CHO nhiễm SFV ...........................................................................93 Hình 3.12. Ảnh lai Western với kháng thể kháng beta-tubulin và kháng thể kháng neurokinin-1 của tế bào CHO tự nhiên và tế bào CHO nhiễm hạt SFV-NK1R ...................................................................93 Hình 3.13. Sự thay đổi Ca2+ nội bào của tế bào CHO và CHO-NK1R theo thời gian sau khi bổ sung SP .........................................................95 Hình 3.14. Đường cong đáp ứng theo liều thể hiện hoạt tính biểu hiện chức năng của thụ thể NK1R tái tổ hợp của người ................................96 Hình 3.15. Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R tái tổ hợp của dịch chiết methanol Bình vôi, Hồ tiêu và Hòe ...............................................................99 Hình 3.16. Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết methanol Cỏ mần trầu, Sâm vũ diệp và tam thất hoang, Râu mèo và Đảng sâm... 100 10
Hình 3.17. Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết methanol Canhkina và Ba kích .................................................................................. 101 Hình 3.18. Mối tương quan giữa hàm lượng tinh chất được phân tích trong dịch chiết methanol và hoạt độ ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết .......102 Hình 3.19. Hoạt độ ức chế thụ thể NK1R được hoạt hóa bởi SP 10-7M với các tinh chất có trong dược liệu Việt Nam ...................................... 103 Hình 4.1. Kết quả so sánh trình tự protein suy diễn từ cDNA mã hóa NK1R với trình tự protein công bố trên Ngân hàng gen NCBI ........... 114 Hình 4.2. Nghiên cứu di truyền dược lý các thuốc hướng đích GPCR ..... 117 Hình 4.3. Phương pháp sử dụng thụ thể GPCR trong sàng lọc dược chất có nguồn gốc tự nhiên ............................................................... 123 11
MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Thụ thể neurokinin-1 (viết tắt là NK1R) nói riêng và thụ thể kết cặp với G-protein (viết tắt là GPCR) nói chung là đích tác dụng quan trọng của rất nhiều thuốc hiện nay. Khi NK1R tương tác với chất chủ vận nội sinh sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về thần kinh trung ương, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm. Ngoài ra, NK1R tham gia kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể. Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của NK1R, nhiều loại thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, chống nôn cho các bệnh nhân ung thư… đã và đang được các hãng dược phẩm đầu tư phát triển và thương mại hóa. Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học hướng đích GPCR phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc là nhu cầu mang tính thời sự trong các nghiên cứu dược lý học phân tử. Có một số lượng lớn các hợp chất mới có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp (được gọi chung là các thuốc thử) cần xác định đích phân tử và cơ chế dược lý tác động lên cơ thể. Hiện nay, việc sử dụng các GPCR tự nhiên thường gặp khó khăn do các dòng tế bào GPCR tự nhiên biểu hiện ở mức độ thấp, việc thu mẫu và phân lập từ tế bào người gặp nhiều hạn chế về mặt đạo đức cũng như kỹ thuật. Ngoài ra, các GPCR có nhiều dạng biến thể (subtype) khác nhau, có thể dẫn đến những nhận định nhầm về khả năng tương tác với các thuốc thử. Tuy nhiên, những khó khăn trên có thể khắc phục bằng cách sử dụng các tế bào biểu hiện GPCR tái tổ hợp của người. GPCR tái tổ hợp biểu hiện ở mức độ cao và đầy đủ hoạt tính sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính vì 12
vậy, xây dựng mô hình biểu hiện mạnh GPCR tái tổ hợp của người trên các hệ thống tế bào động vật là nghiên cứu cấp thiết và có giá trị thực tiễn trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Mặc dù nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển nhằm biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào nhân sơ đến nhân chuẩn, đến nay biểu hiện hiệu suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức lớn. Sự biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới yêu cầu biến đổi sau dịch mã, sự cuộn gập protein, vận chuyển nội bào và khả năng gây độc tính tế bào của thụ thể. Có một thuận lợi là các GPCR dù đa dạng về trình tự amino acid song có cấu trúc không gian tương đồng lớn (đều là đơn chuỗi peptide với 7 miền xuyên màng kị nước). Chính vì vậy, mô hình biểu hiện thành công cho một thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho rất nhiều thụ thể khác, đặc biệt là các thụ thể cùng họ GPCR. Trong các hệ thống biểu hiện, hệ thống biểu hiện của Semliki Forest Virus (viết tắt là SFV) được ghi nhận là một trong những hệ thống biểu hiện protein màng tế bào động vật trong thời gian nhanh nhất. Theo tài liệu, hệ thống này đã được một số hãng dược phẩm (như Hoffman La Roche) ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR phục vụ cho nghiên cứu và phát triển thuốc, nhưng các dòng tế bào tái tổ hợp không được thương mại hóa trên thị trường. Trong bối cảnh đó, việc ứng dụng và làm chủ được hệ thống biểu hiện SFV hứa hẹn cung cấp một công cụ sinh học hữu ích trong nghiên cứu y sinh dược học ở Việt Nam. Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận án: “Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm”. 13
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu tổng quát Biểu hiện được NK1R tái tổ hợp của người trên dòng tế bào tự nhiên vốn không biểu hiện thụ thể này nhằm sàng lọc hoạt chất và dịch chiết dược liệu hướng đích NK1R. Qua đó, tạo cơ sở xây dựng mô hình biểu hiện cho các GPCR tái tổ hợp khác phục vụ cho các nghiên cứu và phát triển dược phẩm ở Việt Nam. 2.2. Mục tiêu cụ thể Mục tiêu 1: Xây dựng được quy trình kỹ thuật biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người thông qua hệ thống biểu hiện SFV trên dòng tế bào động vật. Mục tiêu 2: Đánh giá được hoạt động chức năng của NK1R tái tổ hợp biểu hiện trên tế bào động vật. Mục tiêu 3: Áp dụng được tế bào động vật biểu hiện thụ thể NK1R trong sàng lọc một số dược liệu tiềm năng. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Phát triển hệ vector SFV biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người. Nội dung 2: Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R tái tổ hợp của người. Nội dung 3: Đánh giá biểu hiện NK1R trên một số dòng tế bào động vật. Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện và chức năng của NK1R người tái tổ hợp trên tế bào CHO. Nội dung 5: Tạo ra một lượng lớn tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người với đầy đủ chức năng, ứng dụng bước đầu trong nghiên 14
cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của 10 loài dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp. 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống biểu hiện GPCR người tái tổ hợp, từ xây dựng vector chuyển gen mã hóa NK1R của người đến biểu hiện thụ thể tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học các hoạt chất hướng đích NK1R in vitro của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn, có tính mới trên thế giới. Dòng tế bào động vật biểu hiện thụ thể tái tổ hợp của người là công cụ hiện đại và hiệu quả phục vụ cho các nghiên cứu y sinh học. Hệ thống biểu hiện SFV đã được thiết lập để tạo được dòng tế bào CHO biểu hiện mạnh NK1R người lần đầu tiên ở Việt Nam. Đây là cơ sở biểu hiện thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho nhiều GPCR khác. Xây dựng được mô hình sàng lọc in vitro các hoạt chất hướng đích NK1R phục vụ các các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm. Đây là một công cụ mới và hiện đại phục vụ cho các nghiên cứu dược lý, phù hợp với định hướng phát triển các thuốc dược liệu của Việt Nam hiện nay. 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Về mặt khoa học Trình tự NK1R của hai bệnh nhân Việt Nam đã được biểu hiện thành công trên dòng tế bào CHO, mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật biểu hiện ổn định các thụ thể tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc phân tử, dược lý in vitro, góp phần định hướng cho các nghiên cứu phát triển thuốc ở các giai đoạn sau (nghiên cứu dược lý in vivo, nghiên cứu lâm sàng, nghiên cứu dược động học, ...). 15