Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích các biến đổi ở 3 protein vỏ Fiber, Penton và Hexon của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ phân lập ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:66

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu này sẽ cung cấp rất nhiều thông tin về ADN và cấu trúc protein vỏ của HAdV-3 tại Việt Nam đầu tiên trên thế giới. Kết quả từ nghiên cứu cũng sẽ được so sánh với các công bố trên thế giới để đánh giá mức độ biến đổi và làm mốc nghiên cứu tốc độ biến đổi trình tự ADN của HAdV-3 tại Việt Nam trong tương lai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích các biến đổi ở 3 protein vỏ Fiber, Penton và Hexon của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ phân lập ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Lê Tuấn Anh PHÂN TÍCH CÁC BIẾN ĐỔI Ở 3 PROTEIN VỎ FIBER, PENTON VÀ HEXON CỦA HADV-3 GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Lê Tuấn Anh PHÂN TÍCH CÁC BIẾN ĐỔI Ở 3 PROTEIN VỎ FIBER, PENTON VÀ HEXON CỦA HADV-3 GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Văn Sáng Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Sáng – giảng viên tại Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN - người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp tôi tiếp thu được nhiều kiến thức về kỹ thuật chuyên môn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Những chỉ dẫn của thầy là định hướng quan trọng giúp tôi hoàn thành tốt luận văn cao học và bước đi tự tin trên con đường khoa học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, TS. Đỗ Thị Phúc, TS. Trần Đức Long, ThS. Trần Thùy Anh, và các thầy cô công tác tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Cảm ơn các thầy cô đã hết lòng giảng dạy những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt hai năm học vừa qua. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Sinh học Phân tử và Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học đã tạo điều kiện cho chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Hà Nội trong đề tài mã số QG.17.19. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân – những người đã luôn bên cạnh, tạo điều kiện và động viên, cho tôi động lực để phấn đấu trong quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này. Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2019 Học viên Lê Tuấn Anh
BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT µL Microliter µM Micromol ADN Acid Deoxyribonucleic bp Base pairs CAR Coxsackie and Adenovirus Receptor DF Dodecahedron-fiber GON Group of nine GOS Group of six HAdV Human Adenovirus HVR Hypervariable region IgA Immunoglobulin A IgG Immunoglobulin G NGS Next Generation Sequencing PCR Polymerase Chain Reaction SCR Short Consensus Repeats SNP Single nucleotide polymorphism UV Ultra violet
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các chủng HAdV và các bệnh gây ra [22] ....................................................6 Bảng 2: Giá trị pI và chỉ số pH của các axit amin ....................................................14 Bảng 3: Thành phẩn phản ứng PCR ..........................................................................20 Bảng 4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR ....................................................................20 Bảng 5: Mồi khuếch đại gen fiber của HAdV-3 ở Việt Nam ...................................23 Bảng 6: Các biến đổi trên gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham chiếu ..........................................................................................................................25 Bảng 7: Các biến đổi axit amin trên đầu tương tác fiber ..........................................29 Bảng 8: Mồi khuếch đại gen penton của HAdV-3 ở Việt Nam ................................30 Bảng 9: Các biến đổi trên gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham chiếu ..........................................................................................................................33 Bảng 10: Các biến đổi axit amin trên protein penton ...............................................36 Bảng 11: Mồi khuếch đại gen hexon của HAdV-3 ở Việt Nam ...............................37 Bảng 12: Các biến đổi trên gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam so với trình tự tham chiếu ..........................................................................................................................40 Bảng 13: Các biến đổi axit amin trên protein hexon.................................................44
DANH MỤC HÌNH Hình 1: Mô tả cấu trúc của HAdV [63] ......................................................................8 Hình 2: Cấu trúc fiber và sự liên kết với penton .........................................................9 Hình 3: Sự liên kết giữa fiber và domain SCR1-2 của thụ thể CD46 [40] ...............10 Hình 4: Sự liên kết giữa GON và GOS tạo nên vỏ capsid HAdV [8] ......................11 Hình 5: Cấu trúc axit amin [59] ................................................................................13 Hình 6: Cấu trúc chuỗi xoắn α và nếp gấp β [3] .......................................................15 Hình 7: Liên kết kỵ nước và cầu disulfua trong cấu trúc bậc 3 của protein [59]......16 Hình 8: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen fiber .........................................24 Hình 9: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự của gen fiber của HAdV-3 tại Việt Nam.....24 Hình 10: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen fiber ..........26 Hình 11: Hình ảnh xếp chồng của đầu tương tác protein fiber HAdV .....................27 Hình 12: Đầu tương tác fiber của HAdV-3 tại Việt Nam và domain SCR1-2 của thụ thể CD46 ...................................................................................................................28 Hình 13: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen penton ...................................31 Hình 14: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự gen penton của HAdV-3 tại Việt Nam ......31 Hình 15: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen penton.......32 Hình 16: Protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam và các axit amin biến đổi ........35 Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen hexon.....................................38 Hình 18: Hình ảnh tín hiệu giải trình tự của gen hexon của HAdV-3 tại Việt Nam 38 Hình 19: Hình ảnh kết quả so sánh trình tự ADN và axit amin của gen hexon ........39 Hình 20: Protein hexon của HAdV-3 ở Việt Nam ở dạng monomer và các axit amin biến đổi ......................................................................................................................43 Hình 21: Biến đổi G42A và M884L trên cấu trúc trimer hexon ...............................43
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan bệnh đau mắt đỏ .............................................................................3 1.2. Tổng quan về Human adenovirus ....................................................................5 1.3. Phản ứng của hệ miễn dịch với HAdV ............................................................7 1.4. Cơ chế xâm nhiễm của HAdV .........................................................................7 1.5. Các protein vỏ của HAdV ................................................................................8 1.6. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp giải trình tự Sanger ..........................12 1.7. Tổng quan về axit amin .................................................................................12 1.8. Cấu trúc của protein .......................................................................................15 1.9. Phương pháp phân tích mô phỏng cấu trúc protein .......................................17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................19 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................19 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 23 3.1. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein fiber của HAdV-3 tại Việt Nam .......................................................................................................................23 3.2. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein penton của HAdV-3 tại Việt Nam .......................................................................................................................30 3.3. Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc protein hexon của HAdV-3 tại Việt Nam .......................................................................................................................37 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 46
4.1. Kết luận ..........................................................................................................46 4.2. Kiến nghị........................................................................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................47
ĐẶT VẤN ĐỀ Đau mắt đỏ (tên tiếng Anh: pink-eye hoặc conjunctivitis) là một trong những bệnh về mắt phổ biến nhất trên thế giới. Bệnh thường không nguy hiểm đến tính mạng nhưng có mức độ lây truyền rất nhanh trong người dân, gây ra những hệ lụy sức khỏe cho cộng đồng [16, 32, 36, 49]. Nguyên nhân chủ yếu gây ra đau mắt đỏ là vi-rút Human Adenovirus (HAdV). Các thành phố lớn ở Việt Nam có mật độ dân cư dày đặc là môi trường lý tưởng cho các chủng vi-rút này lan truyền. Cho đến nay, các nghiên cứu về HAdV ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc xác định và phân loại [24, 27]. Các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra HAdV-3 là một trong những chủng phổ biến gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam. Nếu như không có những nghiên cứu đi sâu vào phân tích các protein cấu trúc vỏ của HAdV-3 thì sẽ rất khó để Việt Nam có thể ứng phó kịp thời nếu xuất hiện các chủng biến đổi mới có độc lực cao. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Phân tích các biến đổi ở 3 protein vỏ Fiber, Penton và Hexon của HAdV-3 gây bệnh đau mắt đỏ phân lập ở Việt Nam” với các mục tiêu cụ thể: 1. Giải mã được trình tự của 3 đoạn ADN mã hóa các protein Fiber, Penton và Hexon của chủng HAdV-3 - một trong những chủng gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam. 2. Phát hiện những biến đổi trong trình tự dẫn đến sự thay đổi về cấu trúc của các protein nêu trên. 3. Phân tích hậu quả của những biến đổi cấu trúc tới khả năng xâm nhiễm và gây bệnh của HAdV-3 ở Việt Nam. Nghiên cứu này sẽ cung cấp rất nhiều thông tin về ADN và cấu trúc protein vỏ của HAdV-3 tại Việt Nam đầu tiên trên thế giới. Kết quả từ nghiên cứu cũng sẽ được so sánh với các công bố trên thế giới để đánh giá mức độ biến đổi và làm mốc nghiên cứu tốc độ biến đổi trình tự ADN của HAdV-3 tại Việt Nam trong tương lai. 1
Đây sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu chuyên sâu hơn về hệ protein của chủng vi- rút này, góp phần định hướng nghiên cứu cách phòng tránh sự lây lan của HAdV-3 ở Việt Nam và thế giới. Các kết quả trong nghiên cứu này cũng đã được chấp nhận đăng trên tạp chí khoa học của Bộ Khoa học và Công nghệ. 2
Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan bệnh đau mắt đỏ Bệnh đau mắt đỏ có tên tiếng Anh là “conjunctivitis”, xuất phát từ “conjunctiva”, để chỉ trạng thái viêm của phần kết mạc ở mắt người. Biểu hiện thường gặp nhất ở bệnh nhân đau mắt đỏ là các mạch máu vùng kết mạc sưng đỏ, có thể đi kèm chảy nước mắt, sưng đau, ngứa rát, giảm thị lực và nhạy cảm với ánh sáng [78]. Dựa vào nguyên nhân gây bệnh mà đau mắt đỏ được chia thành các dạng sau đây [74]: - Đau mắt đỏ do dị ứng: + Đau mắt đỏ dị ứng: Thường xảy ra ở những người có tiền sử dị ứng theo mùa. + Đau mắt đỏ có gai thịt: Gây ra bởi những vật lạ tiếp xúc với mắt trong thời gian dài như kính áp tròng hoặc mắt giả. - Đau mắt đỏ lây nhiễm: + Đau mắt đỏ vi khuẩn: Dạng đau mắt đỏ này thường xuất phát từ việc tiếp xúc với những môi trường chứa khuẩn cầu chum và khuẩn cầu chuỗi. Nguồn lây nhiễm có thể từ chính cơ thể bệnh nhân hoặc tiếp xúc với người khác thông qua việc dùng chung đồ trang điểm, kính,… + Đau mắt đỏ vi-rút: Đây là dạng phổ biến nhất và dễ lây lan từ người sang người thông qua việc hắt hơi. Nếu tiếp xúc với dịch cơ thể của những người mắc đau mắt đỏ vi-rút như nước mắt, dịch nước mũi; thì nguy cơ lây bệnh sẽ rất cao. + Viêm mắt sơ sinh: Dạng đau mắt đỏ này rất nguy hiểm và hay gặp ở trẻ nhỏ. Nếu người mẹ mắc bệnh chlamydia hoặc bệnh lậu, khi sinh nở, mắt trẻ sẽ rất dễ tiếp xúc với các vi khuẩn này và gây biến chứng lớn tới thị lực của trẻ. 3
- Đau mắt đỏ do hóa chất: Dạng này cũng khá phổ biến khi bệnh nhân phải làm việc trong môi trường khói bụi hoặc chất clo trong bể bơi. Tuy không nguy hiểm đến tính mạng nhưng bệnh đau mắt đỏ là cực kỳ phổ biến; bệnh nhân phải chịu nhiều khó khăn trong sinh hoạt và có thể mắc bệnh ở mọi độ tuổi, giới tính và vùng địa lý; những trường hợp nặng có thể dẫn đến các biến chứng về thị lực, thậm chí mù lòa [4, 43, 73]. Ngoài ra, chi phí để điều trị cho các bệnh nhân đau mắt đỏ cũng tiêu tốn khoảng 589 triệu đô la (tại Mỹ năm 2005), đấy là mới chỉ tính riêng nguyên nhân gây bệnh là vi khuẩn [55]. Năm 2015 ở đảo Réunion của Pháp, một trận dịch đau mắt đỏ kéo dài 13 tuần cũng đã làm thiệt hại hơn 3,3 triệu euro cho các công tác kiểm soát dịch, chưa tính các tác động như người dân phải nghỉ việc để điều trị bệnh,… [19]. Để phòng tránh và giảm nguy cơ bị đau mắt đỏ, các bác sỹ khuyến cáo mọi người không nên sử dụng chung những đồ dùng cá nhân như khăn mặt, khăn tay; hạn chế dụi mắt và thường xuyên rửa tay sạch sẽ; và đeo kính bảo vệ khi tiếp xúc với môi trường khói bụi, nhiễm khuẩn [76]. Nếu đã bị bệnh thì bệnh nhân cũng được khuyến cáo là chưa cần điều trị ngay lập tức bởi vì các triệu chứng thường sẽ giảm hoặc biến mất sau khoảng 1-2 ngày [46, 52]. Trường hợp bệnh kéo dài hơn, tùy thuộc vào nguyên nhân mà có cách điều trị khác nhau: Đau mắt đỏ do dị ứng: Đầu tiên cần loại bỏ tác nhân gây dị ứng. Với những trường hợp nhẹ thì có thể nhỏ nước mắt bình thường. Nặng hơn thì có thể cần sự can thiệp của thuốc kháng viêm (loại không chứa steroid) hoặc thuốc kháng histamin. Những bệnh nhân mãn tính thì có thể phải dùng thuốc nhỏ mắt chứa steroid. Đau mắt đỏ do vi khuẩn: Sử dụng thuốc nhỏ mắt có chứa chất kháng sinh hoặc thuốc mỡ để tra vào mắt. Việc điều trị đau mắt đỏ với tác nhân vi khuẩn thường kéo dài 3- 4 ngày. Đau mắt đỏ do vi-rút: Đau mắt đỏ dạng này vẫn chưa có cách chữa trị đặc hiệu mà chỉ có các phương pháp làm giảm mức độ khó chịu của bệnh như: tra thuốc nhỏ mắt loại thường hoặc chườm lạnh. Bệnh sẽ tự thuyên giảm sau 2-3 tuần. Đặc biệt, thuốc 4
kháng sinh không có tác dụng đối với đau mắt đỏ do vi-rút gây ra vì việc này chỉ phù hợp với nguyên nhân vi khuẩn; điểm nguy hại là nếu sử dụng sai loại kháng sinh và liều lượng thì bệnh nhân có thể bị bệnh nặng hơn [38]. Đau mắt đỏ do hóa chất: Nhẹ nhàng rửa mắt với rất nhiều nước, sau đó đến gặp bác sỹ ngay để nhận tư vấn. Nói tóm lại, bệnh đau mắt đỏ có thể xuất phát từ nhiều nguyên nhân khác nhau: thời tiết, môi trường làm việc, thói sinh hoạt hàng ngày,… [4]. Tuy nhiên; hầu hết các bác sỹ chuyên khoa mắt sử dụng thuật ngữ “đau mắt đỏ” để ám chỉ bệnh do nguyên nhân vi-rút gây ra [76], bởi vì đây là tác nhân hay bắt gặp nhất và có nguy cơ lây lan nhanh nhất. Những vi-rút gây bệnh đau mắt đỏ có thể kể đến như: Human adenovirus, Herpes simplex, Herpes zoster, và Enterovirus [73], Trong đó, Human adenovirus được thống kê là vi-rút gây bệnh đau mắt đỏ phổ biến nhất và thường gây ra những trận đại dịch lớn trên khắp thế giới [35, 38, 68, 73]. 1.2. Tổng quan về Human adenovirus HAdV thuộc chi Mastadenovirus, họ Adenoviridae, bao gồm 7 loài được kí hiệu bằng các chữ cái từ HAdV-A đến HAdV-G [7, 26]. HAdV không có vỏ ngoài, đường kính vỏ capsid khoảng 90 nm, vật chất di truyền là ADN sợi đôi không phân mảnh, có kích thước khoảng 36 Kb [37, 79]. HAdV rất phổ biến ở cả người và động vật. Chúng có thể tồn tại một thời gian dài bên ngoài vật chủ, thời gian ủ bệnh lên tới vài năm và có khả năng xâm nhiễm vào nhiều cơ quan khác nhau [75]. Theo số liệu thống kê và nghiên cứu, các chủng HAdV gây ra rất nhiều nhóm bệnh khác nhau, bao gồm: viêm dạ dày, viêm gan, viêm cơ tim, viêm phổi,… (Bảng 1). Tuy nhiên, các bệnh này thường gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi và các dấu hiệu bệnh cũng khá lành tính [22]. Trường hợp đặc biệt là HAdV-14 đã từng gây ra một trận đại dịch viêm phổi đã làm 7 người chết ở bang Oregon (Mỹ) [29]. Bên cạnh những bệnh cấp tính ở người, nhiều chủng HAdV cũng có thể là tác nhân tiền ung thư cho các loài động vật nhỏ. Ví dụ như HAdV-12 (loài HAdV-A) có khả năng gây u nhú ở động vật gặm nhấm [69, 70]. 5
Bảng 1: Các chủng HAdV và các bệnh gây ra [22] HAdV Chủng Đường gây bệnh Hệ tiêu hóa, Hệ hô hấp, Đường tiết A 12, 18, 31 niệu Viêm giác mạc, Hệ tiêu hóa, Hệ hô B, tuýp 1 3, 7, 16, 21 hấp, Đường tiết niệu Hệ tiêu hóa, Hệ hô hấp, Đường tiết B, tuýp 2 11, 14, 34, 35 niệu Hệ hô hấp, Hệ tiêu hóa (bao gồm C 1, 2, 5, 6 viêm gan), Đường tiết niệu 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22- D Viêm giác mạc, Hệ tiêu hóa 30, 32, 33, 36-39, 42-49 E 4 Viêm giác mạc, Hệ hô hấp F 40, 41 Hệ tiêu hóa G 52 Hệ tiêu hóa Bởi vì sự đa dạng và phức tạp trong cơ chế biến đổi di truyền của HAdV, một nhóm các nhà khoa học trên thế giới đã hợp tác để thống nhất cách xác định các chủng HAdV mới phát hiện; tới nay, đã có 103 chủng HAdV được chính thức công nhận bởi nhóm này [77]. Đáng chú ý nhất, các chủng thuộc loài HAdV-D có khả năng tái tổ hợp rất cao và hình thành nên các chủng mới [61], và đa phần các chủng trong loài này đều được phát hiện là tác nhân gây đau mắt đỏ. Bên cạnh loài HAdV-D thì loài HAdV-B và HAdV-E cũng có những chủng được phân lập trong các trận dịch đau mắt đỏ, các chủng thường xuyên liên quan đến đau mắt đỏ bao gồm HAdV-3, 4, 7, 8, 19 và 37 [67]. 6
1.3. Phản ứng của hệ miễn dịch với HAdV HAdV có nhiều cách để tiếp cận tế bào chủ, vì vậy, tùy thuộc vào chủng HAdV, trạng thái cơ thể và cơ quan bị lây nhiễm, hệ miễn dịch sẽ có những đáp ứng khác nhau. Thậm chí, HAdV còn có những cách để lẩn trốn tế bào miễn dịch như: ức chế quá trình tự chết apoptosis của tế bào bị lây nhiễm, ức chế các đáp ứng của interferon, và ngăn chặn biểu hiện của MHC-1 (Major Histocompatibility Complex) trên bề mặt tế bào [23, 34, 53, 60, 66]. Ba cách xâm nhiễm thường gặp ở HAdV gồm có: - Xâm nhiễm sinh tan (đối với tế bào biểu mô): HAdV sẽ làm tan tế bào và giải phóng các hạt vi-rút mới. - Xâm nhiễm tiềm ẩn (đối với tế bào lympho): chỉ có rất ít tế bào bị phá vỡ và số lượng tế bào chết đi được bù đắp lại bởi quá trình nhân bản tự nhiên. - Xâm nhiễm tiền ung thư: ADN của HAdV được gắn vào vật liệu di truyền của tế bào chủ và tái bản cùng với nó mà không sản xuất thêm hạt vi-rút mới. Kháng thể chống lại HAdV đa phần là IgA. Đầu tên, trong vòng 3 ngày sau lây nhiễm, kháng thể được tìm thấy ở đường hô hấp trên, đến 7 ngày thì thấy ở dịch nước mũi, huyết thanh (thường có cả kháng thể IgG) [60]. Các kháng thể sẽ tấn công trực tiếp vào protein hexon trên bề mặt vỏ capsid của HAdV vì chúng mang những thành phần kháng nguyên phổ biến [23, 66]. Một mặt khác, các tế bào T tham gia vào quá trình hồi phục của tế bào sau khi sự xâm nhiễm kết thúc. Trên thực tế, các tế bào T CD4+ có khả năng ghi nhớ được các kháng nguyên của HAdV và có thể được tái kích hoạt nếu cơ thể bị nhiễm một chủng HAdV khác với chủng đã nhiễm trước đó [20]. 1.4. Cơ chế xâm nhiễm của HAdV Cơ chế xâm nhiễm chính xác của HAdV vẫn còn là một dấu hỏi lớn cần được giải đáp. Cho đến hiện tại, các nhà khoa học trên thế giới mới chỉ biết chắc chắn rằng HAdV sử dụng kết hợp 3 protein vỏ là fiber, penton và hexon, để xâm nhập vào tế 7
bào chủ. Thậm chí, mỗi chủng HAdV khác nhau lại sử dụng 3 protein nêu trên theo cách riêng biệt để thực hiện chức năng của chúng. Trên thực tế, các loài HAdV-A, C, D, E và F xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua thụ thể Coxsackie and Adenovirus Receptor (CAR) [5, 45, 58]. Trong khi đó, các chủng thuộc loài B như HAdV-3 lại sử dụng thụ thể CD46 để nhận biết tế bào vật chủ [21, 51, 54]. 1.5. Các protein vỏ của HAdV Lớp vỏ capsid của HAdV tương tác với môi trường bên ngoài bởi 3 protein cấu trúc chính là: fiber, penton và hexon. Ở dạng chức năng trong tự nhiên, các protein fiber và hexon của HAdV tồn tại ở dạng trimer, còn penton ở dạng pentamer. Vỏ capsid của mỗi một hạt vi-rút HAdV được tạo thành từ 12 fiber trimer, 12 penton pentamer, và 240 hexon trimer; mang cấu trúc dạng đa diện 20 mặt cắt. Cấu trúc vỏ capsid đặc biệt này đã được Waye mô tả đơn giản như trong Hình 1. Các protein vỏ Các protein lõi Hình 1: Mô tả cấu trúc của HAdV [63] 8
1.5.1. Protein fiber của HAdV Cấu trúc chung của protein fiber của HAdV gồm có 3 phần: đầu tương tác (fiber knob), trục (fiber shaft) và đuôi (fiber tail). Đầu tương tác chính là phần tiếp xúc với tế bào vật chủ để mở đầu cho việc xâm nhiễm. Tuy nhiên, fiber không thể thực hiện được chức năng một mình, mà phải luôn liên kết với protein penton; bộ phận nắm giữ vai trò đó chính là đuôi fiber (Hình 2A). A B Hình 2: Cấu trúc fiber và sự liên kết với penton A. Cấu trúc chung protein fiber [71], B. Sự sắp xếp penton trong cấu trúc DF (cắt nửa) [56] Sự kết hợp của hai protein fiber và penton của HAdV-3 đã được chỉ ra là “chìa khóa” giúp HAdV bám lên và xâm nhiễm tế bào chủ [6]. Chúng tạo thành cấu trúc Dodecahedron-fiber (DF) được tổng hợp rất nhiều trong vòng đời của HAdV- 3,4,7,9,11,15 [18, 56]. Trên thực tế, trong quá trình xâm nhiễm của HAdV-3, cấu trúc DF còn được tổng hợp nhiều hơn cả các hạt vi-rút hoàn chỉnh. Mỗi DF được cấu thành từ 12 pentamer penton gắn với 12 trimer fiber tương ứng (Hình 2B). Cơ chế hoạt động chính xác của DF vẫn chưa sáng tỏ, nhưng đã biết được đầu tương tác fiber của HAdV-3 nhận biết 2 domain SCR1 và SCR2 của thụ thể CD46, kết hợp với Penton để “mở đường” chui vào tế bào (Hình 3). Nhiều nhóm nghiên cứu đã ứng dụng những hiểu biết về cấu trúc DF để tạo ra những vector chuyển gen ở người [17, 18, 31, 42]. 9
Hình 3: Sự liên kết giữa fiber và domain SCR1-2 của thụ thể CD46 [40] 1.5.2. Protein penton của HAdV Có thể nói penton là protein trung gian giữa hai protein fiber và hexon bởi vì penton liên kết chặt chẽ với 2 protein này ở những phần cấu trúc riêng biệt: Phần lõi lõm vào của pentamer penton là đặc điểm thích hợp để gắn protein fiber; còn hình dáng bên ngoài của penton là “hẹp ở chân, rộng ở đầu” – bắt cặp khít với hình dáng “hẹp ở đầu, rộng ở chân” của hexon [72]. Đáng chú ý, penton của các chủng HAdV khác nhau có trình tự axit amin tương đối bảo thủ hơn so với fiber và hexon [72], điều này thích hợp để lý giải cho những chức năng quan trọng của protein này. Đặc biệt hơn là penton còn thể hiện thêm nhiều vai trò quan trọng khác khi liên kết với nhiều thành phần lõi của vi-rút như: protein IIIa và genome [30]. Một nghiên cứu đã chỉ ra penton là protein đích thứ 2 của các tế bào miễn dịch T (chỉ xếp sau hexon) [57]. Chính vì vậy mà penton được xem là giữ vai trò quan trọng trong tính đặc hiệu và hiệu quả của các vector chế tạo từ human adenovirus [33]. 10
1.5.3. Protein hexon của HAdV Hexon là protein cấu trúc có kích thước lớn nhất và có số lượng nhiều nhất trong lớp vỏ của HAdV. Một trimer hexon có cấu trúc không gian dạng lục giác, việc này giúp chúng có thể liên kết sát nhau và hạn chế các khoảng trống trên bề mặt capsid. Hơn nữa, protein hexon liên kết chặt chẽ với protein penton để tạo nên cấu trúc “nhóm sáu” (Group of Six – GOS) giúp liên kết các “nhóm chín” (Group of Nine – GON) với nhau (GOS và GON là hai đơn vị thành phần tạo nên lớp vỏ 20 mặt của HAdV) (Hình 4) [9, 30]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: hexon là mục tiêu nhận biết của hệ miễn dịch để chống lại HAdV [47, 65]. Nghiên cứu năm 2007 của David Onion đã thể hiện rõ ràng sự nhận biết của tế bào miễn dịch CD4+ đối với hexon chứ không phải fiber hay penton [39]. Các tế bào miễn dịch có thể nhận biết được hexon là vì protein này có những vùng cấu trúc siêu biến (hypervariable regions - HVR). Các vùng siêu biến này cũng từng được sử dụng như một đặc điểm riêng biệt để phân biệt các chủng HAdV khác nhau [50]. Hình 4: Sự liên kết giữa GON và GOS tạo nên vỏ capsid HAdV [8] 11
Như vậy, 3 protein vỏ: fiber, penton, và hexon kết hợp chặt chẽ với nhau để giúp HAdV tồn tại, lây nhiễm và gây ra nhiều loại bệnh cho con người. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu sâu về các protein nêu trên còn cực kỳ hạn chế. Luận văn này là công trình nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc của 3 protein fiber, penton, và hexon ở Việt Nam. Việc phân tích và so sánh với các công bố trên thế giới sẽ chỉ ra những biến đổi quan trọng trên 3 protein vỏ, giúp HAdV-3 ở Việt Nam có khả năng lây lan mạnh mẽ. 1.6. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp giải trình tự Sanger Về cơ bản thì hai phương pháp giải trình tự này sử dụng cùng một cơ chế là: các nucleotide (gắn huỳnh quang) được sử dụng để tổng hợp nên mạch ADN mới, và tín hiệu huỳnh quang phát ra được đọc bởi các máy quay siêu nhạy. Điểm khác biệt lớn nhất là phương pháp Sanger chỉ giải được trình tự của 1 đoạn ADN mỗi lần chạy, trong khi đó, NGS có thể giải trình tự được hàng triệu đoạn ADN cùng một lúc (kích thước mỗi đoạn ADN ngắn hơn so với phương pháp Sanger). Chính vì điểm khác biệt này mà phương pháp NGS có những ưu điểm vượt trội về: thời gian ngắn và lượng dữ liệu đầu ra rất lớn. Tuy nhiên, NGS chỉ thích hợp để giải trình tự của những hệ gen lớn (trên 100 gen mỗi lần chạy). Còn trong luận văn này, chúng tôi chỉ giải trình tự của 3 gen fiber, penton và hexon, nên phương pháp Sanger là lựa chọn tiết kiệm hơn, phù hợp với điều kiện kinh phí của đề tài. Hơn nữa, giải trình tự Sanger được xem là tiêu chuẩn vàng với độ chính xác lên tới là 99,99%, và thường được sử dụng để kiểm tra lại kết quả giải trình tự NGS. Khẳng định này được đưa ra bởi một trong những công ty hàng đầu thế giới về NGS là ThermoFisher [81]. 1.7. Tổng quan về axit amin Axit amin là những hợp chất hữu cơ sinh học quan trọng trong mọi cơ thế sống. Cấu trúc chung của mỗi axit amin gồm 3 phần: Nhóm chức amin (-NH2), Nhóm axit cacboxylic (-COOH) và một nhóm thay thế (gọi là R). Ba bộ phận này được kết nối bởi một nguyên tử Cacbon tại vị trí α (Hình 5). 12