Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định gián tiếp Cloxacillin bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (F – AAS)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:74

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận văn nhằm tìm điều kiện phù hợp để xây dựng quy trình xác định Cloxacilin trong thực phẩm. Từ kết quả thực nghiệm xây dựng một quy trình xác định gián tiếp Cloxacilin bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS). Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định gián tiếp Cloxacillin bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (F – AAS)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------o0o------------ PHÙNG THỊ PHƢƠNG XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (F-AAS) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Luận HÀ NỘI - 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------o0o------------ PHÙNG THỊ PHƢƠNG XÁC ĐỊNH GIÁN TIẾP CLOXACILLIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (F-AAS) TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2011
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 5 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ........................................................................................... 7 1.1. Giới thiệu chung chất kháng sinh ........................................................... 7 1.1.1. Lịch sử ra đời........................................................................................ 7 1.1.2. Phân loại ............................................................................................... 7 1.1.3. Đánh giá tác dụng ................................................................................ 8 1.2. Giới thiệu Cloxacilin .................................................................................. 8 1.2.1. Cấu tạo phân tử và tính chất ............................................................... 8 1.2.2. Đặc điểm và tác dụng ........................................................................... 9 1.2.3. Điều chế chung ................................................................................... 10 1.2.4. Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm ........................ 11 1.2.5. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay ................................................................................................................. 11 1.3. Các phƣơng pháp phân tích Cloxacilin ................................................. 14 1.3.1. Phương pháp quang học .................................................................... 14 1.3.2. Phương pháp điện hóa ....................................................................... 15 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE).. 16 1.3.4. Sắc ký bản mỏng (TLC) ..................................................................... 18 1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................... 19 1.3.6. Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA) .......................................... 22 1.3.7. Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA) ......................................... 22 1.3.8. Phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử.............................................. 23 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 26 2.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu ......................................................... 26 1
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu ................................................... 26 2.1.2. Phương pháp áp dụng ........................................................................ 26 2.1.3. Nội dung ngiên cứu ............................................................................ 27 2.2. Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất ........................................................... 28 2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................... 28 2.2.2. Hoá chất .............................................................................................. 28 CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................... 30 3.1. Khảo sát điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa của Ag ......... 30 3.1.1. Khảo sát chọn vạch phổ hấp thụ ....................................................... 30 3.1.2. Khảo sát khe đo .................................................................................. 31 3.1.3. Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng............................................ 32 3.1.4. Khảo sát thành phần hỗn hợp khí cháy ............................................ 33 3.1.5. Khảo sát tốc độ dẫn mẫu .................................................................... 34 3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới phép đo phổ F – AAS của Ag. ..... 35 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loại axit và nồng độ axit .................... 35 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng thành phần nền của mẫu ................................ 36 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các cation .................................................. 39 3.3. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá phép đo F – AAS của Ag ........... 47 3.3.1 .Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính và xây dựng đường chuẩn............................................................................................................. 47 3.3.2. Kiểm tra hằng số trong phương trình hồi quy .................................. 50 3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)51 3.3.4. Tính nồng độ chất phân tích dựa trên dường chuẩn ....................... 52 3.4. Đánh giá sai số và độ lặp lại của phƣơng pháp đo Ag ......................... 53 3.5. Tổng kết các điều kiện đo phổ F – AAS của Ag.................................... 55 2
3.6. Khảo sát các điều kiện phân huỷ Cloxacilin ......................................... 55 3.6.1. Ảnh hưởng của môi trường KOH đến hiệu suất phân huỷ Cloxacilin giải phóng clo. ............................................................................ 56 3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất .......... 57 3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất ........ 58 3.6.4. Ảnh hưởng của thời gian đến kết tủa AgCl ...................................... 59 3.7. Giới hạn phát hiện ................................................................................... 60 3.8. Xác định Cloxacilin trong mẫu thực ...................................................... 61 3.8.1. Lấy mẫu .............................................................................................. 61 3.8.2. Xử lý mẫu........................................................................................... 62 3.8.3. Chuẩn bị mẫu và phân tích mẫu ....................................................... 63 3.8.4. Xác định độ thu hồi ............................................................................ 65 3.9. Kết quả phân tích một số mẫu thực ....................................................... 66 KẾT LUẬN .......................................................................................................................... 68 3
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAS Atomic absorption spectrometry (Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử) AbsAg Absortion of Siliver (Độ hấp thụ quang của Ag) AMO Amoxicillin AMP Ampicilin A6AP Acid 6-amino penicillanic CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản) CLO Cloxacillic CZE Capillary zone electrophoresis (Điện di mao quản vùng) F-AAS Flame atomic absorption spectrometry (Phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa) HCL Hollow cathde lamp (Đèn catốt rỗng) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantity (Giới hạn xác định) RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) OXA Oxacillin SS Sum of square (tổng các bình phương) 4
MỞ ĐẦU Từ lâu việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh bổ sung vào thức ăn gia súc cho thấy chúng không những được dùng để chống nấm mốc mà còn có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng cường hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm tỉ lệ chết và còi cọc, tăng khả năng sinh sản. Tuy nhiên, sử dụng thức ăn có bổ sung kháng sinh trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, lượng kháng sinh tồn dư này có thể gây dị ứng, gây bệnh cho con người khi sử dụng sản phẩm đó. Đồng thời bổ sung kháng sinh vào thức ăn gia súc sẽ gây hiện tượng nhờn thuốc phát triển các loại vi khuẩn độc hại kháng thuốc. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng tràn lan trong thức ăn cho lợn, gia cầm và tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt là phổ biến. Các nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi đều sử dụng kháng sinh không hợp lí (không xét nghiệm kháng sinh đồ, sử dụng theo kinh nghệm không đúng liều lượng), một số cơ sở chăn nuôi không dùng thuốc đúng quy định, bán chạy khi sử dụng thuốc không hiệu quả. Từ đó dẫn đến tồn dư kháng sinh trong thực phẩm cao gấp hàng chục cho đến hàng nghìn lần so với tiêu chuẩn quốc tế(CODEX). Chính vì vậy, kháng sinh là một trong những đối tượng cần phải kiểm soát dư lượng trong thực phẩm bởi những độc tính, những tác dụng phụ có thể gây ra cho con người khi sử dụng thực phẩm có tồn dư lượng kháng sinh. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích mới để xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm là yêu cầu cần thiết. Trên thế giới, phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) đã được ứng dụng rất phổ biến. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: độ nhạy và độ 5
chọn lọc cao, có thể xác định nhiều ion trong cùng một dung dịch, cho phép phân tích nhanh hàng loạt với độ chính xác và lặp lại cao, các thao tác tiến hành đơn giản và thuận tiện, có thể tự động hoá quá trình phân tích. Ở nước ta phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử đã là một trong các phương pháp tiêu chuẩn để phân tích lượng vết các kim loại trong nhiều đối tượng khác nhau như: đất, nước, không khí, thực phẩm,…Ngày nay bằng cách gián tiếp người ta đã xác định hàng trăm chất hữu cơ và các phi kim với độ nhạy, độ chính xác cao. Với các kết quả đó chúng tôi nhận thấy phương pháp AAS là một phương pháp thích hợp để xác định gián tiếp Cloxacilin trong thực phẩm. Vì vậy trong bản luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm điều kiện phù hợp để xây dựng quy trình xác định Cloxacilin trong thực phẩm. Từ kết quả thực nghiệm xây dựng một quy trình xác định gián tiếp Cloxacilin bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS). 6
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung chất kháng sinh (1,2,26) 1.1.1. Lịch sử ra đời Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau đó là hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác. Giới y học định nghĩa: Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá sinh học, có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh tự nhiên. 1.1.2. Phân loại Các chất kháng sinh được phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm các nhóm sau: - Kháng sinh β -lactam - Kháng sinh Aminoglycosid - Kháng sinh Tetracylin - Cloramphenicol và dẫn xuất - Kháng sinh Macrolid - Kháng sinh Lincosamid - Kháng sinh polypeptide - Các kháng sinh khác: Rifamycin 7
1.1.3. Đánh giá tác dụng Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh thiên nhiên, không nguyên chất. Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm kháng sinh bán tổng hợp. 1.2. Giới thiệu Cloxacilin Cloxacilin là một thành viên trong nhóm kháng sinh penicillin thuộc họ β- lactamase 1.2.1. Cấu tạo phân tử và tính chất a. Cấu tạo phân tử H H CH3 S COONH CH3 Cl N N O O COOH Hình 1.1. Cấu tạo phân tử cloxacillin b. Tính chất vật lý Thuốc ở dạng bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng, hơi có mùi, vị đắng dễ hút ẩm. Dễ tan trong nước và methanol, tan trong etanol 96%, thực tế không tan trong ethylacetat. c. Tính chất hoá học Tác dụng cản trở không gian đối với penicillinase là do nhân isoxazol mang hai nhóm 5-methyl và 3-phenyl ở vị trí ortho đối với vị trí 4- nối với -CO-. Do tác dụng hút điện tử của nhân isoxazol, kháng sinh này bền với axit và hấp thụ tốt khi uống nên có thể dùng cả đường uống và đường tiêm. 8
Có hoạt phổ hẹp, chủ yếu trên vi khuẩn gram(+). Phổ IR được dùng phổ biến để định tính phổ. Hấp thụ quang UV có cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl. Cloxacilin kém bền với ánh sáng. Vì vậy ta phải bảo quản chúng trong lọ kín, tối tránh ánh sáng trực tiếp. 1.2.2. Đặc điểm và tác dụng Cơ chế: Cloxacilin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, Cloxacilin còn hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Kháng thuốc: Thuốc đã bị nhiều loại vi khuẩn kháng lại do nó được sử dụng rộng rãi trong điều trị cũng như làm thức ăn bổ sung như: vi khuẩn đường ruột, nhiều chủng tụ cầu, liên cầu, phế cầu. Độc tính: Kháng sinh Cloxacilin có độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ. Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc. 9
Ngoài ra Cloxacilin còn có tác dụng phụ là làm chuyển màu xỉn men răng, giảm liên kết răng lợi, giòn xương và cản trở sự phát triển xương, răng ở trẻ em trong thời kỳ phát trển (dưới 8 tuổi). Chỉ định: Dùng cho các nhiễm tụ cầu sinh penicillinase gây ra như các nhiễm khuẩn đường niệu, đường hô hấp, ở các mô mềm, xương khớp, da... Thường dùng theo đường uống. Thức ăn có ảnh hưởng tới hấp thu. Tiêm đối với trường hợp bệnh nặng, cấp tính. Có thể phối hợp với các kháng sinh khác đặc biệt là ampicillin, để mở rộng phổ tác dụng. Uống 0,25-0,50g/lần  4 lần/24 h. Nếu tiêm tương đương với liều uống. Cloxacilin được dùng rất phổ biến. 1.2.3. Điều chế chung Sinh tổng hợp: Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất dạng kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình lên men. Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid → polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men. Bán tổng hợp: Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic (A6AP). 10
Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, Khi đó môi trường dồi dào A6AP, chiết lấy trực tiếp. Tách phần phenylacetyl ( C6H5-CH2-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng được penicillin khác. Tổng hợp hoá học: Chưa được ứng dụng rộng rãi. 1.2.4. Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm Theo công văn số: 571 QLCL-CL1 ngày 14/04/2011 [4] của Cục quản lí chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản cho phép mức dư lượng thuốc thú y tối đa trong thực phẩm có nguồn gốc động vật để giết thịt bao gồm cả gia cầm và cá nuôi ao, nuôi lồng như sau: Bảng 1.1. Hàm lượng tối đa cho phép Cloxacilin trong thực phẩm [4] Kháng sinh Loại thực phẩm mg/kg Thịt 0,3 Mỡ 0,3 Cloxacilin Gan 0,3 Thận 0,3 Sữa 0,03 1.2.5. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với 11
các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales [5,27], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao. Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [19] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [10], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày). 12
Theo [10] qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42% Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển. Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế hoạch toàn cầu để kiểm soát sự đề kháng Kháng sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất. 13
Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của thuốc kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng. 1.3. Các phƣơng pháp phân tích Cloxacilin 1.3.1. Phương pháp quang học Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm. Tuy nhiên khả năng ứng dụng của phương pháp này bị giới hạn vì trong dược phẩm thường chứa các tá dược có khả năng hấp thụ ánh sáng tại vùng phổ phân tích, gây sự chen lấn phổ. Các penicillin hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường hợp, các penicillin được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích. Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các kháng sinh β- lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam. A. Fernández-González và cộng sự [15] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7M (0,16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [21], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của 14
kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP là 0,76 mg/l. Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l. Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này. 1.3.2. Phương pháp điện hóa Nguyên tắc của phương pháp này là đo thế cân bằng của các điện cực nghiên cứu để xác định nồng độ chất cần phân tích hoặc theo dõi sự biến thiên nồng độ chất trong phản ứng chuẩn độ của nó. Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các kháng sinh nhưng không phổ biến nhiều. Theo [18], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0,1M pH=5,2. 15
C.M. Couto, J.L.F.C. Lima, M. Conceicao, B.S.M. Montenegro đã xác định Chlortetracyclin bằng việc sử dụng phương pháp điện thế kết hợp với phương pháp dòng chảy, dùng điện cực màng ống kép, màng là tinh thể đồng nhất CuS/Ag2S. Khi đó Chlortetracyclin được xác định dựa vào việc tính độ giảm nồng độ Cu(II) do tạo phức với Chlortetracyclin [6]. Saad.S.M.Hassan và M.H.Eldesouki đã xác định Chlortetracyclin trong các chế phẩm dược có sử dụng điện cực chọn lọc ion cadmi. Phương pháp dựa trên phản ứng khử nhóm nitro bằng cadmi kim loại, phản ứng xảy ra hoàn toàn và định lượng trong môi trường axit HCl, ion cadmi giải phóng ra và được định lượng bằng cách chuẩn độ với EDTA ở pH = 10. Hiệu suất thu hồi của phương pháp là 99,3%, độ lệch chuẩn tương đối  0,5% [6]. 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [25] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5. Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0,14 đến 0,27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%, diện tích pic 1,3 đến 4,15%. Độ thu hồi trên 96%. 16
Biyang Deng và cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu. Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8. Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+250C, +40C và -180C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng. Theo [12], Chen và Gu đã tách đồng thời oxytetracylin, tetracylin, chlortetracylin trong sữa, huyết thanh và nước tiểu bằng CE. Các mẫu được deprotein bằng đệm succinat và các tetracylin ở dạng huyền phù được làm sạch bằng cột sắc ký ái lực chelat kim loại. Các muối được giải hấp từ cột được loại bỏ bằng trimetylsilan C18. Độ thu hồi của các kháng sinh tetracylin từ các mẫu là 40  84%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là 3,3  9,1% M.I.Bailon-Perez và cộng sự [25] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, 17
dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%. Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [25] xác định 9 loại kháng sinh gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8,5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến 1,42 mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1,5 đến 1,7%. Độ thu hồi từ 91 – 95,6%. 1.3.4. Sắc ký bản mỏng (TLC) Sắc ký bản mỏng là khái niệm đưa ra phương pháp sử dụng lớp mỏng pha tĩnh phủ trên một bản mỏng thuỷ tinh hay nhựa plastic. Pha động là các dung môi khác nhau có thể là phân cực hoặc không phân cực hoặc dung dịch đệm. Sau khi phủ lớp pha tĩnh lên bản mỏng, nạp chất phân tích vào một phía sau của bản mỏng rồi cho bản mỏng tiếp xúc với pha động ở phía mẫu (nên thực hiện trong hệ kín, không khí bão hoà pha động). Sau một thời gian nhất định, lấy bản mỏng ra cho hiện chất phân tích. Tiến hành định tính và định lượng chất phân tích. Trong sắc ký bản mỏng pha tĩnh rất đa dạng: chất hấp phụ, trao đổi ion, chất rây phân tử. Do vậy sắc ký bản mỏng cũng có đầy đủ bốn cơ chế tách là hấp phụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử tuỳ thuộc vào pha tĩnh sử dụng.[6,12] 18