Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phát hiện được sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ; xác định đượcsự liên quan với các yếu tố tiên lượng khác và ý nghĩa khuếch đại gen MYCN.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN XUÂN HUY XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội– Năm 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN XUÂN HUY XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội– Năm 2016
Lời cảm ơn Đề tài luận văn này đƣợc thực hiện tại Khoa Di Truyền và Sinh học phân tử bệnh viện NHI TW. Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, chủ nhiệm bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Cô đã hết lòng quan tâm, hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua. Mỗi lúc gặp khó khăn, cô luôn động viên, giúp đỡ tìm ra những cách giải quyết hợp lý nhất. Sự giúp đỡ và hƣớng dẫn nhiệt tình của cô đã giúp tôihoàn thành đƣợcluận văn tốt nghiệp này. Tôi xin đƣợc cảm ơn các đồng nghiệp trong khoa Di Truyền và Sinh học phân tử – Bệnh viện Nhi TW đã nhiệt tình giúp đỡtrong thời gian tôi thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh học, trƣờng Đại học khoa học tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể thực hiện tốt việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày …… tháng …… năm 2016 Học viên Nguyễn Xuân Huy
MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT......................................................................1 DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................2 DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................3 MỞ ĐẦU .....................................................................................................................4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................6 1.1 Lịch sử nghiên cứu ......................................................................................6 1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh ......................................................................6 1.2.1 Đặc điểm lâm sàng ..................................................................................6 1.2.2 Phân loại u NBTK ..................................................................................8 1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK ...................................................................9 1.2.4 Một số yếu tố tiên lƣợng của u NBTK ..................................................10 1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh .........14 1.3.1 Khuếch đại gen MYCN.........................................................................14 1.3.2 Các bất thƣờng nhiễm sắc thể ...............................................................17 1.4 Mô hình di truyền trong u NBTK .............................................................19 1.5 Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................20 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................21 2.2 Hóa chất thiết bị ........................................................................................22 2.2.1 Hóa chất ................................................................................................22 2.2.2 Trang thiết bị .........................................................................................22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu...........................................................................22 2.3.1 Nuôi cấy tế bào mẫu bệnh phẩm tủy xƣơng .........................................22 2.3.2 Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ .........................................................23 2.4 Đạo đức trong nghiên cứu .........................................................................24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................26 3.1 Xác định khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân u NBTK bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ..................................................................................26 3.2 Đánh giá khuếch đại gen MYCN với một số yếu tố tiên lƣợng khác ........31 3.2.1 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tuổi .................................................31 3.2.2 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới tính..........................................33 3.2.3 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo mô bệnh học ..................................34 KẾT LUẬN ...............................................................................................................39 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................41
Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt COG Children’s Oncology Group Tổ chức Ung thƣ Trẻ em DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DMs Double-Minute chromatin bodies Đoạn nhiễm sắc thể kép ngắn FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh phôi bò FISH Fluorescent in-situ hybridization Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ HSR Homogeneously Staining Vùng bắt màu đồng nhất Regions INPC International Neuroblastoma Hiệp hội Giải phẫu bệnh U Pathology Committee nguyên bào thần kinh Quốc tế INRGSS International Neuroblastoma Hệ thống phân giai đoạn u Risk Group Staging System nguyên bào thần kinh theo nhóm nguy cơ INSS International Neuroblastoma Hệ thống phân giai đoạn u Staging System nguyên bào thần kinh MBH Mô bệnh học MKI Mitosis karyorrhexis Index Chỉ số nhân chia/nhân tan NBTK Nguyên bào thần kinh RPMI Roswell Park Memorial Institute SSC Saline Sodium Citrate Muối Natri Citrate 1 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT 1
2 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các giai đoạn theo INSS ............................................................................... 9 Bảng 1.2. Các giai đoạn theo INRGSS........................................................................ 10 Bảng 1.3. Chỉ số MKI .................................................................................................. 13 Bảng 1.4. Bảng phân loại mô bệnh học ....................................................................... 14 Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào ..................................................... 22 Bảng 3.1. Kết quả xác định gen MYCN trên bệnh nhân UNBTK ............................... 28 Bảng 3.2. Danh sách 11 bệnh nhân u NBTK có khuếch đại gen MYCN .................... 29 Bảng 3.3. Phân bố khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi ......................................... 31 Bảng 3.4. Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi .............................. 31 Bảng 3.5. Phân bố khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK ... 34 Bảng 3.6. Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK ...................................................................................................... 35 Bảng 3.7. Phân bố khuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học ..................... 36 Bảng 3.8. Phân bố khôngkhuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học ........... 37 2
3 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các vị trí xuất hiện khối u[26] ....................................................................... 7 Hình 1.2. Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ [34] ............................................. 11 Hình 1.3. Cơ chế khuếch đại gen [27] ......................................................................... 16 Hình 1.4. Mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh [10] ......... 19 Hình 2.1. Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 ................................. 24 Hình 3.1. Khuếch đại gen MYCN trên tế bào u ........................................................... 26 Hình 3.2. Khuếch đại gen MYCN trên tế bào tủy xƣơng ............................................. 27 Hình 3.3. Khuếch đại gen MYCN theo 2 dạng HSR và DMs ...................................... 27 Hình 3.4. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân U NBTK ............................... 29 Hình 3.5. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi .............................................. 31 Hình 3.6. Tỷ lệ khuếch không đại gen MYCN theo nhóm tuổi ................................... 32 Hình 3.7. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới ........................................................ 33 Hình 3.8. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới ........................................................ 33 Hình 3.9. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u .................... 34 Hình 3.10. Tỷ lệ không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u ....... 35 Hình 3.11. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lƣợng MBH .................................. 36 Hình 3.12. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lƣợng MBH .................................. 37 3
4 MỞ ĐẦU Ung thƣ là một rối loạn về phát triển của các tế bào, ở đó các tế bào tăng sinh không kìm hãm, kết quả là hình thành các khối u trong cơ thể. Khối u là một tập hợp các tế bào có chung các đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan tổ chức xung quanh. Ung thƣ có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi,trong đó ung thƣ nhi chiếm khoảng 2% tổng số các loại ung thƣ. U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm , ở đó tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chƣa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh, chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (dƣới 6 tuổi), hiếm khi tìm thấy trên trẻ hơn 10 tuổi. Bê ̣nh chiếm khoảng 7% số ca ung thƣ ở trẻ em trên toàn th ế giới [43] . Tỷ lệ mắc mới tại bệnh viện Nhi Trung Ƣơng là khoảng 50 ca/năm. Con số này ổn định trong nhiều năm gần đây. Độ tuổi chẩn đoán của bệnhtrung bình là 18 tháng. Các biến đổi di truyền ở các tế bào ung thƣ rất phong phú, từ các bất thƣờng về cấu trúc, số lƣợng nhiễm sắc thể đến các đột biến gen; dẫn đến làm thay đổi hoạt động của tế bào. Tuy nhiên, có một vài chuyển đoạn hay đột biến gen là đặc trƣng của một loại ung thƣ nhất định, ví dụ nhƣ 90% bệnh nhân mắ c u lympho thể Burkitt có chuyể n đoa ̣n đă ̣c trƣ ng t(8;14) (đầu của nhiễm sắc thể 8 đã đƣợc chuyển đến phần cuối của nhiễm sắc thể 14) hay 20-25% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh có đột biến khuếch đại gen MYCN[40]. Hiện nay các bất thƣờng di truyền này đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới trong việc tiên lƣợng và phân nhóm nguy cơ cho các b ệnh nhân u nguyên bào thần kinh. Tuy vậy, ở Việt Nam, việc phát hiện các biến đổi di truyền này vẫn chƣa đƣợc thực hiện, gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ lâm sàng trong vi ệc tiên lƣợng bê ̣nh và lƣ̣a chọn phác đồ đi ều trị cho bệnh nhân. Vì vậy, từ nhiều năm nay, việc cần thiết có các xét nghiệm di truyền cho bệnh u nguyên bào thần kinh luôn đƣợc đặt ra. Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn nhƣ vậy, nghiên cứu đề tài “Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 4
- Phát hiện được sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. - Xác định đượcsự liên quan với các yếu tố tiên lượng khác và ý nghĩa khuếch đại gen MYCN. 5
1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu U nguyên bào thần kinh (Neuroblastoma – u NBTK) đƣợc mô tả là bệnh ung thƣ tiến triển. Các tế bào thần kinh chƣa trƣởng thành đƣợc tìm thấy trong bào thai hoặc thai nhi, đƣợc gọi là các tế bào nguyên bào thần kinh (Neuroblast). Năm 1864, bác sĩ ngƣời Đức tên là Rudoft Virchow phát hiện các khối u đƣợc tìm thấy trong ổ bụng của trẻ em mắc bệnh u thần kinh đệm (glioma). Năm 1910, James Horner-Wright, một nhà giải phẫu bệnh ở Boston (Hoa Kỳ), đã công bố một mô tả một loạt khối u thƣợng thận ở trẻ em, có đặc điểm tế bào giống với các tế bào thần kinh nguyên thủy của tuyến tủy thƣợng thận bào thai. Vì vậy, ông đã đặt tên hiện tƣợng này là “u nguyên bào thần kinh”[31]. Các kiểu di căn của u NBTK cũng đƣợc mô tả với công bố của bác sĩ William Pepper về các nốt di căn gan của trẻ u NBTK giai đoạn 4S và công bố của bác sĩ Robert Hutchison về các ổ di căn tại mắt [31]. UNBTK ban đầu đƣợc phẫu thuật cắt bỏ và xạ trị tại Bệnh viện Nhi Boston từ những năm 1940 [31]. Đồng thời, giá trị tiên lƣợng của tuổi chẩn đoán và di căn xƣơng cũng đƣợc xác định. Hóa trị liệu bắt đầu đƣợc sử dụng vào năm 1951 bởi Farber [17]và 1964 bởi Thurman[34] với một vài thành công bƣớc đầu. 1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm .Ở đó tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chƣa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh. Chính vì thế, u NBTK thƣờng xảy ra ở trẻ nhỏ[10]. Tỷ lệ mắc mới của u NBTK là 10,2 ca trên một triệu trẻ em dƣới 15 tuổi; là một trong những dạng ung thƣ phổ biến nhất đƣợc chẩn đoán trong năm đầu tiên của cuộc đời [8, 10, 32]. 1.2.1 Đặc điểm lâm sàng Khối u bắ t nguồ n tƣ̀ các mô c ủa hệ thần kinh giao cảm, điển hình là tƣ̀ tủy tuyến thƣợng thận và các hạch thầ n kinh dọc hai bên cột sống, và vì vậy u có thể xuấ t hiê ̣n ở nhiề u vi ̣trí khác nhau nhƣ ở cổ, ngực, bụng và tiể u khung. 6
Hình 1.1. Các vị trí xuất hiện khối u[26] Các biểu hiện lâm sàng rấ t đa da ̣ng phu ̣ thuô ̣c vào vi ̣trí u tiên phát và các biể u hiê ̣n di căn . Các triệu chứng nhƣ chƣớng bụng, đau bụng, nôn và kém ăn hay gặp trƣờng hợp u ổ bụng. Các khối u ở lồng ngực thƣờng đƣợc chẩn đoán một cách tình cờ khi bệnh nhân đƣợc chụp X quang tim phổi trong những trƣờng hợp chấn thƣơng hay nhiễm trùng. Trong các trƣờng hợp khác, bệnh nhân có thể có các bệnh lý hô hấp kèm theo nhƣ viêm phổi, tràn dịch màng phổi. Các khối u nằm cao trong lồng ngực hay ở cổ có thể có triệu chứng sụp mi mắt một bên, co đồng tử, giảm tiết mồ hôi (Hội chứng Horner). Những khối u rất to ở cạnh lồng ngực có thể gây chèn ép cơ giới các cơ quan xung quanh[1]. U NBTK di căn theo đƣờng bạch huyết và đƣờng máu. Tế bào u theo đƣờng bạch huyết di căn vào hạch lympho khu vực hoặc hạch xa. Theo đƣờng máu tế bào u thƣờng di căn vào tủy xƣơng, xƣơng, gan, da, hiếm khi vào phổi hay não[7, 30].Các bệnh nhân ở giai đoạn này thƣờng có biểu hiện toàn thân nhƣ sốt, mệt mỏi, sụt cân. 7
Biểu hiện di căn trên lâm sàng ở trẻ dƣới 1 tuổi có một số đặc điểm khác biệt với trẻ lớn: hay gặp di căn gan và da, di căn vào tủy xƣơng và xƣơng ít gặp hơn[29, 39].Các trƣờng hợp di căn não thƣờng có khuếch đại gen MYCN và mô bệnh học không thuận lợi. Các bệnh nhân này có tiến triển xấu, thƣờng nhanh chóng tử vong. U NBTK còn có thể di căn vào phổi, màng phổi[5]. 1.2.2 Phân loại u NBTK ChẩnđoánmôbệnhhọcuNBTKchủyếudựatrênhìnhtháihọc. Năm 2003, Hiệp hội Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế (INPC, International Neuroblastoma Pathology Committee) đã thống nhất đƣa ra HệthốngphânloaiuNBTKquốctếdựatrêncácbiếnđổihìnhtháiphốihợpvớiquátrìnhbiệthoá cũngnhƣcácyếutốtiênlƣợngMBH,phânloạiuNBTKthành4nhómnhƣsau[31] UNBTK(neuroblastoma)là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm dƣới 50% toàn bộ khối u. Dựa trên thành phần nguyên bào thần kinh, các u nguyên bào thần kinh đƣợc chia thành chƣa biệt hóa, ít biệt hóa và đang biệt hóa:  U nguyên bào thần kinh chƣa biệt hóa (undifferentiatedneuroblastoma) chiếm khoảng 2-3% tổng số u nguyên bào thần kinh.  U nguyên bào thần kinh ít biệt hóa (poorly differentiatedneuroblastoma), chiếm tới 65-75% các u nguyên bào thần kinh  U nguyên bào thần kinh đang biệt hóa (differentiatingneuroblastoma) chiếm khoảng 5% các u nguyên bào thần kinh UhạchNBTK,hỗnhợp(ganglioneuroblastoma, intermixed) là các khối u giàu mô đệm Schwann, quá trình biệt hóa chƣa hoàn thành, chiếm 2-3% các u nguyên bào thần kinh UhạchTK(ganglioneuroma) bao gồm u hạch thần kinh đang biệt hóa và u hạch thần kinh biệt hóa. U hạch thần kinh đang biệt hóa là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm ƣu thế chủ yếu kèm theo các tế bào đang biệt hóa (nguyên bào thần kinh, tế bào hạch) và đã biệt hóa hoàn toàn (tế bào hạch trƣởng thành). Khác với u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp, thành phần tế bào ở đây rất ít, không tạo thành các ổ vi thể mà chỉ là các tế bào riêng lẻ pha trộn lẫn vào. U hạch thần kinh biệt hóa bao gồm mô đệm Schwann và các tế bào hạch trƣởng thành, không có thành phần 8
nguyên bào thần kinh. U hạch thần kinh chiểm tỷ lệ thấp hơn 1% các u nguyên bào thần kinh. UhạchNBTK,nốt(ganglioneuroblastoma, nodular) thƣờng là các ổ nguyên bào thần kinh chảy máu trên đại thể (nghèo mô đệm Schwann); kèm theo u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp (giàu mô đệm Schwann) và u hạch thần kinh (mô đệm Schwann chủ yếu)[35]. Ngoài racókhoảng4-5 %các uNBTKkhông xếp loại đƣợc. 1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK Hệ thống phân loại u NBTK đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay là hệ thống INSS (International Neuroblastoma Staging System), sử dụng kết quả của cuộc mổ đầu tiên, ra đời năm 1988 bởi Brodeur và cộng sự (Bảng 1.1)[41]. Bảng 1.1. Các giai đoạn theo INSS Giai đoạn Lâm sàng 1 Khối u khu trú có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, có hoặc không có tồn dƣ bệnh vi thể; biểu hiện qua không di căn hạch bạch huyết 1 bên cơ thể ở mức độ vi thể. 2A Khối u khu trú không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, biểu hiện qua không có di căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể ở mức độ vi thể. 2B Khối u khu trú có hoặc không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn; có di căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể. Hạch bạch huyết mở rộng đối bên phải không có tế bào u di căn ở mức độ vi thể 3 Khối u 1 bên không thể cắt bỏ đã vƣợt qua đƣờng giữa cơ thể, có hoặc không có di căn hạch bạch huyết lân cận 4 Bất kỳ khối u tiên phát nào đã di căn các hạch bạch huyết ở xa, tủy, tủy xƣơng, gan, và/hoặc các nội tạng khác 4S Khối u tiên phát khu trú, đã di căn có giới hạn đến da, gan và/hoặc tủy xƣơng (tỷ lệ di căn ít hơn 10%), giới hạn với trẻ nhỏ hơn 12 tháng. 9
Hệ thống phân loại INRGSS (International Neuroblastoma Risk Group Staging System) (Bảng 1.2) sử dụng hệ thống các yếu tố nguy cơ về hình ảnh chặt chẽ[28]. Bảng 1.2. Các giai đoạn theo INRGSS Giai đoạn Lâm sàng L1 Khối u khu trú không liên quan đến các tạng thiết yếu và giới hạn ở một bên của cơ thể L2 Khối u khu trú ở một khu vực kèm theo một hoặc nhiều hơn yếu tố nguy cơ về hình ảnh M Bệnh đã di căn xa (trừ giai đoạn MS) MS Bệnh di căn ở trẻ ít hơn 18 tháng tuổi, và vị trí di căn là da, gan và/hoặc tủy xƣơng. Tuy nhiên, với INRGSS, giai đoạn MS còn phải xem xét đến 2 yếu tố là tuổi chẩn đoán (từ 12 đến 18 tháng) và khối u tiên phát lớn không thể cắt bỏ đƣợc. Bên cạnh đó, nghiên cứu một số lƣợng lớn bệnh nhân đã cho thấy việc sử dụng 18 tháng làm mốc chia nhóm tuổi chẩn đoán có nhiều ý nghĩa với lâm sàng hơn so với việc sử dụng 12 tháng tuổi nhƣ trƣớc đó.Hiện nay, việc sử dụng hệ thống phân giai đoạn INSS hay INRGSS tùy thuộc vào cơ sở vật chất và bác sĩ. INSS đƣợc lựa chọn ở những nơi có cơ sở vật chất hay bác sĩ chẩn đoán hình ảnh có nhiều hạn chế. Do đó, việc xác định giai đoạn sẽ dựa vào phẫu thuật và điều trị sẽ dựa theo phân loại đó. Còn ở những nơi có cơ sở vật chất và tay nghề bác sĩ tốt hơn, các nhà lâm sàng lại sử dụng hệ thống INRGSS. Vì khi đó, nhiều bệnh nhân không cần có sự can thiệp về y tế mà vẫn có thể khỏi bệnh, đặc biệt là các khối u khu trú ở trẻ ít hơn 1 tuổi. 1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng của u NBTK 1.2.4.1 Sự khuếch đại gen MYCN Nhiều biến đổi di truyền đã đƣợc xác định ở u NBTK có ý nghĩa tiên lƣợng bệnh, dựa trên đó có thể xác định đƣợc các bệnh nhân có nguy cơ tái phát hoặc có xu hƣớng tiến triển nặng. Trong đó việc xác định khuếch đại gen MYCN có giá trị tiên lƣợng cao đƣợc sử dụng để phân nhóm nguy cơ [11]. 10
Sự khuếch đại MYCN thƣờng xảy ra ở các u nguyên bào thần kinh tiên phát trên các bệnh nhân chƣa đƣợc điều trị. Sự khuếch đại này thƣờng gặp ở các giai đoạn muộn của bệnh với kết quả điều trị thấ p, nhƣng cũng có thể đƣợc tìm thấy ở các u tiến triển nhanh và có tiên lƣợng xấu, hoă ̣c th ậm chí ở trẻ sơ sinh hay bệnh nhân ở giai đoạn khu trú. Tỷ lệ khuếch đại MYCN ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh là 20 – Phân nhóm nguy cơ u NBTK 2004 Giai đoạn 1-3 hoặc Giai đoạn 4 4S Không khuếch đại Khuếch đại gen gen MYCN Tuổi  1 Tuổi < 1 MYCN Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Khuếch đại gen Không khuếch đại hoặc 4S hoặc 3 MYCN gen MYCN Không mất đoạn 1p Mất đoạn 1p Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Tuổi < 2 Tuổi 2 Nguy cơ trung bình Nguy cơ thấp Nguy cơ cao Nguy cơ trung bình 25% [6, 11, 20]. Hình 1.2. Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ [34] Nhóm bệnh nhân nguy cơ cao: - Bệnh nhân u NBTK ở giai đoạn 1,2,3 hoặc 4S có khuếch đại gen MYCN - Bệnh nhân u NBTK ở giai đoạn đoạn 4 và tuổi chẩn đoán ≥12 tháng - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuối chẩn đoán ≤ 12 tháng, và có khuếch đại gen MYCN. Nhóm bệnh nhân nguy cơ trung bình: - Bệnh nhân u NBTK không có khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 2 hoặc 3,có mất đoạn 1p. 11
- Bệnh nhân u NBTK không có khuếch đại gen MYCN, giai đoạn 3, không mất đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≥24 tháng. - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 4, tuổi chẩn đoán ≤ 12 tháng, không có khuếch đại gen MYCN. Nhóm bệnh nhân nguy cơ thấp: - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 1 hoặc 4S không có khuếch đại gen MYCN - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 2, không có khuếch đại gen MYCN, không mất đoạn 1p - Bệnh nhân u NBTK giai đoạn 3, không có khuếch đại gen MYCN, không mất đoạn 1p, tuổi chẩn đoán ≤24 tháng. 1.2.4.2 Tuổi của bệnh nhân u NBTK Ngay từ những thời điểm đầu nghiên cứu và chẩn đoán u nguyên bào thần kinh (1950), các nhà lâm sàng đã nhận thấy sự liên hệ giữa tuổi chẩn đoán của bệnh nhân với tiên lƣợng điều trị. Các bệnh nhân sơ sinh có đáp ứng điều trị tốt hơn so với các bệnh nhân nhi lớn tuổi[16]. Đến năm 1971, Breslow và McCann đã chứng minh rằng tuổi chẩn đoán vừa là một yếu tố tiên lƣợng quan trọng, vừa là một yếu tố tham gia vào việc xác định giai đoạn cho bệnh nhân [9]. Năm 2009, trong báo cáo của tổ chức Ung thƣ Trẻ em (Children’s Oncology Group - COG) do Susan Cohn và cộng sự công bố, điểm cắt giữa 2 nhóm tuổi chẩn đoán có những tiên lƣợng khác nhau đã đƣợc thông qua với sự đồng thuận quốc tế là 18 tháng. Tuy nhiên với các bệnh nhân giai đoạn M và không có khuếch đại gen MYCN, việc đánh giá tiên lƣợng về tuổi sẽ áp dụng điểm cắt về tuổi là 12 tháng [14]. Có 3 nhóm nguy cơ đƣợc xác định tỷ lệ sống sót trong vòng 5 năm dựa trên độ tuổi, giai đoạn và trạng thái của gen MYCN nhƣ sau:  Các bệnh nhân ở giai đoạn 1, 2, hay 4S ở tất cả các độ tuổi mà không có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó là 95% [23].  Các bệnh nhân ở giai đoạn 3 cũng nhƣ các bệnh nhân sơ sinh ở giai đoạn 4, không có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó khoảng 75% [10].  Các bệnh nhân lớn hơn 1 tuổi ở giai đoạn 4, ở giai đoạn 2 hay 3 mà có 12
khuếch đại MYCN cũng nhƣ các bệnh nhân sơ sinh đã di căn, có khuếch đại MYCN thì tỷ lệ đó chỉ là 30% [16]. U NBTK ở trẻ lớn (> 13 tuổi) và ngƣời lớn có một số đặc điểm cận lâm sàng, lâm sàng, tiến triển và tiên lƣợng bệnh khác với u NBTK ở trẻ em [15]. 1.2.4.3 Yếu tố mô bệnh học Chỉ số MKI MKI (mitotic – karyorrhectic index) là tỷ lệ giữa số lƣợng tế bào ở kỳ nguyên phân và kỳ phân hủy nhân. Hình ảnh nguyên phân đặc trƣng bởi các khối đặc chất nhiễm sắc hình tròn, có mấu nhọn và không có màng nhân. Tế bào phân hủy có hình ảnh các khối đặc từng đoạn kèm theo bào tƣơng đặc bắt kiềm. Chỉ số MKI đƣợc chia thành 3 loại (Bảng 1.3): Bảng 1.3. Chỉ số MKI Tỷ lệ phần trăm Số lƣợng tế bào MKI thấp 4% >200/5000 tế bào Chỉ số MKI cao thƣờng gặp ở các u NBTK chƣa hoặc ít biệt hóa có khuếch đại gen MYCN[31]. Tiên lƣợng mô bệnh học Hiệp hội Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế phân biệt thành 2 nhóm tiên lƣợng mô bệnh học: mô bệnh học thuận lợi và mô bệnh học không thuận lợi (Bảng 1.4). Việc phân chia bệnh nhân vào 2 nhóm tiên lƣợng này dựa vào tuổi chẩn đoán, trạng thái biệt hóa của khối u và một số đặc điểm khác nhƣ chỉ số nhân chia/nhân tan (MKI), nốt canxi hóa. Từ các yếu tố tiên lƣợng trên kết hợp với tuổi chẩn đoán của bệnh nhân, hai nhóm mô bệnh học đƣợc phân chia 13
Bảng 1.4. Bảng phân loại mô bệnh học Mô bệnh học MKI Tuổi chẩn đoán Nhóm mô bệnh học thuận lợi U NBTK ít biệt hóa MKI trung bình Ít hơn 1,5 tuổi U NBTK ít biệt hóa MKI thấp Ít hơn 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI trung bình Ít hơn 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI thấp Ít hơn 5 tuổi U hạch NBTK thể hỗn hợp Không áp dụng Mọi độ tuổi U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi U hạch thần kinh Không áp dụng Mọi độ tuổi Nhóm mô bệnh học không thuận lợi U NBTK không biệt hóa Mọi MKI Mọi độ tuổi U NBTK ít biệt hóa Mọi MKI Mọi độ tuổi U NBTK ít biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi U NBTK ít biệt hóa MKI thấp Trên 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI cao Mọi độ tuổi U NBTK đang biệt hóa MKI trung bình Trên 1,5 tuổi U NBTK đang biệt hóa Không áp dụng Trên 5 tuổi U hạch NBTK thể nốt Không áp dụng Mọi độ tuổi Nhiều nghiên cứu đã xác định yếu tố MBH có giá trị tiên lƣợng quan trọng, nhóm u có MBH thuận lợi có kết quả điều trị tốt hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm MBH không thuận lợi. Yếu tố MBH đƣợc sử dụng trong nhiều phác đồ để phân nhóm nguy cơ [21, 31, 32]. 1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh 1.3.1 Khuếch đại gen MYCN Gen MYCN là một gen tiền ung thƣ, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 2 tại vị trí 2p24.3. Gen có kích thƣớc 2602 bp gồm có 3 exon, mã hóa cho protein MYCN gồm 464 axit amin[19]. 14
Là một gen trội điển hình, sự biểu hiện của MYCNcó thể thấy trong các tế bào xô-ma, và thƣờng có sự kết hợp với các yếu tố gây ung thƣ khác. Sự biểu hiện quá mức của genMYCN có thể biến đổi các tế bào nguyên bào sợi từ giai đoạn bào thai sang giai đoạn lão hóa. Đồng thời, sự có mặt với số lƣợng lớn của protein MYCN trong các dòng tế bào nguyên bào thần kinh có có thể làm chậm sự phát triển hoặc giảm quá trình biệt hóa [25]. Mặc dù sự khuếch đại genMYCN đã đƣợc khẳng định trong bệnh u nguyên bào thần kinh với tiên lƣợng xấu, protein MYCN có vai trò khuếch đại trong khối u hay không vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Một số các dòng tế bào u nguyên bào thần kinh có biểu hiện mức độ cao với protein MYCN mà không có khuếch đại gen.Điều này có thể do sự thay đổi trong chu trình suy thoái protein hơn là trong quá trình tự điều hòa dịch mã gene MYCN. Ở giai đoạn đầu, sự biểu hiện của protein MYCN có thể đƣợc tìm thấy ở tất cả các giai đoạn của bệnh. Điều này đƣợc cho rằng sự biểu hiện của MYCN không liên quan đến kiểu hình lâm sàng. Tuy nhiên, trong nhóm các khối u không có sự khuếch đại genMYCN, một số nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện protein MYCN có liên quan tới khả năng sống sót; trong khi đó, một số nghiên cứu khác lại không thấy sự liên quan nào. Trong tƣơng lai, với các nghiên cứu lớn hơn về việc điều trị bệnh nhân với các phƣơng pháp tiêu chuẩn là cần thiết để tìm hiểu về mức độ biểu hiện protein MYCN có liên quan đến tiên lƣợng tiến triển các khổi u khi thiếu sự khuếch đại genMYCN[25] Các nghiên cứu đầu tiên về u nguyên bào thần kinh cho thấy các tế bào u nguyên bào thần kinh đều có các mảnh nhỏ chất nhiễm sắc kép (double-minute chromatin bodies (DM)) cũng nhƣ các vùng bắt màu đồng nhất (homogeneously staining regions (HSR)) trên các nhiễm sắc thể lớn. Về sau, những bất thƣờng nhiễm sắc thể này đều đƣợc khẳng định là biểu hiện về mặt di truyền tế bào của một sự khuếch đại, gen MYCN. Tuy nhiên, sự khuếch đại MYCN thƣờng đƣợc tìm thấy ở ngoài vị trí này: hoặc trong vùng HSR của nhiễm sắc thể khác, hoặc trong DM ngoài nhiễm sắc thể, hoặc cả hai. 15