Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của loài gai ma vương (Tribulus terrestris L.) ở vùng đất cát tỉnh Bình Thuận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC<br /> <br /> HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION<br /> <br /> JOURNAL OF SCIENCE<br /> <br /> KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ<br /> ISSN:<br /> 1859-3100 Tập 15, Số 6 (2018): 118-129<br /> <br /> NATURAL SCIENCES AND TECHNOLOGY<br /> Vol. 15, No. 6 (2018): 118-129<br /> Email: tapchikhoahoc@hcmue.edu.vn; Website: http://tckh.hcmue.edu.vn<br /> <br /> NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA LOÀI GAI MA VƯƠNG<br /> (Tribulus terrestris L.) Ở VÙNG ĐẤT CÁT TỈNH BÌNH THUẬN<br /> Nguyễn Thị Thanh Tâm*, Trần Huỳnh Bảo Nam, Phạm Văn Ngọt<br /> Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh<br /> Ngày nhận bài: 18-4-2018; ngày nhận bài sửa: 05-6-2018; ngày duyệt đăng: 19-6-2018<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao ethanol toàn cây Gai ma vương tại tất cả các nồng độ<br /> khảo sát từ 200 đến 1000 mg/ml đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên cả ba chủng: Bacillus<br /> subtilis, Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa. Hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol thể<br /> hiện mạnh nhất trên chủng B. subtilis. Trong khi đó, nước sắc toàn cây của loài chỉ thể hiện hoạt<br /> tính kháng khuẩn đối với chủng B. subtilis và chỉ với nồng độ cao hơn 40%.<br /> Từ khóa: đặc tính kháng khuẩn, Gai ma vương, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa,<br /> Escherichia coli.<br /> ABSTRACT<br /> Antibacterial activity of Tribulus terrestris L. living on sands of Binh Thuan province<br /> The results of this study showed that ethanol extract of Tribulus terrestris L. at any<br /> concentration from 200 to 1.000 mg/ml possessed an anti-bacterial activity against all three<br /> bacteria including Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, and Escherichia coli. The ethanol<br /> extract was more effective on B. subtilis than the other two strains. However, aqueous extract of<br /> Tribulus terrestris L. showed anti-bacterial activity against B. subtilis only and just at the<br /> concentration of over 40%.<br /> Từ khóa: Antibacterial activity, Tribulus terrestris L., Bacillus subtilis, Pseudomonas<br /> aeruginosa, Escherichia coli.<br /> <br /> Mở đầu<br /> Trong nền y học cổ truyền của nhiều nước châu Á, loài cây Gai ma vương (Tribulus<br /> terrestris L.) được biết đến như một phương thuốc hiệu quả dùng để chữa các bệnh về phổi,<br /> tim mạch; giúp hạ huyết áp, điều hòa miễn dịch, tăng cường hấp thu, kháng viêm, kháng ung<br /> thư. Đặc biệt, loài thực vật này có tác dụng lớn trong việc cải thiện chức năng sinh lí sinh sản<br /> ở nam giới cũng như chữa một số chứng bệnh liên quan đến hệ sinh sản nữ [1].<br /> Do những đặc tính dược liệu quý giá, ngày càng nhiều công trình đã chọn loài Gai<br /> ma vương làm đối tượng nghiên cứu. Tuy nhiên, tại Việt Nam, những nghiên cứu về loài<br /> cây này còn rất ít, thường tập trung vào việc chọn lọc giống để ứng dụng trồng đại trà<br /> nhằm thu hợp chất saponin steroid mà thiếu đi đánh giá về dược tính của loài. Kết quả<br /> 1.<br /> <br /> *<br /> <br /> Email: tamntth@hcmup.edu.vn<br /> <br /> 118<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM<br /> <br /> Nguyễn Thị Thanh Tâm và tgk<br /> <br /> nghiên cứu của bài báo “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của loài Gai ma vương<br /> (Tribulus terrestris L.) ở vùng đất cát tỉnh Bình Thuận” nhằm mục đích đánh giá hoạt tính<br /> kháng vi sinh vật của loài Gai ma vương trên ba chủng vi sinh vật phổ biến, có tỉ lệ kháng<br /> thuốc cao, gây bệnh ngoài da, hô hấp, gây viêm nhiễm mô mềm, gây các bệnh và các<br /> chứng ngộ độc qua đường thực phẩm như: Bacillus subtilis, Escherichia coli,<br /> Pseudomonas aeruginosa, từ đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về dược tính của<br /> loài dược liệu quý này [2],[3].<br /> 2.<br /> Địa điểm, đối tượng và phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Địa điểm thu mẫu<br /> Xã Tiến Thành, thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận.<br /> 2.2. Đối tượng nghiên cứu<br /> Đối tượng nghiên cứu: loài Gai ma vương (Tribulus terrestris L.).<br /> Mẫu dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cao ethanol và nước sắc toàn cây.<br /> Những chủng vi sinh vật được dùng để khảo sát tính kháng khuẩn bao gồm:<br /> + Vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí<br /> Minh, lưu trữ ở Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư<br /> phạm TP Hồ Chí Minh được cấy truyền và thử nghiệm trên môi trường MPA.<br /> + Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh<br /> học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TPHCM được cấy truyền và thử<br /> nghiệm trên môi trường NA.<br /> 2.3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.3.1. Phương pháp thu hái, sơ chế, bảo quản mẫu<br /> Mẫu cây được thu đầy đủ các bộ phận và được phơi dưới nắng 1 ngày trước khi cho<br /> vào bao chứa và đem về phòng thí nghiệm.<br /> Tại phòng thí nghiệm, mẫu cây được tách riêng quả và phần còn lại (bao gồm thân,<br /> lá, rễ – gọi chung là phần toàn cây). Phần toàn cây được cắt nhỏ thành các đoạn dài từ 2 –<br /> 5 cm, được rửa sạch đất cát và phơi nắng trong 2 – 3 ngày.<br /> Mẫu sau khi phơi nắng được gói bằng giấy báo và được sấy ở nhiệt độ từ 50 đến<br /> o<br /> 60 C cho đến khi khối lượng không đổi. Lúc này, mẫu đạt trạng thái khô hoàn toàn.<br /> Mẫu khi đã khô hoàn toàn được bảo quản trong điều kiện khô thoáng ở phòng thí<br /> nghiệm cho những thử nghiệm tiếp theo.<br /> 2.3.2. Phương pháp điều chế cao ethanol<br /> Quy trình tạo cao ethanol được tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Kim Phi<br /> Phụng [4].<br /> Mẫu cây sau khi phơi khô sẽ được đem xay thành bột mịn.<br /> Ngâm 100 g bột cây trong 1000 ml dung dịch ethanol 96o.<br /> Sau 48 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc để loại cặn.<br /> <br /> 119<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM<br /> <br /> Tập 15, Số 6 (2018): 118-129<br /> <br /> Dịch chiết được thu hồi dung môi bằng hệ thống cô quay ở nhiệt độ 50oC và áp suất<br /> 175mbar.<br /> Sau khi dịch chiết đã đuổi gần hết dung môi, rót dịch chiết ra một cốc thủy tinh và để<br /> bay hơi tự nhiên.<br /> Khi dung môi đã bay hơi hoàn toàn, ta thu được cao chiết ethanol thô. Cao được bảo<br /> quản trong tối và nhiệt độ thấp (4oC).<br /> Phần bột cây còn lại tiếp tục được ngâm trong dung dịch ethanol 96o với cùng tỉ lệ<br /> như trên. Quá trình chiết lặp lại 3 lần để đảm bảo quá trình diễn ra triệt để [4].<br /> 2.3.3. Phương pháp thu nhận nước sắc<br /> Quy trình thu nhận nước sắc được tiến hành theo Hồ Huỳnh Thùy Dương [5].<br /> Ngâm 10 g mẫu khô trong nước cất 10 – 15 phút để rửa mẫu, sau đó bỏ nước ngâm.<br /> Thêm 300 ml nước cất và đun sôi mẫu.<br /> Khi mẫu đã sôi, tiếp tục đun mẫu ở nhiệt độ từ 70 đến 80oC trong 90 phút. Sau đó,<br /> thu lấy nước sắc.<br /> Thêm 200 ml nước cất và đun sôi mẫu lần thứ hai.<br /> Khi mẫu đã sôi, mẫu tiếp tục được đun ở nhiệt độ từ 70 đến 80oC trong 90 phút. Sau<br /> đó thu lấy nước sắc lần thứ hai.<br /> Trộn nước sắc của 2 lần đun lại rồi đem ủ ở nhiệt độ từ 50 đến 60oC để nước bay hơi<br /> sao cho dung dịch nước sắc thu được còn đúng 10 ml.<br /> Dung dịch nước sắc được li tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 10 phút để loại cặn.<br /> Nước sắc được thu nhận tương ứng với tỉ lệ 1 g/ml.<br /> Nước sắc sử dụng trong các thử nghiệm được pha loãng đến nồng độ nhất định, sau<br /> đó lọc qua màng lọc vô trùng 0,22 µm và được sử dụng trong ngày [5].<br /> 2.3.4. Phương pháp lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào<br /> Để so sánh hoạt tính kháng khuẩn của mẫu thử trên những chủng vi sinh vật khác<br /> nhau, mỗi chủng vi sinh vật cần được sử dụng ở cùng một mật độ tế bào tương đương<br /> 5.106 CFU/ml. Do đó, trước khi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, mỗi loại vi khuẩn cần<br /> được xác định giá trị OD tại bước sóng 610 nm tương ứng với nồng độ vi khuẩn 5.106<br /> CFU/ml. Để xác định được giá trị OD này, ta cần xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa<br /> độ đục và mật độ tế bào theo quy trình sau:<br /> Pha loãng một huyền phù chứa chủng vi sinh vật cần kiểm nghiệm có mật độ bất kì<br /> thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD 610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2;<br /> 0,3; 0,4; 0,5. Đo OD 610nm của các huyền phù vừa pha, ghi nhận số đo thực tế.<br /> Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc, xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này.<br /> Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi độ đục. Xác<br /> định phương trình hồi quy tuyến tính giữa log(N/ml) và OD 610nm [6].<br /> Dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính giữa mật độ tế bào và giá trị OD 610nm, ta<br /> xác định được giá trị OD 610nm tương ứng với mật độ tế bào đạt 5.106 CFU/ml.<br /> 120<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM<br /> <br /> Nguyễn Thị Thanh Tâm và tgk<br /> <br /> 2.3.5. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn<br /> Cao ethanol được hòa tan trong dung dịch ethanol 70o với nồng độ 1000 mg/ml. Tiếp<br /> tục dùng dung dịch trên pha loãng ra các nồng độ 800 mg/ml, 600 mg/ml, 400 mg/ml, 200<br /> mg/ml. Chứng âm dùng cho thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết<br /> ethanol là dung dịch ethanol 35o tương ứng với nồng độ 0 mg/ml. Chứng dương là đĩa giấy<br /> kháng sinh đồ tẩm Streptomycin 10 µg (đối với vi khuẩn Gram dương: B. subtilis) hoặc<br /> Tetracyclin 30 µg (đối với vi khuẩn Gram âm: E.coli và P. aeruginosa). Mỗi nghiệm thức<br /> được lặp lại 3 lần.<br /> Nước sắc toàn cây Gai ma vương được cô đặc về nồng độ 1 g/ml tương ứng với nồng<br /> độ 100% sau đó được pha loãng thành các nồng độ 80%, 60%, 40%, 20%. Chứng âm dùng<br /> cho thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn của nước sắc toàn cây là nước cất vô trùng<br /> tương ứng với nồng độ 0%. Chứng dương là đĩa giấy kháng sinh đồ tẩm Streptomycin<br /> 10µg (đối với vi khuẩn Gram dương: B. subtilis) hoặc Tetracyclin 30 µg (đối với vi khuẩn<br /> Gram âm: E.coli và P. aeruginosa). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.<br /> Vi khuẩn được lấy ra từ ống nghiệm giống sau đó hòa tan vào trong nước cất vô<br /> trùng tạo thành dịch huyền phù. Dịch huyền phù được pha loãng tới giá trị OD 610nm<br /> tương ứng với mật độ tế bào 5.106 CFU/ml.<br /> Rút 0,02 ml dịch huyền phù vi khuẩn cho vào mỗi đĩa Petri đã có môi trường nuôi<br /> cấy thích hợp (tương ứng 100.000 tế bào vi khuẩn trong 1 đĩa Petri). Dịch huyền phù được<br /> trang đều trên bề mặt thạch đến khi bề mặt trở nên không còn dính ướt. Sau đó, một giếng<br /> có đường kính d = 6 mm được khoan trên lớp thạch. Mỗi giếng được nhỏ 0,1 ml dung dịch<br /> thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.<br /> Đĩa Petri sau khi đã được nhỏ thuốc thử được gói giấy báo và giữ lạnh ở 4oC từ 4 – 8<br /> giờ để thuốc thử được khuếch tán vào lớp thạch. Sau đó, đĩa Petri được đặt ở nhiệt độ<br /> phòng từ 8 – 12 giờ [7].<br /> Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng việc có hay không có vòng vô khuẩn quanh các<br /> giếng. Nếu có vòng vô khuẩn, đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng cách lấy đường<br /> kính vòng vô khuẩn (D) có thể đo được trên đĩa Petri trừ đi đường kính của giếng (d).<br /> Hoạt tính kháng khuẩn của mẫu thử tại các nồng độ được đánh giá bằng đường kính<br /> vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn trong Bảng 1 cũng như so sánh với đường kính vòng vô<br /> khuẩn ở đối chứng dương.<br /> Bảng 1. Bảng đánh giá hoạt tính kháng khuẩn dựa trên giá trị đường kính vòng vô khuẩn<br /> Đường kính vòng vô khuẩn<br /> ≥ 15 mm<br /> 10 – 14 mm<br /> ≤ 9 mm<br /> Không cho vòng vô khuẩn<br /> <br /> Hoạt tính kháng khuẩn<br /> Mạnh<br /> Trung bình<br /> Yếu<br /> Không tác động<br /> <br /> 121<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC - Trường ĐHSP TPHCM<br /> <br /> Tập 15, Số 6 (2018): 118-129<br /> <br /> 2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu<br /> Phần mềm Microsoft Excel 2013 được sử dụng để xây dựng phương trình hồi quy<br /> tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào vi khuẩn. Phương trình hồi quy được chấp nhận<br /> khi P value < 0,05 và hệ số tương quan R2 > 90%.<br /> Phần mềm Statistical Package for the Social Sciences 20 được sử dụng để tính giá trị<br /> trung bình và độ lệch chuẩn đường kính vòng vô khuẩn ở các nghiệm thức cũng như so<br /> sánh giá trị trung bình đường kính vòng vô khuẩn giữa các nồng độ mẫu thử và giữa các<br /> chủng vi khuẩn bằng hàm ANOVA một yếu tố ở độ tin cậy 95%.<br /> 3.<br /> Kết quả nghiên cứu<br /> 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol toàn cây Gai ma vương<br /> Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol toàn cây Gai ma vương ở<br /> các nồng độ từ 0 đến 1.000 mg/ml được thể hiện qua Bảng 2 và Hình 1.<br /> Bảng 2. Giá trị đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol toàn cây Gai ma vương<br /> ở các nồng độ trên 3 chủng vi sinh vật thử nghiệm<br /> Nồng độ cao ethanol<br /> (mg/ml)<br /> 1.000<br /> 800<br /> 600<br /> 400<br /> 200<br /> 0<br /> Streptomycin 10 µg<br /> Tetracyclin 30 µg<br /> <br /> Giá trị đường kính vòng vô khuẩn (mm)<br /> B. subtilis<br /> E. coli<br /> P. aeruginosa<br /> 0,509e3<br /> 0,334d2<br /> 1,018c2<br /> 1,072b2<br /> 0,882a3<br /> <br /> 22,556<br /> 19,667<br /> 17,778<br /> 14,222<br /> 11,000<br /> 9,867<br /> <br /> 19,667 0,882e2<br /> 18,889 0,839e2<br /> 16,222 0,839d2<br /> 12,333 1,202c2<br /> 7,667 0,882b2<br /> -<br /> <br /> 11,889 0,509c1<br /> 10,111 0,192b1<br /> 10,111 1,071b1<br /> 6,111 0,509a1<br /> 5,556 0,193a1<br /> -<br /> <br /> 0,897a<br /> 2,567<br /> <br /> 0,636a1<br /> <br /> 11,444<br /> <br /> 0,096c2<br /> <br /> (-): không xuất hiện vòng vô khuẩn<br /> a, b, c, d, e: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo hàng dọc<br /> 1, 2, 3: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo hàng ngang<br /> <br /> Cao ethanol toàn cây Gai ma vương có hoạt tính kháng cả 3 chủng vi sinh vật thử<br /> nghiệm ở tất cả các nồng độ từ 200 đến 1000 mg/ml. Đối với chủng B. subtilis, có sự khác<br /> nhau có ý nghĩa thống kê về đường kính vòng vô khuẩn giữa các nồng độ mẫu thử. Trong<br /> khi đó, đối với E. coli, đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết ở nồng độ 1000 và<br /> 800mg/ml không có sự khác biệt. Đối với P. aeruginosa, đường kính vòng vô khuẩn của<br /> các cặp nồng độ cao ethanol 800 và 600 mg/ml, 400 và 200 mg/ml cũng không có sự khác<br /> biệt có ý nghĩa thống kê.<br /> <br /> 122<br /> <br />