Nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic từ ruột tôm sú (Penaeus monodon) làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm probiotic trong nước

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 4/2014<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ RUỘT TÔM SÚ<br /> (PENAEUS MONODON) LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT<br /> CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRONG NƯỚC<br /> STUDY ON ISOLATION PROBIOTIC BACTERIA FROM TIGER SHRIMP GUT (PENAEUS MONODON)<br /> AS A SOURCE OF DOMESTIC MATERIAL FOR PROBIOTIC PRODUCTS<br /> Phạm Thị Hiền Hòa1, Nguyễn Hữu Dũng2<br /> Ngày nhận bài: 08/11/2013; Ngày phản biện thông qua: 09/8/2014; Ngày duyệt đăng: 01/12/2014<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu nhóm vi khuẩn có đặc tính probiotic đang là một xu hướng mới trong những năm gần đây. Nhóm vi khuẩn<br /> probiotic có nhiều đặc tính ưu việt, trong đó phải kể đến khả năng ức chế một số loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật<br /> thủy sản. Các loài vi khuẩn probiotic phân lập được là nguồn nguyên liệu đầu tiên để có thể sản xuất chế phẩm probiotic.<br /> Bài báo này trình bày kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú (Penaeus monodon ) và kết quả nghiên cứu đặc tính<br /> probiotic của chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả định danh bằng kỹ thuật 16S rDNA cho thấy chủng vi khuẩn phân lập<br /> được là Pseudomonas stutzeri. Loài vi khuẩn này thể hiện được đặc tính cô lập, sản sinh hoạt chất kháng khuẩn và ức chế<br /> sinh trưởng 02 chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật thủy sản V. alginolyticus và V. parahaemolyticus.<br /> Từ khóa: Phân lập, vi khuẩn, probiotic, ruột tôm sú, Pseudomonas stutzeri, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus<br /> <br /> ABSTRACT<br /> Study on probiotic bacteria is a new trend in recent years. The probiotic bacteria has many advanced properties,<br /> especially some characteristics on colonization, producing bactericidal substance and growth inhibition on pathogenic<br /> bacteria. Probiotic bacteria isolated will be a initial material for production of probiotic products.<br /> This article showed the result of isolation probiotic bacteria strain from tiger shrimp gut (Penaeus monodon) and<br /> probiotic properties of isolated bacteria strain. Result from 16S rDNA identification revealed that the isolated bacteria<br /> was Pseudomonas stutzeri. This strain could produce bactericidal substance, colonize and inhibit the growth of pathogen<br /> bacteria V. alginolyticus and V. parahaemolyticus.<br /> Keywords: Isolation, bacteria, probiotic, Pseudomonas stutzeri, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Với tiềm năng mặt nước rất phong phú và<br /> đa dạng, các hình thức và thủy vực nuôi trên cả<br /> nước được chia thành nuôi nước ngọt (nuôi ao,<br /> nuôi lồng), nuôi ven biển (nuôi ao, đầm, lồng), đem<br /> lại nhiều cơ hội cho phát triển về nuôi biển, nuôi<br /> nước lợ và nuôi nước ngọt trên khắp mọi miền<br /> đất nước. Hiện nay, tổng số loài nuôi nước ngọt là<br /> 544 loài, nuôi nước lợ và mặn là 186 loài. Trong đó,<br /> đối tượng nuôi chủ lực là tôm với diện tích 580.465ha.<br /> Gần đây, mô hình nuôi cá tra ao đã đạt đến diện tích<br /> trên dưới 6.000ha, với sản lượng xuất khẩu đạt gần<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> ThS. Phạm Thị Hiền Hòa: Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng<br /> TS. Nguyễn Hữu Dũng: Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> 40 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> 600.000 tấn trong năm 2008 (gấp 3 lần sản lượng<br /> tôm xuất khẩu.<br /> Mật độ giống thả tăng cao trong mô hình nuôi<br /> thâm canh/công nghiệp sẽ dẫn đến môi trường bị ô<br /> nhiễm và chất lượng môi trường trở nên khó kiểm<br /> soát, vật nuôi dễ bị rơi vào trạng thái “stress”, các<br /> vấn đề liên quan đến bệnh và sự suy giảm chất<br /> lượng môi trường thường xuyên xảy ra, trong đó có<br /> vấn đề phát sinh dịch bệnh.<br /> Sử dụng kháng sinh trong giai đoạn sản xuất<br /> giống hoặc nuôi thương phẩm đều ảnh hưởng trực<br /> tiếp đến sinh vật, như làm cho ấu trùng chậm lớn,<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> các giai đoạn biến thái xảy ra không đều, dẫn đến<br /> tỷ lệ sống của ấu trùng thấp, tích lũy kháng sinh vào<br /> trong thịt. Xu hướng mới hiện nay được áp dụng<br /> với nhiều đối tượng nuôi biển là sử dụng chế phẩm<br /> probiotic gồm các nhóm vi khuẩn có ích, giúp hạn<br /> chế khả năng bị vi khuẩn gây bệnh xâm nhiễm và<br /> cải thiện chất lượng môi trường nước. Yasuda và<br /> Taga (1980) chỉ ra rằng vi khuẩn không chỉ hữu hiệu<br /> cho thực phẩm mà còn là chất ức chế vi khuẩn gây<br /> bệnh trên cá và là chất hoạt hóa quá trình tái tạo<br /> dinh dưỡng.<br /> Xu hướng nghiên cứu phân lập một số vi khuẩn<br /> có tiềm năng sử dụng là nhóm vi khuẩn hữu ích<br /> (probiotic trong NTTS đang là một hướng nghiên cứu<br /> mới, được phát triển ở thế giới từ những năm 1990.<br /> Ở Việt Nam, mặc dù nghề NTTS đã phát triển từ khá<br /> lâu nhưng hướng nghiên cứu này còn rất mới mẻ,<br /> chưa có nhiều nghiên cứu lựa chọn các chủng vi<br /> khuẩn từ vùng nuôi để dùng làm chế phẩm probiotic<br /> phù hợp với điều kiện thực tiễn NTTS Việt Nam.<br /> II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu<br /> Mẫu tôm sú (Penaeus monodon) (5 con/mẫu,<br /> khối lượng 25 ÷ 30g/con) và mẫu bùn (0,5kg/mẫu)<br /> được thu ở đầm nuôi tôm tại khu vực Quý Kim phường Hải Thành - quận Dương Kinh - thành phố<br /> Hải Phòng. Các chủng vi khuẩn được phân lập<br /> trong trong mẫu ruột tôm sú và mẫu bùn được sử<br /> dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.<br /> 2. Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn<br /> a. Môi trường phân lập và nuôi cấy bao gồm môi<br /> trường NA (Nutrient agar), NB (Nutrient broth) có bổ<br /> sung thêm 1,5% NaCl (w/v).<br /> b. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Vibrio alginolyticus<br /> và V. parahaemolyticus: môi trường TCBS<br /> (Thiosulphate citrate Bilesalt Sucroza agar), môi<br /> trường LB (Luria Bertani broth) (hai chủng vi khuẩn<br /> gây bệnh do Trung tâm nghiên cứu môi trường và<br /> dịch bệnh - Viện Nghiên cứu NTTS 1 cung cấp).<br /> 3. Phương pháp thu mẫu<br /> - Các mẫu tôm sú và bùn được lấy ngẫu nhiên<br /> trong đầm nuôi tôm sú vào lúc sáng sớm, lưu giữ<br /> trong tú PE vô trùng và đưa về phòng thí nghiệm<br /> ngay sau khi thu mẫu.<br /> 4. Phương pháp xử lý mẫu<br /> - Mẫu tôm được rửa sạch bằng dung dịch NaCl<br /> 1,5%, dùng dao chuyên dụng mổ lấy ống tiêu hóa (ruột<br /> và dạ dày). Ống tiêu hóa được nghiền nát bằng chày<br /> <br /> Số 4/2014<br /> và cối sứ, sau đó hòa vào 5ml dung dịch NaCl<br /> 1,5%, sốc nhiệt bằng cách ủ trong bể nước nóng<br /> 800C trong 20 phút, sau đó ngâm ngay vào nước<br /> lạnh (nước máy). Sử dụng dịch huyền phù này để<br /> phân lập vi khuẩn.<br /> - Mẫu bùn được pha vào dung dịch NaCl 1,5%.<br /> Sử dụng dịch huyền phù này để phân lập vi khuẩn.<br /> 5. Phương pháp phân lập, chọn lọc, tinh sạch và<br /> giữ giống vi khuẩn<br /> Vi<br /> khuẩn<br /> Vibrio<br /> alginolyticus<br /> và<br /> V. parahaemolyticus được nuôi cấy riêng rẽ trong<br /> môi trường TCBS ở nhiệt độ 28 - 300C trong 24h.<br /> - Các chủng vi sinh vật phân lập được từ mẫu<br /> tôm và mẫu bùn được cấy chuyển sang ống thạch<br /> nghiêng bằng cách cấy ria, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ<br /> 300C trong 24h, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40C,<br /> được lưu giống bằng dung dịch Glycerol 20% ở<br /> nhiệt độ -800C.<br /> 6. Thí nghiệm xác định đặc tính lấn át chủng vi<br /> khuẩn gây bệnh<br /> + Cô lập chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus<br /> và V. parahaemolyticus, đồng nuôi cấy trong nước<br /> biển: thực hiện theo phương pháp của Lemos et al.,<br /> và Purivirojkul et al., thí nghiệm được lặp lại 3 lần.<br /> 7. Phân loại và định danh vi khuẩn<br /> + Phương pháp nhuộm gram (Nguyễn Lân<br /> Dũng, 1983).<br /> + Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh<br /> hóa (Nguyễn Lân Dũng, 1983).<br /> + Phương pháp định danh vi khuẩn dựa trên<br /> gen 16 S rDNA. Kết quả các thí nghiệm được xử<br /> lý bằng phần mềm Excel 2003, phần mềm BLAST,<br /> CLUSTAL X (1,81), MEGA 4.2.<br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Phân lập và lựa chọn một số chủng vi khuẩn<br /> probiotic từ ruột tôm sú và bùn đáy đầm nuôi<br /> tôm sú tại Hải Phòng<br /> Từ mẫu bùn đáy ao nuôi và ruột tôm sú thu tại<br /> Quý Kim đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn trên<br /> môi trường NA sau khi nuôi cấy từ 2 đến 5 ngày.<br /> Sau khi phân lập được các chủng trên, tiến<br /> hành thử hoạt tính sinh catalase thu được 8 chủng<br /> có phản ứng dương tính. Các chủng vi khuẩn phân<br /> lập được từ mẫu tôm và mẫu bùn đều cho kết quả<br /> dương tính với catalase, trong đó mẫu QKR2 là<br /> mẫu từ ruột tôm cho thấy hoạt tính mạnh nhất và<br /> khả năng phát triển tốt nhất. Do đó, các nghiên cứu<br /> tiếp theo nhằm kiểm tra hoạt tính probiotic được tập<br /> trung tiến hành đối với chủng QKR2.<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 41<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 4/2014<br /> ghi nhận được sự có mặt của nhóm vi khuẩn thuộc<br /> chi Bacillus là cao nhất.<br /> <br /> Hình 1. Chọn lọc chủng vi khuẩn probiotic<br /> bằng phản ứng catalase<br /> Wiangyos et al., nghiên cứu về đa dạng vi<br /> khuẩn phân lập ở bùn đáy ao nuôi tôm sú từ tháng 9<br /> đến tháng 10 ở đầm nuôi tôm của Thái Lan cũng đã<br /> <br /> 2. Khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn phân<br /> lập với vi khuẩn gây bệnh tôm sú Vibrio spp<br /> * Cô lập vi khuẩn V.<br /> alginolyticus và<br /> V. parahaemolyticus<br /> Khả năng cô lập V. alginolyticus và<br /> V. parahaemolyticus của chủng vi khuẩn QKR2<br /> phân lập từ ruột tôm sú nuôi ở Quý Kim được thể<br /> hiện ở các hình 2 và 3. Khi nuôi cấy chung với<br /> V. parahaemolyticus trên môi trường NA có bổ<br /> sung 1,5% NaCl sau 24h vi khuẩn QKR2 đã bắt<br /> đầu phát triển mạnh bao vây toàn bộ vi khuẩn<br /> V. parahaemolyticus (hình 2B). Sau 48h, đường cấy<br /> vi khuẩn V. parahaemolyticus tại vị trí giao nhau của 2<br /> đường cấy chỉ còn là một vệt trắng mờ và bị vi khuẩn<br /> QKR2 mọc trùm lên trên (hình 2C). Hiện tượng tương<br /> tự cũng được quan sát thấy khi nuôi cấy chung chùng<br /> phân lập QKR2 với vi khuẩn V. alginolyticus trên môi<br /> trường NA bổ sung 1,5% NaCl (hình 3B, 3C).<br /> <br /> Hình 2. Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V. parahaemolyticus (đường cấy ngang)<br /> với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A),<br /> sau 24h (B) và sau 48h (C)<br /> <br /> Hình 3. Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V. alginolyticus (đường cấy ngang)<br /> với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A), sau 24h (B)<br /> và sau 48h (C)<br /> <br /> Một số nghiên cứu cũng đã ghi nhận được<br /> khả năng cô lập vi khuẩn Vibrio spp của vi khuẩn<br /> Bacillus spp. Purivirojkul et al., đã thông báo kết quả<br /> nghiên cứu về khả năng cô lập chủng V. harveyi của<br /> chủng B. pumilus, sau 12h và 24h nuôi cấy. Chủng<br /> B. pumilus được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus<br /> monodon) từ trang trại nuôi tôm ở tỉnh<br /> Chachoengsao (Thái Lan).<br /> * Ức chế sự phát triển của vi khuẩn V. alginolyticus<br /> và V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng<br /> <br /> 42 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Chủng vi khuẩn đối chứng được nuôi cấy riêng<br /> rẽ trong môi trường nước biển đều có khả năng phát<br /> triển tốt dù môi trường rất nghèo về dinh dưỡng.<br /> TCBS là môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn Vibrio<br /> spp nên có thể sử dụng làm môi trường kiểm tra sự<br /> phát triển của vi khuẩn Vibrio spp trong thí nghiệm<br /> này. Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy chủng vi<br /> khuẩn phân lập với vi khuẩn Vibrio spp cho thấy<br /> 3 chủng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng<br /> lấn át được sự phát triển của chủng Vibrio spp<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> sau 96h nuôi cấy trong môi trường nước biển<br /> (20ppt) (bảng 1, hình 4).<br /> So sánh với kết quả nghiên cứu của Purivirojkul<br /> và cs., về khả năng lấn át sự sinh trưởng của<br /> chủng Bacillus W120 và Bacillus W1106 với chủng<br /> V. harveyi sau 120h nuôi cấy trong môi trường nước<br /> biển 20 ppt cũng cho kết quả tương tự.<br /> <br /> Hình 4. Số lượng khuẩn lạc V. alginolyticus và<br /> V. parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy<br /> với chủng QKR2 theo thời gian<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả ức chế chủng vi khuẩn<br /> Vibrio spp của chủng vi khuẩn QKR2 (theo tỷ lệ %)<br /> Tên chủng<br /> <br /> V. alginolyticus<br /> <br /> V. parahaemolyticus<br /> <br /> QKR2<br /> <br /> 28,5%<br /> <br /> 45%<br /> <br /> Mặc dù kết quả thí nghiệm cho thấy có sự lấn<br /> át về sinh trưởng của chủng vi khuẩn phân lập với<br /> chủng Vibrio spp nhưng đây cũng chỉ là những<br /> nghiên cứu ban đầu do quy mô thí nghiệm rất nhỏ<br /> <br /> Số 4/2014<br /> (10ml), mật độ chủng vi khuẩn gây bệnh thủy sản<br /> còn cao. Nghiên cứu của Sudthongkong cho biết<br /> số lượng vi khuẩn phát sáng ở khu vực ven biển<br /> trong khoảng 0,7x101 đến 7,3 x 101 CFU/ml. Trong<br /> ao nuôi cá, theo nghiên cứu của Al-Harbi cho thấy,<br /> mật độ vi khuẩn tổng số từ 1,8 ± 0,9 x 102 đến<br /> 6,0 ± 1,2 x 104. Tuy nhiên, trong thí nghiệm đồng<br /> nuôi cấy của tác giả Purivirojkul và cs, chủng vi<br /> khuẩn gây bệnh được thử nghiệm với mật độ cao<br /> (106tb/ml) nên kết quả về khả năng ức chế vi khuẩn<br /> gây bệnh của chủng phân lập được có thể chưa<br /> thực sự có ý nghĩa. Từ kết quả nghiên cứu về sự lấn<br /> át của các chủng Bacillus spp với V. harveyi trong<br /> thí nghiệm đồng nuôi cấy, Seel-audom et al., cho<br /> rằng có tiềm năng ứng dụng các chủng Bacillus spp<br /> như là chủng vi khuẩn probiotic trong nuôi tôm he<br /> chân trắng (L. vannamei) (mật độ của V. harveyi ban<br /> đầu là 105 CFU/ml).<br /> Như vậy, từ các kết quả thí nghiệm về khả<br /> năng đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh thủy<br /> sản V. alginolyticus và V. parahaemolyticus của<br /> chủng QKR2 cho thấy chủng vi khuẩn phân lập<br /> được có tiềm năng ứng dụng là nhóm vi khuẩn<br /> probiotic trong NTTS.<br /> 4. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái<br /> vi khuẩn phân lập<br /> Kết quả quan sát hình thái và nhuộm Gram<br /> chủng vi khuẩn QKR2 và một số đặc điểm sinh hóa<br /> được thể hiện ở bảng 2 và các hình 5 A, 5B.<br /> <br /> Hình 5. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKR2<br /> <br /> Bảng 2. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn QKR2<br /> Các đặc điểm sinh hóa, sinh lý và hình thái tế bào<br /> <br /> Catalase<br /> Oxidaza<br /> Gram<br /> Di động<br /> Màu sắc khuẩn lạc<br /> Hình thái tế bào<br /> Kích thước tế bào<br /> Hô hấp hiếu khí<br /> Sinh trưởng ở độ muối (% NaCl)<br /> Sinh trưởng ở nhiệt độ (0C)<br /> Sinh trưởng ở khoảng pH<br /> <br /> QKR2<br /> <br /> +<br /> +<br /> +<br /> Trắng đục<br /> Hình que<br /> 3,3 - 0,4 x 1,2 - 1,8µm<br /> +<br /> 0÷5<br /> 15 ÷ 45<br /> 5 ÷ 9,5<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 43<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 4/2014<br /> <br /> 5. Phân tích trình tự gen 16S rDNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn phân lập<br /> Phân tích trình tự gen và so sánh với các dữ liệu về chủng chuẩn trên ngân hàng lưu trữ quốc tế DDBJ,<br /> EMBL và GenBank cho kết quả như sau:<br /> + Trình từ gen 16S rDNA của chủng QKR2 tương đồng 99,9% với đoạn gen 16S của vi khuẩn<br /> Pseudomonas stutzeri.<br /> Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR2 (hình 7) cho thấy chỉ có 2 loài Pseudomonas trong cây chủng<br /> loại này. Chủng QKR2 nằm khác nhóm với loài Pseudomonas khác. Nhánh Pseudomonas này có họ hàng gần<br /> với một số loài thuộc chi Bacillus.<br /> <br /> Hình 6. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn phân lập trên gel agarose 1%<br /> Đường 1: Marker (1,5 Kb ladder) ; Đường 2: chủng QKR2<br /> <br /> Chủng vi khuẩn P. stutzeri được biết đến là loài<br /> vi khuẩn chuyển hóa nitrat rất có hiệu quả, khoảng<br /> 99% ở nồng độ 200 mg/L NO3- (Rezaee et al.,). Loài<br /> vi khuẩn này rất có tiềm năng ứng dụng trong xử lý<br /> môi trường cho những vùng có hàm lượng nitrat cao,<br /> trong đó có ao NTTS thâm canh. Một số nghiên cứu<br /> đã phân lập và xác định được khả năng khử nitrate<br /> của P. stutzeri trong ao nuôi cá tra (Be et al., Diep<br /> et al.,). Mặc dù chưa có ghi nhận về sự xuất hiện của<br /> <br /> P. stutzeri trong ruột tôm, tuy nhiên Bogatyrenko<br /> và cs, đã ghi nhận được sự có mặt của loài này<br /> trong hệ tiêu hóa của loài hải sâm Apostychopus<br /> japonicus tại vùng Viễn Đông (Bogatyrenko et al.,).<br /> Cũng trong nghiên cứu này, tác giả đã phát hiện ra<br /> loài P. stutzeri có khả năng tổng hợp các enzym tiêu<br /> hóa với hoạt tính cao (amylase, chondroitin sulfatase,<br /> chitinase, và alginate lyase), được nhận định là có<br /> tiềm năng sử dụng là vi khuẩn probiotic.<br /> <br /> Hình 7. Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR2 và các loài có quan hệ họ hàng gần<br /> <br /> 44 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br />