Phản ứng màu Biuret
Phản ứng màu Biuret (Biu - rê) là phản ứng dùng để
nhận biết sự có mặt của liên kết peptit trong cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ.
Trong thí nghiệm này người ta sử dụng Cu(OH)2 mới sinh trong dung dịch kiềm
để tạo phức màu tím. Ngoài ra, có một số biến thể của phản ứng này cũng đã được
mở rộng để nhận biết các hợp chất hữu cơ.
Người ta cũng sử dụng phản ứng màu Biuret để định lượng protein bằng cách đo
mật độ quang (UV-VIS) của dung dịch phức tạo thành ở bước sóng 540nm sau đó
tính toán dựa trên định luận Beer-Lambert.
Mặc dù trong phân tử của protein không có phân tử buiret ((H2N-CO-)2NH)
nhưng phép thử vẫn được đặt tên là phản ứng màu Buiret với lý do loại phản ứng
này cũng cho phép thử liên kết peptit trong phân tử buiret.
Quy trình test định tính.
Mẫu thử được xử lý bằng cách thêm một lượng dung dịch base mạnh 1% (thường
là NaOH hoặc KOH), sau đó được thêm một vài giọt dung dịch CuSO4. Nếu dung
dịch chuyển sang màu tím thì chứng minh được sự có mặt của protein (với nồng độ
có thể xác định được là khoảng 5-160mg/l).
Thuốc thử Buiret
Các thuốc thử biuret được làm bằng kali hydroxide (KOH), đồng (II) sulfat ngậm
nước cùng với tartrat natri kali. Khi thử, nếu có mặt Protein, thuốc thử chuyển từ
màu xanh sang tím. Nếu thuốc thử chuyển từ màu xanh sang màu hồng thì trong
dung dịch có sự hiện diện của các chuỗi ngắn polypeptide [?]
Không phải tất cả các xét nghiệm biuret cần dùng thuốc thử biuret. Phương pháp
thường được sử dụng trong xét nghiệm định lượng protein là phương pháp đo mật
độ quang UV-VIS tại bước sóng 540 nm (để phát hiện các ion Cu2+).
Tăng nhạy cho phép thử Buiret.
Cu+ là một tác nhân làm giảm mạnh tính nhạy của thuốc thử, tuy nhiên nó có thể
loại trừ bằng phản ứng với với Mo (VI) trong thuốc thử Folin-Ciocalteu để tạo
thành màu xanh molypden. Bằng cách này, các protein có thể được phát hiện ở
nồng độ từ 0,005 và 2 mg / mL [3]. Màu xanh Molypden có thể kết hợp với một số
thuốc nhuộm hữu cơ (malachite xanh, Auramin O), có tác dụng khuếch đại tín hiệu
trong phép đo quang. [4]
Cu+ tạo thành phức màu tím đậm với axit bicinchoninic (BCA) [5], điều này cho
phép tăng nhạy của phép thử để có thể phát hiện protein ở nống độ 0,0005 đến 2
mg / mL. Phép thử này thường được gọi với tên thương mại là "phép thử
Pierce" khi nhà sản xuất đưa ra bộ sản phẩm thử này.
Phim thí nghiệm
Trong phim thí nghiệm sau, tác giả đã thực hiện phép thử màu buiuret với lòng
trắng trứng, tuy thuốc thử dùng hơi đậm nhưng thể hiện rõ nét phản ứng màu này.
LINK PHIM THÍ NGHIỆM
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1. The reaction was first observed by Ferdinand Rose in 1833: Ferdinand Rose
(1833) "Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden" (On the
compounds of albumin with metal oxides), Poggendorfs Annalen der Physik und
Chemie, vol. 28, pages 132-142. It was independently rediscovered by Piotrowski
in 1857: G. von Piotrowski (1857) "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre
näheren Abkömmlinge" (A new reaction of proteins and their related derivatives)
Sitzungsberichte der Kaiserliche Akademie der Wissenschaften in Wien,
mathematisch-naturwissenschaftliche Classe (Proceedings of the Imperial
Academy of Philosophies in Vienna, mathematical-natural sciences section), vol.
24, pages 335-337.
2. Chemical Reagents
3. O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall: Protein Measurement
With the Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265 - 275.
4. Sargent, M.G.: Fiftyfold amplification of the Lowry protein assay. Anal.
Biochem. 163 (1987) 476-481.
5. Smith, P.K. et al.: Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal.
Biochem. 150 (1985) 76-85.