SÀNG LỌC CÁC BỆNH RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA BẨM SINH
BẰNG MSMS
I. NGUYÊN LÝ
MSMS là thiết bị sử dụng để phân tách và định lượng các ion dựa trên tỷ số
khối lượng/ điện tích của chúng (mass/charge ratio). MSMS tạo ra các phần tử tích
điện từ mẫu cần phân tích, sau đó sử dụng điện và từ trường để phân tách và đo
lường khối lượng của các phần tử tích điện. Bộ phận phát hiện sẽ tạo ra đồ thị phổ
khối của các đỉnh có thể định lượng được bằng các chuẩn nội để xác định lượng mỗi
chất có mặt trong mẫu.
MSMS gồm 2 MS nối với nhau bởi một bộ phận gọi là collision cell. Trước
khi đi vào MS thứ nhất, mẫu được ion hoá bằng fast atom bomardment hoặc
electrospray. (FAB-MS/MS hoặc ES-MS/MS). Quá trình này tạo điện tích nhưng
không phân cắt các hợp chất hữu cơ trong mẫu.
MS thứ nhất phân tách các ion gốc (parent ions) theo trình tự số khối
(mass/charge ratio) và chuyển sang bộ collision chamber.
Bộ phận collision chamber phân cắt các ion gốc chuyển các mảnh ion sang
MS thứ hai. Mẫu hình của các mảnh ion của mỗi ion gốc được phân tích và so sánh
với phổ đã biết của các chất chuẩn nội. Toàn bộ quá trình ion hoá và phân tích kết
quả mất khoảng 2 phút.
MS/MS là một công cụ hiệu quả giúp sàng lọc các rối loạn chuyển hoá acid
béo, acid amin và acid hữu cơ niệu.
Định lượng acid amin, carnitine tự do và acylcarnitine bằng NeoMass AAAC
kit đòi hỏi phải tách chiết mẫu máu thấm khô bằng dung dịch chứa nội chuẩn đồng
vị ổn định (Stable isotope labeled internal standards) và phân tích trên MSMS. Tín
hiệu của mỗi chất phân tích trong mẫu so với nội chuẩn tỷ lệ với nồng độ của chất
phân tích trong mẫu. Dữ liệu được thu nhận bằng phương pháp MRM (Multiple
Reaction Monitoring). Trong phương pháp này, sản phẩm của mỗi chất phân tích
sau khi qua bộ phận va chạm (collision cell) được đo lường. Dữ liệu được thu và sử
lý bởi phần mền cung cấp cho hệ thống.
Hệ thống MS ba tứ cực (triple quadrupole) sử dụng cho phép đo lường này
được kiểm soát bằng máy tính, phát hiện các phân tử ion hoá trong mẫu theo số khối
(m/z). Mẫu tách chiết được đưa vào bộ ion hoá bằng tia điện (electrospray
ionization- ESI) của MS nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC), bao gồm bơm mẫu tự động,
bơm, khử khí của dung môi . ESI tạo sự ion hoá nhẹ, nơi mà các ion được tạo thành
khi dung môi bay hơi. ESI tạo các phân tử proton hoá hoặc khử proton, được lựa
chọn để đưa vào máy phân tích khối để phát hiện.
Trong hệ thống MSMS, các ion được lựa chọn của các chất phân tích được
phân tách trong tứ cực thứ nhất (Q1), chuyển sang tứ cực thứ 2 (Collision cell) nơi
mà khí trơ có áp lực cao gây phân mảnh đặc hiệu. Một ion sản phẩm của mỗi chất
phân tích được lựa chọn đưa vào Q3 và phát hiện bởi đầu dò.
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện:
Người thực hiện kỹ thuật có trình độ phù hợp
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Phương tiện:
Hệ thống LCMSMS 8040 của Shimadzu
Máy đục lỗ giọt máu thấm khô DBS 100 của …
Máy lắc
Tủ hôt, máy ly tâm và các trang thiết bị PXN
- Hóa chất:
Hóa chất
Chuẩn bị
Độ bền sau khi mở/pha
loãng (ở +2° C đến +
8°C)
Mẫu kiểm tra chất lượng (QC
samples)
Sẵn sàng để sử dụng
1 tháng
Chất nội chuẩn Aminoacids
(AA)
Hòa tan/pha loãng
1 tháng
Chất nội chuẩn Acylcarnitines
(AC)
Hòa tan/pha loãng
1 tháng
Chất nội chuẩn
Succinylacetone (SUAC)
Hòa tan/pha loãng
1 tháng
Chất nội chuẩn
Argininosuccinic acid (ASA)
Hòa tan/pha loãng
1 tháng
Dung dịch chiết (Extraction
Solution)
Sẵn sàng để sử dụng
1 tháng
Dung dịch rửa giải (Elution
Solution)
Sẵn sàng để sử dụng
1 tháng
3. Ngƣời bệnh: người bệnh và người nhà người bệnh cần được giải thích về mục
đích của việc lấy máu để làm xét nghiệm.
4. Phiếu xét nghiệm:
- Phiếu xét nghiệm theo đúng quy định của Bộ Y tế và bệnh viện
- Trên phiếu xét nghiệm cần ghi đầy đủ thông tin của người bệnh: họ và tên,
tuổi, giới tính, số giường, khoa phòng, chẩn đoán, xét nghiệm cần làm.
- Trên phiếu xét nghiệm cần có: chữ ký và họ tên bác sĩ chỉ định xét nghiệm, họ
tên người lấy mẫu, thời gian chỉ định xét nghiệm và thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm.
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
Mẫu máu thấm khô (Dry blood spot).
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn nội gốc (ISTD stock solutions) (chỉ làm lần
đầu tiên sử dụng bộ kít):
1. Để lọ chất nội chuẩn và dung dịch chiết về nhiệt độ phòng (18 đến 25°C)
2. Thêm vào lọ chất nội chuẩn acid amin (AA) 1 mL dung dịch chiết và lắc kỹ
đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc. Dung dịch này bền trong 30 ngày
khi đóng kín và bảo quản trong tủ lạnh (+2 đến +8°C).
3. Thêm vào lọ chất nội chuẩn acylcarnitines (AC) 1 mL dung dịch chiết và lắc
kỹ đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc. Dung dịch này bền trong 30
ngày khi đóng kín và bảo quản trong tủ lạnh (+2 đến +8°C).
Ngay sau khi sử dụng, bảo quản ở -20oC.
2.2. Chuẩn bị dung dịch làm việc hàng ngày (daily working solution)
- Các dung dịch làm việc hàng ngày được chuẩn bị bằng cách pha loãng các
dung dịch chất nội chuẩn đã hòa tan ở trên theo tỉ lệ 1: 100 (v/v) bằng dung dịch
chiết.
Ví dụ: dùng pipet lấy 100 μl dung dịch axit amin và 100 μl dung dịch acylcarnitine
vào 9,8 mL dung dịch chiết, lắc đều. Lượng này đủ dung cho đĩa 96 giếng.
- Dung dịch làm việc hàng ngày này bền trong 2 tuần khi được bảo quản trong
tủ lạnh ở 2 đến 8°C trong lọ thủy tinh kín.
- Hàng ngày dựa trên lượng mẫu, tính toán để pha lượng thuốc thử vừa đủ.
Nên pha hàng ngày.
2.3. Chuẩn bị mẫu:
Các lọ dung dịch hóa chất, nội chuẩn được để ở nhiệt độ phòng ( 20°C đến 25°C) ít
nhất 30 phút trước khi bắt đầu làm xét nghiệm.
Các bƣớc thực hiện
1. Sử dụng máy đục lỗ DBS 100, cắt hình tròn
đường kính 3 mm từ mẫu máu thấm khô của người
bệnh vào các giếng tương ứng trên khay có đáy chữ
U
2. Cắt hình tròn đường kính 3 mm của ba mẫu QC
ba mức vào các giếng tương ứng trên khay có đáy
chữ U, lặp lại mỗi mức QC hai giếng
3. Thêm 100 uL thuốc thử hàng ngày (chứa nội
chuẩn) vào mỗi giếng có mẫu máu thấm khô.
4. Đậy khay bằng tấm dính và ủ trên máy lắc 20
phút với tốc độ lắc 650 vòng/ phút. Chú ý đảm bảo
sau khi xong chuyển ngay sang bước tiếp theo.
5. Chuyển 70 uL dịch chiết từ mỗi giếng chữ U
sang giếng tương ứng của khay đáy chữ V. Đậy
khay bằng tấm nhôm để tránh bay hơi.
6. Đưa khay đã được đậy tấm nhôm vào bộ phận
bơm mẫu tự động máy LCMSMS 8040
2.4. Vận hành MSMS
Khởi động phần mềM ứng dụng trên hệ thống, tạo worklist sử dụng nồng độ
nội chuẩn thích hợp.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Xét nghiệm giúp phát hiện các bất thường bẩm sinh. Danh sách các bệnh
Sàng lọc bằng kit NeoMass
T
T
Bệnh RLCH
Chỉ
điểm 1
Tỷ lệ
Các bệnh cùng
chỉ điểm
1
Argininosuccinic
acidemia
Asa
CIT typ I, typ II
2
Citrullinemia typeI
Cit
Cit/Arg
ASA
3
Homocystine niệu
(thiếu CBS)
Met
Met/Phe
–
4
Bệnh siro niệu
Val ,
Leu
Val/Phe,
(Ile+Leu)/Phe,
(Ile+Leu)/Ala
–
5
Phenylketon niệu
kinh điển
Phe
Phe/Tyr
–
6
Tyrosinemia type I
Succinyl
acetone
Tyr/Cit
–
7
Argininemia
Arg
–
–