TÁCH CHI T ADNẾ
GS.TS Nguy n Quang Th ch ễ ạ
Vi n Sinh hoc Nông nghi p ệ ệ
1.Nguyên t c và yêu c u ắ ầ
- Tách chi t ADN là c n thi t b i các th c nghi m c aế ầ ế ở ự ệ ủ
công ngh gen đ u ti n hành v i ệ ề ế ớ ADN (hay ARN)
- ADN tách chi t đ c c n đ m b o v đ tinh khi t ế ượ ầ ả ả ề ộ ế
và đ nguyên v n v c u trúc đ th c hi n độ ẹ ề ấ ể ự ệ ư c cácợ
khâu nghiên c u ti p theo trong công ngh gen th c v t.ứ ế ệ ự ậ
* Có r t nhi u ph ng pháp tách chi t AND, tuỳ thu c m cấ ề ươ ế ộ ụ
đích nghiên c u mà l a ch n các phứ ự ọ ư ng pháp tách ADN choơ
phù h pợ
2.Các b c chính trong tách chi t ADN ướ ế
1. Phá v v t li u ban đ u (t bào, mô) đ m t bào và gi iỡ ậ ệ ầ ế ể ở ế ả
phóng axit nucleic (ADN và ARN) (nghi n trong ni t l ngề ơ ỏ
và hòa trong đ m chi tệ ế )
2. B sung các ch t ch ng các ch t ho t hoá enzyme ổ ấ ố ấ ạ
ADNase và làm bi n tính các phân t protein, d ch h uế ử ị ữ
c .v.v. ơ
3. Tách ADN kh i các t p ch t khác (ỏ ạ ấ b ng máy ly tâmằ).
4. K t t a , r a và hòa tan ADN (ế ủ ử r a b ng dung d ch c n,ử ằ ị ồ
hòa tan trong TE ho c n c c tặ ướ ấ )
3. M t s hoá ch t thông d ng dùng trongộ ố ấ ụ
tách chi t axít nucleicế
-Ni t l ngơ ỏ : Thông th ng đ phá màng/v t bào chúng ta ph iườ ể ỏ ế ả
dùng nit l ng, vì nit l ng có 2 tác d ng chính đó là: ơ ỏ ơ ỏ ụ
+ Làm cho màng b c ng giòn, d b v khi nghi n ị ứ ễ ị ỡ ề
+ Và ni t l ng gi cho m u tr ng thái l nh, tr ng thái mà cácơ ỏ ữ ẫ ở ạ ạ ạ
enzym phá hu ỷaxít nucleic không ho t đ ng cho t i khi chúng bạ ộ ớ ị
c ch b ng hoá ch t. ứ ế ằ ấ
M t s qui trình s d ng v t li u đông khô, b i v t li u đông khô dộ ố ử ụ ậ ệ ở ậ ệ ễ
phá v màng h n, m t khác s d ng v t li u đông khô không c n giỡ ơ ặ ử ụ ậ ệ ầ ữ
m u tr ng thái l nh, vì trong môi tr ng khô tuy t đ i các ezim pháẫ ở ạ ạ ườ ệ ố
hu ỷaxít nucleic cũng vô tác d ng. ụ
- EDTA: Khi màng b phá v , m t lo t các ch t đ c gi i phóng raị ỡ ộ ạ ấ ựơ ả
dung d ch, trong s chúng có các lo i emzim thu phân ị ố ạ ỷ axít nucleic thành
nh ng m nh v n, b i v y c n ph i c ch s ho t đ ng c a enzym nàyữ ả ụ ở ậ ầ ả ứ ế ự ạ ộ ủ
b ng EDTA. Các ion hoá tr hai nh : Mgằ ị ư 2+ và Ca2+.v.v. r t c n thi t choấ ầ ế
s ho t đ ng c a enzym thu phân ự ạ ộ ủ ỷ axít nucleic. N u trong dung d ch cóế ị
EDTA, ch t này s liên k t v i các ion hoá tr hai nói trên, liên k t nàyấ ẽ ế ớ ị ế
d n t i s c ch ho t đ ng c a enzym thu phân ẫ ớ ự ứ ế ạ ộ ủ ỷ axít nucleic, do v yậ
mà axít nucleic s không b phân hu . ẽ ị ỷ
Tris: Axít nucleic còn b nh h ng r t l n b i đ axít và ki m c aị ả ưở ấ ớ ở ộ ề ủ
dung d ch s d ng trong tách chi t, axít có th làm cho ị ử ụ ế ể axít nucleic b gãy,ị
ch ng h n axít clohydric (HCl) làm cho ADN b đ t nh ng v trí purin,ẳ ạ ị ứ ở ữ ị
trong khi đó n u n ng đ ki m cao thì ADN s b tách thành s i đ n.ế ở ồ ộ ề ẽ ị ợ ơ
Đ lo i tr nh h ng c a axít và ki m ng i ta đã s d ng Tris để ạ ừ ả ưở ủ ề ườ ử ụ ể
đi u ch nh pH c a dung d ch. ề ỉ ủ ị