zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Tài liệu Công nghệ sinh học

Chia sẻ: Up Up | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Báo xấu

271
lượt xem 37
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tế bào gốc tạo máu cung cấp cho cơ thể nguồn tế bào máu ổn định, bao gồm hồng cầu – tế bào vận chuyển oxy và bạch cầu – tế bào tạo nên hệ thống miễn dịch. Tế bào gốc tạo máu (tế bào Hematopoitic) có thể tự tạo nhiều bản sao để chắc chắn rằng nó có đủ số lượng để cung cấp máu trong suốt một đời người. Điều này đòi hỏi nó phải đạt được sự cân bằng tinh tế giữa việc tự tái tạo và việc phát triển thành những dòng tế bào máu khác nhau....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tài liệu Công nghệ sinh học

Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Công nghệ sinh học ( phần 1 ) microRNA kiểm soát chức năng của các tế bào gốc máu Tế bào gốc tạo máu cung cấp cho cơ thể nguồn tế bào máu ổn định, bao gồm hồng cầu – tế bào vận chuyển oxy và bạch cầu – tế bào tạo nên hệ thống miễn dịch. Tế bào gốc tạo máu (tế bào Hematopoitic) có thể tự tạo nhiều bản sao để chắc chắn rằng nó có đủ số lượng để cung cấp máu trong suốt một đời người. Điều này đòi hỏi nó phải đạt được sự cân bằng tinh tế giữa việc tự tái tạo và việc phát triển thành những dòng tế bào máu khác nhau. Sự mất cân bằng sẽ dẫn đến một số bệnh như b ệnh bạch cầu (Leukemia) và bệnh thiếu máu (Anemia). Một yếu tố quan trọng để chống lại các căn bệnh liên quan đến rối loạn tế bào gốc máu là gia tăng sự hiểu biết về các gene và phân tử kiểm soát hoạt động của các tế bào gốc máu. Các nhà sinh học thuộc Viện Kỹ thuật California (Caltech, Mỹ) đã đ ạt được một bước tiến lớn trong quá trình nghiên cứu. Họ đã tìm ra một nhóm mới các phân tử có nồng độ cao trong tế b ào gốc máu và nó có tác dụng điều tiết sử sản xuất tế bào gốc máu. David Baltimore, G iáo sư Sinh học Robert Andrews Millikan, người nhận giải Nobel năm 1975 Sinh lý và Y khoa, nghiên cứu chính của đề tài nói “khi những đoạn nhỏ bé của RNA (còn đ ược gọi là microRNA hay miRNA) được kích thích biểu hiện ở nồng độ cao trong tế bào gốc máu
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com của chuột thí nghiệm, các miRNA sẽ cản trở hoặc thú đẩy chức năng của những tế b ào này”. Bài báo về nghiên cứu này đã được công bố vào ngày 26/6/2010 trên phiên bản trực tuyến của Kỷ yếu của Viện Hàn lâm khoa học Quốc gia (The Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)). Ngạc nhiên hơn nữa, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy một phần của miRNA, gọi là miR-125b, có một vai trò nổi bật. Khi nồng độ miR-125b hơi cao, nó sẽ đẩy mạnh việc sản xuất các tế bào máu trưởng thành từ các tế bào gốc máu tốt hơn nhiều so với các loại miRNA khác. “Nhưng khi mức biểu hiện của nó được đẩy lên mức cao hơn, nó sẽ nhanh chóng dẫn đến ung thư trong vòng 6 tháng”, Baltimore nói. Cơ chế chính xác của việc chuyển đổi công dụng này hiện nay vẫn chưa được làm rõ, nó được cho là có khả năng liên quan đến sự ức chế của miR-125b đến những gene đặc biệt đàn áp sự phát triển của khối u. “Chúng tôi ngạc nhiên khi thấy rằng ở nồng độ cao, miR-125b gây ra bệnh máu trắng cấp tính ở chuột” Aadel Chaudhuri, cử nhân thuộc Caltech, đồng tác giả của bài báo, nói. Bệnh máu trắng là bệnh mà các tế bào máu bình thường (bao gồm hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu) được thay thế bởi các tế bào b ạch cầu bất thường phát triển liện tục không thể kiểm soát được, cuối cùng dẫn đến tử vong nếu không được điều trị. “Những nghiên cứu này được tiến hành trên chuột nhưng chúng tôi đã phân tích trên tế bào gốc máu của người và đã đã tìm thấy các miRNA với hàm lượng cao tương tự như trong chuột” theo Ryan O'Connell - người đang làm postdoc ở Caltech và là tác giả chính của b ài báo đăng trên PNAS. Thêm vào đó, các nhà nghiên cứu đã tìm ra rằng sự biểu hiện của phân tử miRNA quan trọng đó tăng khả năng cấy ghép tế bào gốc máu của người khi nó đươc chuyển vào trong chuột. “Điều này chứng tỏ rằng sự biểu hiện và chức năng của các miRNA này được bảo tồn trong suốt quá trình tiến hóa” O’Connell nói. Aadel Chaudhuri nói “Điều này có nghĩa là hoàn toàn khả thi khi các bệnh về bạch cầu ở con người có thể được chữa trị bằng cách sử dụng các microRNA trong tế b ào gốc mới được xác định này” “Các khám phá này khi kết hợp với báo cáo tương tự của bác sĩ David Scadden thuộc Bệnh viện Đa khoa Massachusetts và Viện Tế bào gốc Harvard cho thấy rằng các miRNA là những phân tử quan trọng kiểm soát chức năng của tế bào gốc máu” Aadel Chaudhuri nói “Những sự quan sát
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com này có sự liên kết chặc chẽ giữ chẩn đoán và điều trị ung thư và b ệnh thiếu máu – căn bệnh do sự khiếm khuyết của tế bào gốc máu. Việc cấy ghép tế bào gốc máu đã trở thành phương pháp phổ biến trong điều trị ung thư, bệnh tự miễn dịch và thậm chí cả một số loại bệnh truyền nhiễm. Việc sử dụng các mức độ biểu hiện của miRNA trong tế b ào gốc máu thông qua liệu pháp điều trị mục tiêu có thể được dùng đ ể chứng minh thêm hiệu quả của cách tiếp cận này” “Hai nghiên cứu bổ sung cung cấp thêm bằng chứng rằng các miRNA là bộ phận điều khiển then chốt trong việc kiểm soát tỷ lệ các loại tế bào máu được tạo từ tủy xương của chuột và con người.” Baltimore nói. “Trong công việc này, chúng tôi đ ã chứng minh cơ chế này là có thật trong các tế bào gốc. Trong khi những nghiên cứu trước đó của chúng tôi và các nhà khoa học khác đ ã cho thấy mức độ của miRNA xác định nồng độ của các loại tế bào máu trưởng thành. Tuy nhiên liệu pháp miRNA mục tiêu (The targeting miRNAs therapy) vẫn là một thách thức lớn cho ngành Công nghệ sinh học”. Ngoài Baltimore, O'Connell và Chaudhuri, bài báo “MicroRNAs gia tăng trong quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu điều tiết dài hạn việc sản xuất các tế b ào gốc tạo máu” (MicroRNAs enriched in hematopoietic stem cells differentially regulate long-term hematopoietic output) còn có các đồng tác giả như Dinesh Rao, nhà khoa học trước đây làm việc tại Caltech và hiện nay thuộc Trường Y khoa David Geffen tại UCLA, William S. Gibson – K ỹ thuật viên của Caltech và Alejandro B. Balazs – nghiên cứu sinh hậu tiến sĩ của Caltech. Công việc nghiên cứu được tài trợ bởi Viện nghiên cứu Ung thư, Viện Tim, Phổi và Máu Quốc gia; Quỹ khoa học Quốc gia và Viện Ung thư Quốc gia. Tinh sạch protein I. Giới thiệu chung Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của p rotein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. II. Nhận biết protein mục tiêu
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Kết quả của sự tinh sạch là m ột mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đ ặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản xuất năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bào Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng. III. Ly trích protein từ tế bào Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn đ ược nguồn protein, chúng ta cần phân đoạn dịch tế b ào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứa nhiều protein mục tiêu. Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triển bằng sự m ày mò qua từng thí nghiệm. Bước đầu tiên là phá vỡ màng tế bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịch nổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng cao hơn lắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn và dịch nổi mới. Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm phân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đã qua thử nghiệm hoạt tính. Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com IV. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính căn bản như đ ộ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên m ột đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch. Ở mỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định hoạt tính và xác định nồng độ protein đều được thực hiện. Lượng đáng kể protein tinh sạch, khoảng vài miligram, có thể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba chiều và cơ chế phản ứng của nó. Vì vậy, sản lượng toàn phần là một điểm quan trọng của quá trình tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán d ẫn, sắc ký. IV.1. Tủa bằng muối Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Ví dụ như fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến nồng độ 2.4 M, albumin mới kết tủa. Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng độ của một dung dịch protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch trước. Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách IV.2. Sự thẩm tách Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ. Những phân tử có cấu trức không gian nhất định lớn hơn dường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó, những phân tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi. Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau. IV.3 Sắc ký Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể đ ược sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy). IV.3.1 Sắc ký lọc gel Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. V ì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. IV.3.2 Sắc ký trao đổi ion Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích d ương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein IV.3.3 Sắc ký ái lực Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngo ài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên m ột cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao. IV.3. Sắc ký lỏng cao áp
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Công nghệ sinh học ( phần 2 ) Hợp chất Flavonoid trong thực vật có hoa “Các hợp chất flavonoid là một trong những yếu tố quyết định màu sắc của hoa. Quá trình sinh tổng hợp flavonoid là một quá trình biến dưỡng tổng hợp tự nhiên đã được nghiên cứu một cách rất sâu rộng. Theo đó, hợp chất flavonoid được sinh tổng hợp theo con đường sinh tổng hợp phenylpropanoid, chính là con đường tổng hợp thứ cấp chủ yếu trong tất cả thực vật bật cao. Hầu hết các enzyme cũng như các đoạn gene tương ứng cần thiết cho quá trình trên đ ều đã được nghiên cứu cụ thể; trong số đó nhiều protein đã được tinh thể hóa và phân tích cấu trúc.” Hoa hồng xanh được sản xuất tại công ty Florigene từ việc ứng dụng thành tựu của kỹ thuật di truyền trong sắc tố hoa. Hình ảnh sử dụng trong minh họa được sự cho phép từ Tiến sỹ T. Tanaka. Loài người đã bị thu hút bởi màu sắc hoa có lẽ một thời gian rất dài, thậm chí trước khi bắt đầu nền văn minh. Nhà triết học đời nhà Tống, Chu Tử khuyên người dân trân trọng “hàng ngàn sắc tím với hàng ngàn sắc đỏ từ
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com những đóa hoa mùa xuân”. H ầu hết hàng ngàn sắc đỏ và sắc tím đó bắt nguồn từ flavonoid, một nhóm sắc tố độc đáo nhưng là những sản phẩm vô cùng phổ biến của quá trình biến dưỡng thứ cấp qua con đường phenypropanoid. Chức năng chủ yếu của flavonoid trong hoa là dùng để thu hút côn trùng và các loài động vật khác giúp cho quá trình thụ phấn chéo. Cấu trúc và sự kết hợp độc đáo của các flavonoid ở mỗi lo ài khác nhau tạo nên các quang phổ cực tím và thông thường đ ược nhìn thấy bởi các loài côn trùng và động vật lớn hơn giúp gia tăng hiệu quả của việc thụ phấn và sự thụ tinh của hoa. Flavonoid trong hoa còn giúp chống lại bức xạ cực tím và có vai trò như một chất bảo vệ chống lại mầm bệnh giống như vai trò của chúng ở những cơ quan khác của thực vật. H ơn nữa, trong nghiên cứu của Van der Meer và cộng sự năm 1992 đã xác định được một nhóm các flavonoid đóng vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt phấn, từ đó chứng minh những sắc tố này có chức năng vô cùng quan trọng trong vai trò chính yếu của hoa là sinh sản. Cấu trúc của flavonoids gồm có bộ khung carbon C6-C3 -C6 thường có hai vòng thơm (vòng A và B) và một vòng carbon có một nguyên tử oxygen. Sắc tố anthocyannins là một phân nhóm của flavonoid hiện diện chủ yếu trong không bào của tế bào thực vật. Dựa vào các nhóm OH của vòng B, có ba nhóm anthocyanin chính được tìm thấy trong thiên nhiên là pelargonidin, cyanidin và delphinidin. Methyl hóa cyanidin và delphinidin tạo ra thêm ba nhóm anthocyanin bổ sung nữa là peonidin, petudin và malvidin. Màu sắc của hoa được xác định bởi các yếu tố trong tế bào cũng như các yếu tố điều khiển sự phân bố theo thời gian và không gian của các sắc tố ở cấp độ mô – cơ quan thực vật. Trong các tế bào của cánh hoa, màu sắc được điều hòa bởi ít nhất 6 yếu tố sau: 1. Sinh tổng hợp anthocyanin – là yếu tố quan trọng nhất; 2. Sinh tổng hợp các sắc tố khác như carotenoid và betalain; 3. Sự chuyển đổi các phân tử anthocyanin cơ b ản trong các quá trình hydro hóa, methyl hóa ho ặc kết hợp; 4. Các sắc tố phụ như flavone và các ion kim loại; 5. Sự thay đổi của pH trong không bào; 6. Cấu trúc và đặc tính sinh hóa của các siêu phân tử sắc tố.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Tất cả yếu tố trên đều có khả năng thay đổi cường độ và quang phổ của màu sắc hoa. Từ những năm đầu của thế kỷ 19 từ khi nhà di truyền học Gregor Mendel coi màu hoa như là một marker trong các thí nghiệm di truyền cổ điển của ông, sự khám phá flavonoid đã đóng góp rất to lớn cho sự phát triển của nền sinh học hiện đại. Ngược lại sự phát triển của sinh học hiện đại cũng giúp các nhà khoa học hiểu biết một cách sâu rộng khoa học di truyền và sinh hóa của màu sắc hoa. Sự glycosyl hóa protein ở Eukaryote Các glycoprotein chiếm thị phần chính trên thị trường các protein dược phẩm. Hầu hết các protein này đ ều được sản xuất bởi công nghệ protein tái tổ hợp nhờ vào việc sử dụng các hệ thống biểu hiện như vi khuẩn, nấm men, tế bào đ ộng vật. Hệ thống biểu hiện của nấm men và tế bào động vật có nhiều ưu điểm trong sản xuất các protein tái tổ hợp. Ở sinh vật nhân chuẩn, các protein thường đ ược biến đổi sau quá trình dịch mã, điều này có liên quan mật thiết đến hoạt tính của các protein. Sự glycosyl hóa là sự biến đổi thông dụng nhất trong các hệ thống này và nó cần thiết cho các chức năng của protein như sự nhận diện, sự truyền tín hiệu, sự tương tác giữa các protein và tế bào. Vì vậy, bộ máy glycosyl hóa của các hệ thống này là một vấn đề rất quan trọng mà chúng ta cần phải hiểu khi biểu hiện một protein nào đó. 1. Các dạng glycosyl hóa protein 1.1. Glycosyl hóa protein ở vị trí N Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là quá trình biến đổi sau dịch mã được bảo tồn ở nấm men và các eukaryote khác. Glycosyl hoá ở vị trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất (ER) với sự chuyển chuỗi oligosaccharide vào vị trí asparagine của một protein [19,20]. Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit amin là Asn-Xaa-Ser/Thr nơi mà vị trí thứ hai không phải là Pro. Chuỗi oligosaccharide này chứa 3 phân tử đường glucose ở đuôi không khử của cấu trúc lõi Man9GlcNAc2 gắn vào protein và nó bị cắt bởi các enzyme glucosidase của lưới nội chất và enzyme α-1,2 mannosidase và đi vào bộ máy Golgi . Cơ chế glycosyl hóa ở vị trí N: - Glc3Man9GlcNAc2 được tập hợp ở mạng lưới nội chất nhám và được biến đổi thành Man8GlcNAc2.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com - Sự cắt bỏ bớt các phân tử đường diễn ra trong Golgi bởi các enzyme mannosidase tạo thành Man5GlcNAc2 đ ể tổng hợp các oligosaccharide phức tạp hoặc hình thành các oligomannoside. - Sự chuyển thành dạng đa anten phức tạp xảy ra ở thuỳ giữa của Golgi và trans-Golgi, có hoặc không có đuôi sialic acid, và từ đó protein được tiết ra môi trường ngoại bào. 1.2. Glycosyl hóa ở vị trí O Sự glycosyl hóa ở vị trí O là việc tạo liên kết cộng hóa trị giữa một monosaccharide với axit amin Ser hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự cho thấy Glycosyl hoá ở vị trí O không quyết định sự gấp cuộn và tính tan của protein. D ạng phổ biến của hiện tượng glycosyl hoá ở vị trí O ở người thường xảy ra ở G olgi , liên quan tới sự chuyển GalNAc từ UDP-GalNAc sang axit amin Ser ho ặc Thr thông qua hoạt động của enzyme GalNAc transferase kéo theo sự chuyển của hàng hoạt các phân tử đường khác nhau như galactose, GalNAc, and N-GlcNAc, fucose, glucose, mannose, hydroxyproline… 2. Sự glycosyl hóa protein ở tế bào động vật có vú
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Các tế bào động vật có vú (như tế bào CHO, tế b ào myeloma, tế bào HEK) đang được ưa chuộng bởi vì bộ máy glycosyl hoá của chúng rất giống ở người, mặc dù các phân tử đường được gắn vào protein không hoàn toàn giống ở người, chúng vẫn được bán trên thị trường. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N đều có cấu trúc nhánh chuẩn bao gồm mannose, galctose, N-acetylglucosamine (GlcNAc) và axit neuramic. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí O thì bao gồm một số lượng phân tử đường khác nhau bao gồm galactose, N - acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, axit sialic và axit neuramic. Kiểu mẫu glycosyl hóa các protein dược phẩm được sản xuất bởi hệ thống tế bào động vật có vú là khác nhau và thay đổi theo từng mẻ. V ì vậy, sự đa dạng này phải được kiểm tra lâm sàng và tiền lâm sàng. Trong thực tế, các kiểu mẫu glycosyl hóa này có thể được thay đổi bằng cách tối ưu hóa quy trình lên men, sử dụng các enzyme biến đổi, hoặc tạo ra những hệ thống biểu hiện được làm giàu hoặc loại bỏ những dạng gắn phân tử đường đặc biệt nào đó. 3. Sự glycosyl hóa protein ở hệ thống nấm men Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các glycoprotein dược phẩm bởi dễ thao tác, dễ sản xuất với quy mô lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ sản xuất ngắn. Một ưu điểm khác là chúng có khả năng tạo ra các kiểu mẫu glycosyl hóa giống nhau và đã đ ược hiểu rõ vai trò của phần carbonhydrate. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N trong S. cerevisiae có đặc điểm phân nhánh rất nhiều và mang rất nhiều đường mannose. Trong khi các protein được glycosyl hóa ở vị trí O chỉ bao gồm nhiều nhất là 5 phân tử mannose. Sự glycosyl hóa ở vị trí N trong Pichia hầu hết bao gồm chuỗi ManGlcNAc, giống với kiểu glycosyl hóa protein điển hình trong tế bào động vật có vú. In Pichia, the outer oligosaccharide chain of secreted proteins is mostly unaltered and consists of Man8–9GlcNAc2. Mặc dù có nhiều sự khác nhau về số lượng và độ phức tạp của sự kiểu glycosyl hóa liên kết với N được thấy, nhưng chúng vẫn có chứa trình tự bảo tồn nhận biết cho sự khởi đầu sự glycosyl hóa, Asn-Xaa-Ser/Thr. Ở Pichia có sự gắn chuỗi oligosaccharide tại vị trí O nhưng nó không phải là thành phần quan trọng của các glycoprotein tan. Sự gắn chuỗi oligosaccharide chỉ bao gồm các phân tử mannose. Tuy nhiên, số lượng
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com mannose trên một chuỗi, các liên kết tạo ra, tần số và tính đặc hiệu của sự glycosyl hóa ở vị trí O trong Pichia pastoris vẫn chưa xác định được. Chúng ta không nên thừa nhận rằng một protein không bị glycosyl hóa ở vị trí O trong tế bào chủ tự nhiên thì sẽ không bị glycosyl hóa trong Pichia. 4. Các enzyme dùng cho nghiên cứu về glycoprotein Các enzyme thường được sử dụng trong những nghiên cứu về cấu trúc đường của các glycoprotein: Enzyme Loại enzyme Sự đặc hiệu Cắt các phân tử Endoglycosidase Endo glycan chứa D nhiều mannose Cắt các phân tử Endoglycosidase Endo glycan chứa F nhiều mannose Cắt các phân tử Endoglycosidase Endo glycan chứa H nhiều mannose β-galactosidase Loại bỏ các Exo enzyme galactosidase khỏi G al-β1, 5, 8, 9 3-GlcNAc; Gal- β1,4-GlcNAc; G alβ1,3 GalNAc N-glycosidase F Endo Các glycoprotein giữa Asn và G lcNAc N euAc-α2,6-Gal; Stalidases Exo N euAc-α2,6- (Neuraminidases) GlcNAc; 2 or NeuAc-α2,3- Ga 5. K ết luận
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Glycosyl hóa là một quá trình phức tạp và đa dạng trong các sinh vật nhân chuẩn. Vì vậy, nó không thể khái quát hóa theo những kiểu mẫu glycosyl hóa chuẩn. Trước khi biểu hiện một protein tái tổ hợp, chúng ta nên hiểu rõ hệ thống biểu hiện và phải nắm được mục đích sử dụng của sản phẩm. Các nhà khoa học đang cố gắng tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng tổng hợp các glycoprotein với cấu trúc giống với khi chúng được tổng hợp ở người. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Roland Contreras ở trường đại học Ghent, Bỉ và Tillman Gerngross ở trường Glycofi, Boston, Mỹ đã báo cáo về việc tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng sản xuất protein với kiểu gắn mannose giống với ở con người. Nhóm nghiên cứu này hy vọng sẽ có thể tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng tổng hợp được các protein hoàn toàn giống như chúng được tổng hợp ở con người
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Công nghệ sinh học ( phần 3 ) MicroRNA làm giảm tác động của cocaine Người sử dụng cocaine sẽ bị nghiện càng ngày càng nặng. Tuy nhiên, về lâu dài, cocaine bị hấp thu vào cơ thể sẽ cảm ứng sự biểu hiện của một loại vi RNA (microRNA) trong não. MicroRNA này dường như có khả năng làm giảm lượng cocaine mà con nghiện phải dung nạp. Bộ não có một khả năng đáp ứng lại với những tín hiệu từ môi trường rất to lớn và do đó những điều kiện khác thường cũng dần dần trở nên bình thường. Việc sử dụng lâu dài những chất gây nghiện như cocaine, heroin, và nicotine sẽ dẫn đến sự thích nghi về mặt thần kinh, làm cho người sử dụng bị “lờn thuốc”, kém nhạy cảm với những chất này. Một người nghiện lâu năm chỉ có phản ứng vừa phải với một lượng heroin tương đối lớn, trong khi đó lượng heroin này có thể gây các phản ứng sốc quá liều đối với những người mới “tập tành”. Do đó những con nghiện lâu năm chỉ cảm thấy bình thường nếu có heroin trong người, và liều chất gây nghiện phải ngày càng cao thì mới gây những cảm giác hưng phấn cho họ. Nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Paul J. Kenny tại Viện nghiên cứu Scripps ở bang Florida (Hoa Kỳ) vừa công bố trên Tạp chí Nature số 466 (năm 2010) về việc phát hiện một cơ chế phân tử giới hạn lượng chất gây nghiện cần cho chuột đã bị nghiện cocaine trong thời gian dài. Những thay đổi trong mạng lưới tế bào thần kinh (neuron) làm cho phản ứng của cơ thể đối với một loại chất gây nghiện giảm dần, thường được gọi là “quen thuốc”. Sự linh hoạt của hệ thống nội cân bằng này khởi đầu từ những phản ứng ở mức phân tử và tế bào của mạng tế b ào thần kinh đối với những thay đổi môi trường. Chúng có liên quan đến sự kích hoạt các phản ứng thích nghi thứ cấp ở mức phân tử buộc các chức năng tế bào và mạng thần kinh quay trở lại mức bình thường. Tuy nhiên, nếu sử dụng chất gây nghiện trong thời gian dài thì khả năng thích nghi này sẽ bị phá vỡ, dẫn đến nhiều thay đổi trong hành vi như lên cơn nghiện và cảm giác thôi thúc phải dung nạp thêm thuốc. Nhóm nghiên cứu trên đã tìm ra một microRNA, gọi là miR-212, có tác động làm giảm biểu hiện của một nhóm gene có liên quan đến hành vi tìm kiếm thuốc ở chuột. Thí nghiệm của nhóm cho thấy nếu làm tăng sự biểu hiện của miR-212 thì lượng cocaine cần thiết giảm đi ở chuột cho nghiện đã lâu, trong khi nếu ức chế sự biểu hiện của microRNA này thì chuột phải cần có nhiều cocaine hơn.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com Các microRNA được nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Victor Ambros (Đại học Harvard, bang Massachussetts, Hoa Kỳ) phát hiện lần đầu tiên vào năm 1993 ở tuyến trùng Caenorhabditis elegans và sau đó được chứng minh là có khả năng bất hoạt các gene liên quan đến phát triển. Bộ gene người mang hơn 1000 loại trình tự có khả năng là microRNA. Điều này khiến cho các nhà khoa học đặt ra giải thiết rằng các trình tự không mã hóa cho protein này có thể có vai trò quan trọng trong việc điều phối các thay đổi ở mức phân tử dẫn tới sự thay đổi hành vi cơ thể như trong trường hợp ở chuột. Công trình của nhóm Paul J. Kenny về khả năng microRNA giới hạn các thay đổi hành vi ở chuột nghiện cocaine mở ra một phương thức mới nhằm tìm hiểu các cơ chế tiến hóa chống lại sự nghiện hút ở người. Một phát hiện nữa rất thú vị từ nghiên cứu của nhóm Paul J. Kenny là miR-212 điều hòa hoạt động của CREB, đây là một nhân tố điều hòa phiên mã có liên quan đến cảm giác “phê” cocaine. Hai nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Eric J. Nestler (Đại học Yale, bang Conneticut) và Tiến sĩ Robert C. Malenka (Đại học Standford, bang California) ở Mỹ đã chứng minh rằng làm giảm hoạt động của CREB ở vùng vân bụng, tức là vùng kiểm soát cảm giác “phê” cocaine trên não, thì cảm giác “phê” thuốc sẽ tăng lên và ngược lại. Nhóm của Paul J. Kenny cho rằng cho chuột sử dụng cocaine trong thời gian dài sẽ làm tăng hoạt động của cả CREB lẫn cofactor của nó là TORC và cả hai sẽ điều hòa sự phiên mã của miR-212. Cơ chế này tạo ra một vòng điều hòa phản hồi, CREB-TORC làm tăng sự biểu hiện của miR-212, rồi đến lượt miR-212 làm tăng hoạt động của CREB-TORC và do đó làm giảm lượng cocaine cần phải sử dụng. Tuy nhiên, cơ chế này chỉ có tác dụng ở cơ thể của những con nghiện lâu năm. Nhóm Paul J. Kenny còn xác đ ịnh con đường phân tử giới hạn lượng cocaine sử dụng của miR-212 (xem hình). H ầu hết các microRNA ngăn cản sự phiên mã của gene mục tiêu. MicroRNA trong công trình m ới này cũng không phải là ngo ại lệ, khi miR-212 được tăng biểu hiện thì các protein giới hạn hoạt tính của Raf1 (một GTPase nhỏ, có vai trò then chốt trong việc phát sinh chất truyền tín hiệu thứ cấp AMP-vòng nhờ enzyme adenylyl cyclase) bị giảm biểu hiện. Các tác giả xác định một vị trí bám chuyên biệt cho miR-212 trên vùng promoter của gene mã hóa cho SPRED1, một trong những protein giới hạn sự truyền tín hiệu do Raf1 điều hòa. Khi biểu hiện một dạng “kháng” miR-212 của SPRED1 thì miR-212 không còn khả năng giới hạn lượng cocaine sử dụng nữa. Khi miR-212 ức chế sự biểu hiện của SPRED1 và các protein ức chế Raf1 khác thì hoạt tính của Raf1 tăng lên, tạo ra nhiều AMP-vòng hơn, dẫn đến tăng hoạt tính phosphoryl hóa và hoạt tính của CREB. Ở mỗi bước trong con đường truyền tín hiệu này, các tác giả đều chứng minh rằng bắt
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - http://www.simpopdf.com chước theo hoạt động của miR-212 thì lượng cocaine sử dụng sẽ bị giới hạn, còn ngược lại thì làm tăng lượng cocaine sử dụng ở chuột nghiện. Hình: Con đường hoạt động của miR-212 Nghiên cứu này có ý nghĩa rất to lớn. Vì các nhân tố môi trường có thể cảm ứng sự biểu hiện của các microRNA chuyên biệt dẫn đến thay đổi sự nội cân bằng nên khoa học có thể phát triển các phương pháp chữa trị nghiện thuốc hay ma túy ở người bằng cách lặp lại hoạt động của các microRNA. Khả năng thay đổi nội cân bằng dẫn tới sự “quen” thuốc. Để tiếp tục nghiên cứu này, các nhà khoa học nên tìm hiểu xem miR-212 có liên quan đ ến việc cơ thể “quen” với cocaine không; và một khi con nghiện ngưng sử dụng cocaine, sự “quen” thuốc có làm tăng các triệu chứng rối loạn khi cai nghiện hay không. Insulin và công nghệ sản xuất insulin trên thế giới Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ của con người.Trên thế giới, con số những người mắc bệnh tiểu đường ước tính khoảng từ 151 triệu đến 171 triệu (năm 2000), và d ự kiến con số này sẽ là 221 triệu (năm 2010), năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng con số những người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh,

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.