Phương pháp PCR: Thuyết trình nhóm chi tiết

Ụ

Ạ

B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O

Ộ Ạ Ọ

ƯỜ

Ố Ồ

TR

NG Đ I H C NÔNG LÂM THÀNH PH H CHÍ MINH Ủ Ả

KHOA TH Y S N

ề

ƯƠ

PH

Đ tài: NG PHÁP PCR

GVHD : LÊ THỊ PHƯƠNG HỒNG

1 1

Thành viên nhóm

ỳ

ễ

ề

ị

ị  Nguy n Th Hu nh Nga ị  Phan Th Bích Tuy n ễ  Nguy n Minh Quân  Mai Th Nga

08141029 08141063 08141123 08141105

ụ ụ M c l c

ệ

ớ

ề

ả ứ ả ứ

ế ắ

i thi u I. Gi ắ II. Nguyên t c PCR ệ III. Đi u ki n ph n ng PCR IV. Quy trình ph n ng PCR 1.Giai đo n bi n tính ạ ạ ồ 2.Giai đo n b t m i ạ 3.Giai đo n kéo dài

ứ

ụ

ệ

V. Ý nghĩa và các ng d ng PCR ế VII. Các h n chạ ả Tài li u tham kh o

Ớ

Ệ

I. GI

I THI U

ỗ

trùng h p hay còn g i là "ph n ng khu ch đ i gen“.

PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là ph n ng chu i ợ ả ứ ạ ả ứ ọ ế

ụ ệ ỹ

ố ầ

ầ ắ ậ ủ ả ể Trong ngành th y s n vi c áp d ng k thu t PCR đ ư ệ ệ ệ phát hi n ra các m m b nh do virus gây ra nh b nh đ m ứ ộ ệ tr ng,b nh đ u vàng, h i ch ng Taura… trên tôm.

ắ

II. Nguyên t c PCR

 PCR là ph

ể ổ ươ ợ

ạ ộ ợ ơ ủ ồ ắ ặ ạ

ờ ớ ự ủ ng pháp in vitro đ t ng h p m t đo n DNA ệ ủ đ c thù nh công hi u c a 2 m i g n vào 2 s i đ n c a đo n DNA đích v i s tham gia c a DNA polymerase.

ạ ẽ ượ ố ồ  Đo n m i này sau đó s đ c n i dài ra nh ho t đ ng

ộ ể ạ

ờ ạ ộ ớ ủ c a DNA polymerase đ hình thành m t m ch m i hoàn ỉ ch nh.

ắ

II. Nguyên t c PCR

ỳ ố

ộ

ề

ộ M t ph n ng PCR là m t chu i nhi u chu k n i

ả ứ ỗ

ỳ ồ

ỗ ạ

ế

 ti p nhau, m i chu k g m ba giai đo n:

1 chu kỳ

GĐ ế Bi n tính

GĐ ồ ắ B t m i

GĐ Kéo dài

ả ứ

ệ

III. Đi u ki n ph n ng

ề

PCR

ể ạ ượ ệ ầ ả c, c n ph i có

ự

ệ

Hình : Th c nghi m PCR

ể ử ầ ủ ầ Ð th nghi m PCR có th ch y đ đ y đ các thành ph n sau :

1. N cướ

ả

ướ ử ụ ứ ứ ế ậ ả ứ N c s d ng cho ph n ng PCR ph i th t tinh t, không ch a ion nào, không ch a DNAase,

ắ ớ ạ khi RNAase, enzyme c t gi i h n ….

ả ứ

ệ

ị

2. Dung d ch đ m cho ph n ng PCR:

ầ

ị

ườ

ụ

ạ

ộ ng ph thu c vào lo i

Thành ph n dung d ch đ m th

ị

ố ệ

ệ

ng ch a mu i đ m Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM

ệ ử ụ enzyme DNA polymerase s d ng trong PCR, dung d ch ứ ườ đ m th và MgCl2 1.5 mM

ồ

ừ

ộ

0.55 mM.

2 có th dao đ ng t

Chính ả

ể ớ

ế ồ

ộ N ng đ MgCl ắ ion Mg2+ g n k t dNTP v i DNA polymerase, tăng kh năng ố ủ bám n i c a m i.

3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

Deoxyadenosine 5’ triphosphate

3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

ừ ồ ộ ỗ ả N ng đ kho ng ch ng 100 mM cho m i nucleotide:

dATP, dCTP, dGTP, dTTP .

ộ ấ ồ ả N ng đ th p kho ng 10 – 100 mM thì Taq polymerase có

ơ ộ đ chính xác cao h n.

ồ

4. M i (primer)

ồ ợ ơ ữ ắ ầ ế t cho

ạ ả ứ ề ổ ợ ệ M i là nh ng đo n DNA s i đ n ng n và c n thi vi c xúc ti n ph n ng dây chuy n t ng h p DNA.

ề ượ ồ ế ồ Các m i này có chi u ng c nhau, bao g m:

Mồi xuôi (forward primer)

ượ ồ M i ng c (reverse primer).

5.Enzyme DNA polymerase (Taq)

Là enzyme xúc tác cho quá trình l p ráp các nucleotide A,

ớ ổ ợ ạ ắ T, G, C vào m ch DNA m i t ng h p .

ủ ạ Enzyme s d ng đ u tiên là đo n Klenow c a DNA

ầ ử ụ

ủ ở nhi

t đ bi n tính và xúc tác t ng h p t ể ị đ u đ n ặ ạ

ổ ệ ộ t đ 90 ợ ố ề ầ ổ ấ ả ử ụ ề ị polymerase I v sau s d ng Taq polymerase vì nó không b ế ệ ộ ế phá h y ả ứ i cu i quá trình ph n ng,có th ch u nhi nhi u l n mà không m t kh năng t ng h p DNA ợ ừ ầ oC l p l

ẫ

6. DNA m u (DNA template)

ơ ặ

c tách chi ẹ ượ ộ ế ừ t t ẫ ng nghiên c u. DNA m u có đ nguyên v n cao

ấ ể Có th là DNA kép, đ n, ho c RNA đ ố ượ ứ các đ i t ẫ ạ tránh l n t p ch t.

ượ ượ ử ụ ướ L ng DNA đ c s d ng cũng có khuynh h ả ng gi m

ừ ố ế ườ ử ụ i ta s d ng

1mg xu ng còn 100µg) vì th ng ệ ả (t polymerase cho hi u qu cao .

ả ứ

III. Quy trình ph n ng

PCR.

ệ ộ ế ố ờ

ọ

ả ứ  Trong ph n ng PCR nhi tr ng và kèm theo là y u t

t đ là vô cùng quan th i gian.

ả ứ

ự

ệ

ạ

c th c hi n qua 3 giai đo n

ượ  Ph n ng PCR đ ỳ ộ trong m t chu k :

ế

ạ 1. Giai đo n bi n tính

ị ế

ế

 S i DNA m ch khuôn b bi n tính tách thành 2 s i ợ ệ ộ 0C trong vòng 30 giây đ n 1 phút .

ạ t đ 94

ợ ơ ở đ n

nhi

ặ ủ

ớ ự

ễ

 S bi n tính DNA di n ra v i s có m t c a hai

ự ế ạ

ồ

đo n m i và các dNTP.

ắ ặ

ừ

50 – 65

0C t

ạ 2.Giai đo n b t c p: ệ ộ ượ ạ ấ  Nhi ấ

c h th p xu ng t ả

t đ đ nh t là 55

t ố ố ờ oC trong kho ng th i gian 1 – 2 phút .

ụ

ờ

 Th i gian kéo dài ph thu c ho t đ enzyme DNA

ộ ả

ạ ộ ẩ

ề polymerase và chi u dài s n ph m.

ạ : 3. Giai đo n kéo dài

ượ

 Nhi

c nâng lên 72

0C trong vòng 30

ệ ộ t đ lúc này đ ế

giây đ n 1 phút .

ờ

ụ

ủ ệ

ồ

ắ

ổ

ẵ  Nh tác d ng c a men Taq polymerase các Nu có s n ố trong ng nghi m g n vào các m i theo nguyên t c b sung

ộ ả

ớ

ượ

c hình thành

=> M t b n sao DNA m i đã đ

ạ 3. Giai đo n kéo dài

ả ứ

ơ ồ

ề

ỳ

S đ ph n ng PCR qua nhi u chu k

ệ ộ ủ

ả ứ

ỳ

t đ c a các chu k ph n ng

Hình: Nhi PCR

ứ

ụ

V. Ý nghĩa và các ng d ng

ươ

ớ

ề

ng pháp này có ý nghĩa l n vì nhi u lý

a. Ph do:

ẫ ầ

ệ

ự ắ

ủ ộ  Đ tinh sach c a m u không c n cao ễ ự  D th c hi n ờ ẽ ề ệ  R ti n và th i gian th c hi n ng n ậ ộ  Đ chính xác cao đáng tin c y

ủ ế ủ

ứ

ụ

ồ

b. Các ng d ng ch y u c a PCR g m:

ế

ệ ộ

ồ ạ

ệ

ụ ồ ố ọ

i hàng tri u năm ồ

ị ị

ệ

ầ

 Phát hi n đ t bi n  Ph c h i các gen đã t n t ậ  Ch n gi ng v t nuôi, cây tr ng ấ ế ộ ố ế  Xác đ nh huy t th ng, truy tìm d u v t t ủ ả  Xác đ nh m m b nh t

đ ng v t th y s n nh b nh tôm:

ậ ệ

ạ i ph m ư ệ ừ ộ MBV, WSSV, YHV, TSV…và b nh trên cá: VNN…

ạ

ế

VI. Các h n ch

ế ạ Do ph

ộ ạ ẫ ng pháp có đ nh y cao và khu ch đ i nucleic i trong thao tác và đòi ng d n đ n l

ế ỗ ự ỏ ự ậ ươ ễ ị ả ọ ệ ưở acid nên d b nh h h i s th n tr ng trong quá trình th c hi n.

ấ

ớ ạ

c n gi

c và trình t

i h n

ễ

Ba v n đ l n khi dùng PCR: ề ớ ự ầ ướ  Kích th ạ ự  S ngo i nhi m  Các sai sót gây ra do Taq polymerase

ậ

ế VII. K t lu n

ượ

ụ

ộ

c áp d ng r ng rãi ọ

ể ủ

ầ

ậ Ngày nay kĩ thu t PCR đang đ ỏ ủ ả

ự góp ph n không nh cho s phát tri n c a y h c nói chung,cho ngành th y s n nói riêng.

ạ

ể

ầ

ả

ụ

ạ

ơ

ẩ

ả

ủ ỹ ế ể ả ệ ự ậ

ộ

ạ

ậ ữ ư Tuy nhiên bên c nh nh ng u đi m c a k thu t này ắ ữ thì c n ph i kh c ph c nh ng h n ch đ gi m giá ạ ế i k t qu cao h n trong vi c chu n đoán thành, mang l ớ ệ ầ các m m b nh m i gây h i cho đ ng – th c v t và con i.ườ ng

ệ

ả

Tài li u tham kh o

ươ

 Bùi Trang Việt – Lê Thi ̣ Ph

ng H

ồng. 2006. Sinh học di truyền va ̀ phân tử, phần II. Sinh học phân tử.

ỗ ế

ạ ươ

 Đ Hi u Liêm, 2007 . Sinh hóa đ i c

ng.

Các wed: www.drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.html vi.wikipedia.org/wiki/PCR www.sinhhocvietnam.com www.tailieu.com

Thuyết trình nhóm: Phương pháp PCR

Chủ đề:

Báo cáo thực tập kỹ thuật công nghệ

Báo cáo thực tập kỹ thuật hóa học

Ụ

Ạ

B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O

Ộ Ạ Ọ

ƯỜ

Ố Ồ

TR

NG Đ I H C NÔNG LÂM THÀNH PH H CHÍ MINH Ủ Ả

KHOA TH Y S N

ƯƠ

PH

GVHD : LÊ THỊ PHƯƠNG HỒNG

Thành viên nhóm

ụ ụ M c l c

ệ

ớ

ề

ả ứ ả ứ

i thi u I. Gi ắ II. Nguyên t c PCR ệ III. Đi u ki n ph n ng PCR IV. Quy trình ph n ng PCR 1.Giai đo n bi n tính ạ ạ ồ 2.Giai đo n b t m i ạ 3.Giai đo n kéo dài

ứ

ụ

ệ

V. Ý nghĩa và các ng d ng PCR ế VII. Các h n chạ ả Tài li u tham kh o

Ớ

Ệ

I. GI

I THI U

ắ

II. Nguyên t c PCR

ắ

II. Nguyên t c PCR

ỳ ố

ộ

ề

ộ M t ph n ng PCR là m t chu i nhi u chu k n i

ả ứ ỗ

ỳ ồ

ỗ ạ

ế

ả ứ

ệ

III. Đi u ki n ph n ng

ề

PCR

1. N cướ

ả ứ

ệ

ị

2. Dung d ch đ m cho ph n ng PCR:

ầ

ị

ườ

ụ

ạ

ộ ng ph thu c vào lo i

ị

ố ệ

ệ

ệ ử ụ enzyme DNA polymerase s d ng trong PCR, dung d ch ứ ườ đ m th và MgCl2 1.5 mM

ồ

ừ

ộ

Chính ả

ể ớ

ế ồ

ộ N ng đ MgCl ắ ion Mg2+ g n k t dNTP v i DNA polymerase, tăng kh năng ố ủ bám n i c a m i.

3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

ồ

ẫ

ả ứ

III. Quy trình ph n ng

PCR.

ệ ộ ế ố ờ

ọ

ả ứ  Trong ph n ng PCR nhi tr ng và kèm theo là y u t

ả ứ