NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN

Chia sẻ: Phung Tuyet | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

106
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chuyển gen là phương pháp gây biến dị di truyền có định hướng ở cây trồng (Rosen và cs., 2003; Veluthambi và cs., 2003; Sung Hun Park và cs., 2003) đã và đang được áp dụng rộng rãi trong những năm gần đây. Trong nghiên cứu tạo ra cây chuyển gen kháng bệnh, các nhà khoa học đã phát hiện được gen Chitinase trong cây trồng có khả năng hạn chế sự phát triển các loại nấm gây bệnh cây như Fusarium, Botrytis cinerea, Rhizoctonia, hạn...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam NGHIÊN C U CHUY N GEN Chitinase - glucanase KHÁNG N M VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHU N Agrobacterium tumefaciens Bùi Th Lan Hương1, Nguy n Th Trư ng4, Vũ Duy Thanh2, Nguy n Th Kim Lý2, Nguy n c Doanh2, Phan T Phư ng2, Nguy n H ng Minh , Lê Th Ánh H ng2 3 SUMMARY Study of antifungal genetransformation on tomato Tomato is a major vegetable crop that has tremendous popularity over the last century. It is grown in almost every country of the world. Development of protocols for in vitro selection can provide new advances for the production of stress tolerant cultivars. Research objective is to develop transgenic plants from selected Vietnamese tomato cultivars carrying and expressing a chitinase gene under a constitutive promoter. The hypothesis is that the transgenic tomato plants expressing this gene will have enhanced resistance to economically important fungal diseases, which are a problem for warm and humid climatic conditions. Research results presented concerning study on the regeneration capacity of tomato varieties P375 after Agrobacterium mediated transformation. The experimental data show low generation capacity after transformation in P375 variety in both cotyledon (4,32) and hypocotyls (2,63). In this result we obtained two tomato lines confirmed the presence of Chitin’s gene with 788 bp. The primers were used in this investigation are: CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’; CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’ Further testing including tests of the field growth. Plant is necessary to identify individual transformed lines with resistance. Keywords: Callus, Cotyledon, Hypocotyls, genotype, ELISA, , Cytokine, Auxin. I. TV N k t h p gi a các gen Chitinase và Glucanase Chuy n gen là phương pháp gây bi n d di còn t o ra cây chuy n gen có kh năng kháng truy n có nh hư ng cây tr ng (Rosen và b nh cao hơn v i ph r ng hơn so v i nh ng cs., 2003; Veluthambi và cs., 2003; Sung Hun cây tr ng ư c chuy n t ng gen ơn l Park và cs., 2003) ã và ang ư c áp d ng (Jongedyk e và cs., 1995; Zu và cs., 1994; r ng rãi trong nh ng năm g n ây. Trong Lawrence và cs., 2000). nghiên c u t o ra cây chuy n gen kháng b nh, N i dung trình bày dư i ây là m t s các nhà khoa h c ã phát hi n ư c gen k t qu nghiên c u bư c u v chuy n gen Chitinase trong cây tr ng có kh năng h n ch vào gi ng cà chua P375 thông qua ch ng vi s phát tri n các lo i n m gây b nh cây như khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 Fusarium, Botrytis cinerea, Rhizoctonia, h n có ch a plasmid pCAMBIA 1300 mang gen ch s phát tri n c a n m Verticillium dahliae kháng n m Chitinase (ngu n tách t u ch ng 1 và 2 (Z.K. Punja, 2001; Schlumbaum, Pysium), ư c ti n hành t i Phòng B nh phân A. và cs., 1986) và m t s b nh n m khác. S t th c v t; Vi n Di truy n N ông nghi p. Ghi chú: 1Vi n Môi trư ng ông nghi p, Hà i, 2Vi n Di truy n ông nghi p, 3 Trư ng i h c ông nghi p Hà i, 4Trư ng Trung c p ông nghi p, Hà i 1
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam II. V T LI U VÀ PHƯƠN G PHÁP ELISA. Các m u ư c s d ng trong thí N GHIÊN C U nghi m này là các b ph n tr lá m m (hypocotyl) và lá m m (cotyledone) c a các 1. V t li u nghiên c u cây cà chua ư c nuôi c y trong in vitro. - Các gi ng cà chua P375 ư c l a - Vector mang gen kháng n m ch n là gi ng có kh năng cho tái sinh cao, Chitinase ư c cung c p t IN RA- Pháp. ã ư c ki m tra b nh b ng k thu t C u trúc vector: Hình 1. C u trúc vector mang gen kháng n m Chitinase - Ch ng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA105 có ch a plasmid III. K T QU VÀ TH O LU N pCAMBIA 1300 CHI-GLUC, mang 2 gen 1. ghiên c u kh năng tái sinh c a kháng n m: Chitinase, Glucanase và gen kháng Hygomicine (hpt). Gen hpt có gi ng cà chua promoter 35S, còn gen Chitinase - Glucanase Nh ng k t qu nghiên c u c a c a có promoter A9, c 2 promoter này u ho t các nhà khoa h c (Shahin và cs.,1986; ng r t m nh genome th c v t, Chyi và Phillips, 1987; Mc. Cormick, - Gen kháng n m Chitinase ư c tách 1991; Van Roekel và cs., 1993; Shen và t Phaseolus vulgaris cv Saxa (ngu n cs., 1998; Krasnyanski và cs., 2001) cho N CBI-Genbank). th y, kh năng tái sinh c a cây cà chua 2. Phương pháp nghiên c u liên quan n ki u gen c a gi ng, b ph n s d ng nuôi c y, tu i c a cây, - N uôi c y m u ph c v cho bi n n p: Lá m m và tr lá m m ư c c t nh , t vào ĩa các t h p và n ng các ch t kích thích petri ã ư c kh trùng có ch a môi trư ng sinh trư ng, i u ki n nuôi c y v.v... dinh dư ng MS, thành ph n g m các nguyên Trong i u ki n nuôi c y in vitro, s t a lư ng và vi lư ng c a MS, vitamins “ óng, m ” và ho t hoá gen v i m t cơ MS, 20 g/l ư ng sucrose, 0,6% agar, pH: 5,8 ch còn chưa rõ ho c thích h p, ho c có b sung 2 mg/l BA + 0,2 mg/l IAA, t không thích h p s d n n s tái sinh trong phòng t i trong 36, 48 và 60 gi . Sau cây v i t l cao ho c th p các gi ng ó m u l y ra dùng vào bi n n p gen. cà chua khác nhau. - Chuy n gen gián ti p qua Trong thí nghi m, chúng tôi s d ng Agrobacterium tumefaciens: Theo quy trình c a Swapan K. Datta và cs., 1997. gi ng cà chua (P375) có các c tính nông h ct t ánh giá kh năng tái sinh c a - ánh giá hi u xu t chuy n gen: Xác tr lá m m và lá m m, nh m tìm ư c b nh s m u s ng sót, s cây tái sinh thu ư c, s cây tái sinh ư c chuy n gen. ph n có kh năng tái sinh cao làm v t li u nuôi c y chuy n n p gen kháng n m gây - S li u thí nghi m x lý b ng phương b nh cây (b ng 1). pháp Duncan's. 2
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam B ng 1. Kh năng tái sinh các m u tr lá m m và lá m m c a gi ng P375 (L. esculentum Mill) Gi ng cà Kh năng t o callus (%) Kh năng tái sinh ch i (%) Kh năng tái sinh/m u chua Tr lá m m Lá m m Tr lá m m Lá m m Tr lá m m Lá m m P375 83,3ac 93,3ab 37,7b 78.1 a 4,5c 4,2b Ghi chú: a, b, c ch s khác nhau không áng k . Các giá tr trung bình, l ch chuNn ư c th c hi n theo chương trình c a Ducan v i tin c y p ≤ 0,05. K t qu cho th y, trong cùng m t môi ư c th c hi n. Sau khi bi n n p, m u ư c trư ng tái sinh ch i, v i mô t bào t lá chuy n sang môi trư ng c ng MS1 có b m m, gi ng cà chua P375 cho t l tái sinh sung ng th i 2 lo i kháng sinh Cefotaxim ch i t 78,1%, tr lá m m ch t 37,7%. và Hygromicin. Cefotaxim nh m h n ch s Nh ng k t qu này tương t v i nghiên c u phát tri n tr l i c a vi khuNn, trong ó c a các tác gi McComick et al., 1986; kháng sinh Hygromicin là kháng sinh ch Zhang et al., 1999; Peres et al., 2001; th ch n l c các t bào và các mô ã Moghaieb et al., 2004; Pravda et al., 2005; ư c bi n n p. Gorinova et al., 2005. Theo các tác gi trên b. ghiên c u kh năng tái sinh c a thì kh năng này có th còn ph thu c vào cây cà chua bi n i gen ph n ng c a genotype i v i s nuôi c y mô - là k t qu c a quá trình óng m và Căn c vào tính ch t tác ng lên các ho t hoá gen thông qua tác nhân trung gian callus c a 2 lo i kháng sinh ã ư c b là các ch t kích thích sinh trư ng như BAP, sung vào môi trư ng nuôi c y (250 mg/l NAA và m t s y u t ngo i c nh khác. Cefotaxime) và (50 mg/l Hygromicin). Ti n hành theo dõi kh năng tái sinh cây 2. ghiên c u chuy n gen kháng b nh c a mô t bào trên môi trư ng t o callus n m Chitinase vào cà chua P375 (MS1), sau th i gian nuôi c y 15 - 20 ngày, tính kháng v i kháng sinh Hygromicin a. K t qu bi n n p gen Chitinase ư c b t u bi u hi n. Trên nh ng callus Ti n hành bi n n p gen Chitinase có ư c bi n n p xu t hi n m u xanh và phát kh năng kháng n m gây b nh cây vào tri n trên môi trư ng, ngư c l i nh ng gi ng cà chua P375 b ng phương pháp gián callus không ư c bi n n p, kh năng phát ti p thông qua vi khuNn Agrobacterium tri n h u như b ình tr , các t bào t i b tumefaciens (theo quy trình c a Swapan K. m t ti p xúc v i môi trư ng ã có xu Datta và cs., 1997). C t nh các m u c y hư ng i m u, có nh ng m u ã i sang t o v t thương, nhi m vi khuNn vào m u. m u th m. Hi n tư ng này bi u hi n các Quá trình chuy n n p gen Chitinase vào t mô t bào chưa mang gen ngo i lai hpt, bào cà chua ư c th c hi n thông qua vi trên môi trư ng nuôi c y ch a khuÈn Agrobacterium tumefaciens ư c Hygromycin, các mô t bào b kháng sinh nhi m vào các t bào b thương ang phân này c ch quá trình sinh t ng h p protein chia m nh trong môi trư ng giàu auxin. Khi làm m t kh năng xanh hóa c a m u. vi khuNn Agrobacterium tumefaciens ti p các m u không th c hi n ư c s chuy n xúc v i t bào b thương chúng ti t ra ch t n p gen, mô phát tri n kém, m t kh năng transzeatin giúp quá trình bi n n p trong duy trì màu xanh ban u, úa d n en l i t bào th c v t và quá trình bi n n p gen và b ch t. 3
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam T k t qu thí nghi m cũng có th th y n ng vi khuNn d ng huy n phù ư c r ng, các kháng sinh có nh hư ng c ch pha loãng v i 3 t l khác nhau: 1:10; khá rõ n sinh trư ng và phát tri n cũng 1:15 và 1:20. như làm gi m kh năng phát sinh cơ quan Thí nghi m v i n ng t bào vi c a t bào và mô, ngoài ra ôi khi cũng còn khuNn th p (1:20), hi u qu bi n n p h u gây ra nh ng bi n d soma làm gi m t c như t ư c không áng k , có th v i phát tri n và s c s ng c a mô. n ng này, do lư ng t bào vi khuNn th p, c. ghiên c u nh hư ng c a n ng lư ng transzeatin ư c ti t ra quá ít, h n vi khu n và th i gian ng nuôi c y n ch n kh năng bi n n p. thí nghi m s hi u qu bi n n p d ng lư ng t bào vi khuNn cao hơn (n ng Nh ng nghiên c u c a Fillatti và cs., 1:10), s lư ng m u s ng sót thu ư c (1997) ã xác nh n ng vi khuNn và sau x lý cũng b gi m áng k , trong th i gian ti n nuôi c y có nh hư ng l n trư ng h p này, có th lư ng transzeatin n hi u qu bi n n p i v i cây cà ư c ti t ra l i quá l n, gây ra nh hư ng chua. Cơ ch c a quá trình này ư c th c không có l i i v i s phân chia t bào, hi n trên cơ s vi khuNn Agrobacterium cũng d n n làm gi m hi u qu bi n n p. tumefaciens khi nhi m vào các t bào Khi s d ng lư ng t bào vi khuNn v i ang phân chia m nh trên môi trư ng n ng 1:15 (tương ương n ng vi nuôi c y, vi khuNn Agrobacterium khuNn o bư c sóng 600 nm = 0,3) ã cho tumefaciens ti t ra ch t transzeatin giúp hi u qu bi n n p cao hơn 2 n ng trên. cho quá trình bi n n p gen ư c th c V th i gian x lý, v i th i gian x lý trong 48 gi cho hi u qu bi n n p cao nh t hi n. Các tác gi như Sung. Park (2003); (b ng 2). K t qu này c a chúng tôi phù Pravda et al., 2005; Gorinova et al., 2005 h p v i k t qu c a Sung Park (2003) và cho r ng n ng vi khuNn o bư c sóng Gorinova et al., 2005 “Th i gian x lý ít 600 nm v i OD = 0,2 - 0,6 và th i gian x ho c nhi u hơn 48 gi , hi u qu bi n n p lý trong vòng 36 - 60 ti ng cho hi u qu kém”. c bi t, n u kéo dài th i gian x lý chuy n gen vào cà chua là cao nh t. lên quá 48 gi s xu t hi n các v t ho i t Thí nghi m bi n n p gen vào gi ng cà trên các m u c y và m u s ch t. chua P375 ư c chúng tôi ti n hành v i B ng 2. Hi u qu bi n n p gen v i các n ng vi khu n và th i gian ng nuôi c y khác nhau cà chua P375 M u thí nghi m và công th c S lư ng S m u tái sinh T ng s Hi u su t bi n B ph n l y N ng đ vi m u thí m u tái 36 gi 48 gi 60 gi n p (%) m u khu n nghi m sinh 1: 10 300 1 1 - 2 ch t Cu ng lá m m 1: 15 266 1 5 1 7 2,63 1: 20 333 2 2 - 4 1,20 1: 10 300 1 2 - 3 1,00 Lá m m 1: 15 301 3 9 1 13 4,32 1: 20 265 2 3 1 6 2,24 C ng 1 765 35 S li u b ng 2 cho th y, kh năng tái Các ch i ã phát tri n ư c c y chuy n sinh sau bi n n p c a cà chua ph thu c sang môi trư ng MS3 MS + 2 mg/l kinetin vào n ng vi khuNn, th i gian ng nuôi + 1 mg/l IAA + 25 g/l sucrose + 5 g/l agar + c y và lo i m u c y. các lo i kháng sinh tương ng) t o cây 4
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam hoàn ch nh. Thí nghi m thu ư c 16 cây b. Ki m tra ki u gen hoàn ch nh, trong quá trình c y chuy n còn Ti n hành phân tích v phân t iv i l i 12 cây hoàn ch nh, kho m nh và ư c s bi u hi n c a gen, PCR (Shen, 1998; ki m tra s có m t c a gen chuy n. Bhat và Srinivasan, 2002), b ng các enzyme c trưng HindIII, Pstl xác nh 3. Ki m tra s có m t c a gen ư c chuy n các vùng có tr ng lu ng phân t tương ng a. Ki m tra ki u hình v i gen Chitinase. Ph n ng PCR ư c Phương pháp thư ng ư c áp d ng là hoàn thành trong 50 µl c a m i m t h n cho cây tái sinh t o r trong môi trư ng dinh h p ph n ng chuN v i enzym Taq ADN n dư ng có ch a 50 mg/l kháng sinh ch n l c polimeraza, các nucleotid và v i c p m i (Joao và Brơn, 1993; Vidya và cs., 2000; c trưng c a gen Chitinase. Faino và cs., 2004). Do r cây r t m n c m CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’ v i kháng sinh, n u r cây phát tri n kho CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’ m nh i u ó ch ng t cây có ch a gen K t qu i n di cho th y trong 12 cây ư c chuy n (Draper và cs., 1988). Thí cà chua t o ư c trên môi trư ng ch n l c nghi m c a chúng tôi cũng áp d ng theo ch có 2 cây bi u hi n có m t gen phương pháp này xác nh nh ng cây có Chitinase, gen chuy n ư c khuy ch i kh năng ã ư c chuy n gen g m nh ng tương ng 788 bp. (hình 2). cây có b r phát tri n, cây kho m nh. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (-) 788 bp Hình 1. K t qu ki m tra s có m t c a gen Chitinase trong các cây ư c chuy n gen 5
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam IV. K T LU N 1. K t lu n K t qu bư c u nghiên c u s d ng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có ch a plasmid PCAMBIA 1300 chuy n gen vào cà chua ã thu ư c 2 cây cà chua P375 mang gen kháng n m gây b nh cây Chitinase. Nghiên c u các y u t nh hư ng n hi u su t chuy n gen cây cà chua rút ra ư c m t s nh n xét tương t m t s k t nghiên c u ã ư c th c hi n nư c ngoài. Hi u su t chuy n gen cà chua ph thu c vào các y u t : Ki u gen c a t ng gi ng; cơ quan t ư c l a ch n nuôi c y tái sinh và chuy n gen; n ng vi khuN và th i gian ng nuôi c y; s d ng lo i kháng n sinh ch n l c... 2. ngh Ti p t c nghiên c u hoàn thi n quy trình chuy n gen kháng n m gây b nh cây vào gi ng cà chua P375. ánh giá c tính cây cà chua mang gen ư c chuy n trong i u ki n cách ly nh m ch n t o ư c gi ng cà chua có nh ng c tính t t và có kh năng kháng n m gây b nh cây ph c v s n xu t. TÀI LI U THAM KH O 1 Chyi Y-S, Phillips GC., 1987. High efficiency Agrobacterium - mediated transformation of Lycopersicon based on conditions favorable for regeneration. Plant cell Rep. 2 Lê Th Ánh H ng, 2000. Cơ s khoa h c công ngh chuy n gen th c v t. Nhà xu t b n Nông nghi p, 2000. 3 guy n c Thành, 2000. Nuôi c y mô t bào th c v t - nghiên c u và ng d ng. NXB. Nông nghi p. 4 Hu W, Philips GC., 2001. A combination of overgrowth- control and antibiotics improves Agrobacterium tumerfaciens - mediated transformation efficiency for cultivated tomato (L. esculentum). In vitro cell Bio-Plant. 5 Park et al., 2003. Efficinet genotype-independent Agrobacterium - mediated tomato transformation. J.Plant Physiol. 160: 1253-1257. 6 Frary A, Earle ED., 1996. An examination of factor affecting the efficiency of Agrobacterium - mediated transformation of tomato. Plant Cell Rep. gư i ph n bi n: guy n Văn V n 6