Chương II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại dd

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Phương pháp PCR  Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện DNA

Khái niệm thư viện DNA

•Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được sử dụng để thu thập và lưu trữ thông tin •Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phân tử DNA

Th viÖn DNA lµ tËp hîp ngÉu nhiªn c¸c ®o¹n ADN (cã tÝnh ®¹i diÖn ®Æc thï cho hÖ gen cña mét sinh vËt) ® îc chÌn vµo c¸c vector nh©n dßng

Cã hai lo¹i th viÖn mÉu chÝnh ®ã lµ:

1.

Th viÖn genom (Genomic library): chøa toµn bé c¸c

®o¹n DNA cã trong nh©n cña mét tæ chøc hay c¬ thÓ. Genomic library cã thÓ ® îc nh©n dßng b»ng plasmid hoÆc genome cña thùc khuÈn thÓ.

2.

Th viÖn cDNA (cDNA library): chøa c¸c ®o¹n cDNA cã tÝnh ®¹i diÖn ®Æc thï cho toµn bé mARN cña mét m«. Th viÖn cDNA ® îc t¹o ra b»ng c¸ch tæng hîp nªn cDNA tõ mRNA.

C¸c b íc trong t¹o th viÖn mÉu ®· nh©n dßng

1. T¹o c¸c ®o¹n ADN ngÉu nhiªn tõ hÖ gen hay

cDNA

2. ChÌn c¸c ®o¹n ADN vµo vect¬ nh©n dßng

thÝch hîp.

3. Nh©n c¸c ®o¹n ADN t¹o ra trong hÖ thèng tÕ bµo chñ (chøa vect¬ nh©n dßng t ¬ng øng) 4. Chän läc c¸c dßng cã chøa vect¬ mang ®o¹n

ADN môc tiªu.

Thiết kế thư viện mẫu cho đọc trình tự.

 Mçi mét ®o¹n ADN cµi trong mét vect¬ biÕn n¹p trong 1 tÕ bµo vi

khuÈn  S¸ch (Book)

 TËp hîp tÊt c¸c c¸c dßng vi khuÈn Th viÖn

T¹o ®o¹n ADN cã kÝch th íc phï hîp cho nh©n dßng

KÝch th íc cña ®o¹n ADN tïy thuéc vµo môc ®Ých sö dông th viÖn

§Ó lËp b¶n ®å, x¸c ®Þnh c¸c gen hay t¸ch dßng gen tõ hÖ gen cã kÝch th íc líncÇn c¸c ®oạn ADN lín vµ sö dông c¸c vect¬ nh phage, cosmid, BAC hay YAC §Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù, lËp b¶n ®å chi tiÕt... cÇn c¸c ®o¹n ADN cã kÝch th íc nhá, sö dông vect¬ nh©n dßng lµ plasmid C¸c ®o¹n ADN ph¶i cã tÝnh ngÉu nhiªn ®Ó ®¶m b¶o tÝnh ®¹i diÖn cho hÖ gen.

T¹o ®o¹n ADN cã kÝch th íc phï hîp cho nh©n dßng

 Lµm g·y nhiÔm s¾c thÓ  Cắt bằng RE

 Ở genom người dùng RE cã vïng nhËn biÕt gåm 8 Nu (Not1, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài lớn

 Thông thường dùng RE cã vïng nhËn biÕt gåm 4 Nu

 cắt kh«ng hoµn toµn (partial digest) bằng

cách sử dụng phối hợp nhiều RE

AluI, HaeIII

Bảng. Khả năng chèn đoạn ADN ngo¹i lai của một số vectơ nhân dòng

Stt

Vectơ

Plasmit

Khả năng chứa đoạn ADN(kb) <10kb

1.

Bacteriophage 9-20kb

2.

Cosmit

33-47kb

3.

BAC

100-300kb

4.

YAC 100-1000kb

5.

Trong mét th viÖn sẽ chứa bao nhiªu dßng ?

Theo lý thuyÕt:  Sè dßng tèi thiÓu cÇn thiÕt ®Ó t¹o th viÖn(n) = ®é lín cña hÖ gen (b)

®é lín TB cña ®o¹n ADN (a)

VÝ dô: thiÕt kÕ th viÖn hÖ gen cña ng êi, dïng c¸c vector kh¸c nhau: KÝch th íc genome : 3 x 109 bp

 Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases)--- > Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover one human genome (haploid human)

 Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb ---> Average insert of 17,000 bases = 1.8 x 105 clones required to cover one human genome  Cosmid = Take inserts of 35-50 kb ---> Average insert of 50,000 bases = 60,000 clones required to cover one human genome

 BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb --->

Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human genome

 YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb = 1 x 106 bases) or greater --> Average insert of 1 Mb = 3,000 clones required to cover one human genome

Trªn thùc tÕ, sè dßng sÏ lín h¬n bëi qu¸ trình c¾t vµ ghÐp vµo vector lµ ngÉu nhiªn.

 Mét sè dßng sÏ cã mÆt h¬n mét lÇn trong th viÖn do hiÖn t îng

lÆp ®o¹n

 Mét sè trình tù nµo ®ã sÏ bÞ mÊt nÕu chØ sö dông sè dßng tèi thiÓu.  Clarke and Carbon (1976) ®Ò nghÞ c«ng thøc tÝnh míi nh»m tÝnh

x¸c suÊt ®Ó mét ®o¹n ADN ® îc nh©n dßng trong mét th viÖn mÉu.

N =

ln(1-P) ln(1-a/b)

 Trong ®ã: P: x¸c xuÊt nh©n dßng mét ®o¹n DNA bÊt kú; a: kÝch

th íc ®o¹n DNA cÇn nh©n (bp), b : ®é lín hÖ gen (bp)

Câu hỏi

 Cần bao nhiêu dòng để 99 % một đoạn trình tự có mặt trong thư viện gen của người sử dụng cosmid vector?

The Central Dogma

exon

Double-stranded

DNA

intron

AAAAAAAAAAn

Precursor RNA

mRNA

Single-stranded

AAAAAAAAAAn

Reverse transcription

Protein

AAAAAAAAAAn

double-stranded

cDNA

cDNA

A cDNA or complementary DNA, is a DNA copy of an RNA, usually mRNA

mRNA

cDNA

Double stranded

Single stranded

Stable

unstable

Easy to manipulate

More difficult to manipulate

Need to be transcribed into RNA to make a protein

Can be directly used to make a protein

Kỹ thuật tạo thư viện cDNA

Khái niệm:

Bộ gen của sinh vật eukaryote thường rất lớn, tuy nhiên số

lượng gen mã hoá chỉ chiếm phần nhỏ trong tế bào

hoạt động và biểu hiện ở các mô nhất định tuỳ thuộc vào các giai đoạn sinh trưởng phát triển của cơ thể

 Chiết tách mRNA của tế bào, mô ở từng thời điểm nhất định sẽ thu được các loại mRNA khácnhau ứng với số gen đạng hoạt động trong tế bào. Sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược từ mRNA tạo nên các c DNA tương ứng, mỗi cDNA được gắn vào vector nhân dòng, tạo nên các dòng cDNA khác nhau

Trong các gen mã hoá protein, chỉ có một số gen nhất định

 Tập hợp tất cả các mRNA thu được từ một loại tế bào, ở các giai đoạn phát triển khác nhau tạo nên tập hợp cDNA được tách dòng gọi là ngân hàng cDNA của tế bào

 Tổng hợp các ngân hàng cDNA của từng loại tế bào và mô của một sơ quan ngân hàng cDNA của cơ quan đó

Sơ đồ tổng hợp cDNA

Phương pháp 1: Tạo cDNA bằng phiên mã ngược có phân huỷ hoàn toàn mRNA khuôn

Các bước tiến hành

1. Chiết tách ARN tổng số

 do các mARN đều chứa ở đầu cuối 3” một chuỗi các

gốc A (polyA) nên có thể dùng các tổ hợp oligonucleotid chỉ chứa deoxythimidin (oligodT)

 Gắn các oligodT vớimàng xelluloza và đặt trong các

phễu chiết.

 Chiết tách toàn bộ ARN rồi cho các ARN này chảy qua

phễu có gắn xelluloza-oligo (dT)

 Các mARN sẽ bị giữ lại do hình thành liên kết bổ sung

A-T

 Dùng dung dịch muối NaCl để tẩy các rARN và t ARN

ra khỏi phễu.

 Dùng dung dịch đệm Tris EDTA cho chảy qua phễu, các mARN được giải phóng do liên kết A-T bị phân giải.

2. Tổng hợp cDNA  Dùng các mARN làm khuôn với sự có mặt của enzym sao chép ngược (inverse transcriptase) cùng với các nguyên liệu (dNTP) để tổng hợp nên ADN bổ sung hay cADN sợi đơn có cấu trúc kẹp tóc.

 Dùng enzyme Rnase H (hoặc alkali) phân huỷ hoàn

toàn sợi khuôn mRNA

 Bổ sung DNA polymerase và các nucleotid tự do để tổng hơp sợ cDNA thứ 2 (phần móc cong trở thành primer cho DNA polymerase)

 Sử lý với S1 nuclease để cắt bỏ đoạn có cấu trúc kẹp tóc thu được phân tử cDNA có cấu trúc xoắn kép

3. Nhân dòng các cDNA

 Các cADN được cloning và tập hợp thành thư

 Ngân hàng cADN được thiết lập từ gen hoạt

viện cADN

động, được phiên mã thành mARN nên có tính đặc trưng cao

Qui tr×nh t¹o th viÖn cDNA

*see text page 261

Phương pháp 2: Tạo cDNA bằng kỹ thuật RACE

 RACE: (rapid amplification of cDNA ends): kỹ

thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA

 Các bước:

 Sau khi tổng hợp được cDNA sợi đơn, thuỷ phân toàn

bộ mRNA bằng Rnase H

 Nối thêm đuôi poly C vào đầu 3’ của cDNA nhờ

terminal transferase và ATP

 Bổ sung mồi oligo dG, dNTP, DNA polymerase và

thực hiện nhân PCR để tổng hợp cDNA thứ 2.

Sơ đồ tạo cDNA bằng kỹ thuật RACE

cDNA synthesis

TTTTTTTTT

First strand

Nick translation

cDNA library

So sánh thư viện cDNA library và thư viện genom

 1) Thư viện cDNA chỉ chứa trình tự được phiên mã ở

mRNA, chứ không phải toàn bộ gene. Thư viện genom thường chứa trình tự của toàn bộ gen.

2) Thư viện cDNA có thê không chứa toàn bộ gene của cơ thể. Thư viện genom cần chứa tất cả các gen của cơ thể

3) Nếu gen được biểu hiện mạnh ở một mô, thư viện cDNA có thể chứa nhiều bản sao của gen đó. Các gen không biểu hiện hoặc biểu hiện ở mức thấp có thể không có mặt trong thư viện cDNA. Thư viện genom thường chứa tất cả các dòng của gen nếu như gen đó xuất hiện nhiều trong hệ gen sinh vật.

øng dông th viÖn mÉu ®· nh©n dßng

 Cung cÊp c¸c trình tù cho ph©n tÝch, khuyªch ®¹i,

nh©n dßng vµ thÓ hiÖn gen

 ThiÕt kÕ c¸c mÉu dß, måi khi ®· biÕt trình tù ®Ó cung cÊp cho c¸c nghiªn cøu, chuÈn ®o¸n tiÕp theo (lai, blot, PCR, trÞ liÖu gen..)

 Tæng hîp ho¹t chÊt th«ng qua ®iÒu khiÓn sù thÓ hiÖn cña mét gen nµo ®ã trong tÕ bµo chñ ®Æc thï.

øng dông th viÖn cDNA

 X¸c ®Þnh trình tù c¸c baz¬ vµ ph©n tÝch

gen

 ThiÕt kÕ c¸c mÉu dß cho c¸c gen môc tiªu

trªn nhiÔm s¾c thÓ

 nghiªn cøu sù thÓ hiÖn cña gen  Tæng hîp protein nh©n t¹o