Bài giảng Dược lý 3: Dược lý phân tử và kỹ thuật xác định kiểu gen

DƯỢC LÝ PHÂN TỬ

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH KIỂU GEN

GV. Mai Thị Thanh Thường

1. Ý NGHĨA

Sự bùng phát của các bệnh truyền nhiễm thường xuất

phát từ việc tiếp xúc với một nguồn lây chung của tác nhân

gây bệnh.

Tác nhân gây dịch có “quan hệ dòng”, hay nói cách khác

chúng có cùng  có chung các thuộc tính sinh hóa, yếu tố

độc lực và đặc tính di truyền.

Sự đa dạng ở mức loài đủ để các vi sinh vật phân lập

được từ các nguồn khác nhau, ở thời gian khác nhau và vị trí

địa lý khác nhau có thể được phân biệt hay phân loại thành

các typ hay chủng.

1. Ý NGHĨA

Việc định typ có ý nghĩa quan trọng trong dịch tể học để

nhân trong bệnh viện, nhận diện các chủng có độc lực đặc

nhận biết cơn dịch, phát hiện sự lây truyên chéo của tác

Từ thời của Pasteur, các tiếp cận dịch tể học liên quan

biệt và theo dõi các chương trình tiêm chủng.

vào các phương pháp kiểu hình hay kiểu sinh học (nhuộm

đến việc định typ và phân biệt các vi khuân đều dựa chủ yếu

Gram), bị ảnh hưởng:

+ Các thay đổi trong điều kiện nuôi cấy

+ Sự thiếu hụt một số đặc tính kiểu hình

+ Sự hội tụ tiến hóa giữa các đặc tính

1. Ý NGHĨA

Ngày nay định typ và phân biệt VK bằng việc so sánh

trình tự của 16S rADN.

Chủng: thường được hiểu trong ngữ cảnh của sự đa

dạng về nucleotid không đặc hiệu có liên quan đến một số

kiểu hình (ví dụ tính trạng về khả năng gây bệnh).

2. TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT  Tất cả các vi sinh vật trong một loài đều phải có thể định typ

được bằng phương pháp được chọn.

+ Typ huyết thanh được gán cho chủng chỉ khi có sự hiện diện của các

dấu hiệu huyết thanh học cụ thể nào đó. Ví dụ, 10 - 15% các chủng

Mycobacterium avium không thê định typ huyết thanh được vì chúng

không phản ứng với bất kỳ kháng huyết thanh nào hiện có.

+Tương tự, typ thực khuẩn cũng thường được dùng cho Staphylococcus

aureus, S. aureus không có thụ thể của thực khuẩn thì không thể bị nhiễm

được và do đó không thể định typ được.

Tuy nhiên đối với 1 số PP thì không, Ví dụ: dựa vào kháng thê hay sự hiện diện của thụ thể thực khuẩn, thì các đặc tính này có thể không có trong tất cả các chủng của loài.

2. TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT

 Các phương pháp định typ phải có khả năng phân biệt cao.

Nó phải có khả năng phân biệt rõ ràng các chủng không có

liên quan.

Ví dụ các chủng có nguồn gốc địa lý hoàn tọàn khác, đồng

thời phải chứng minh được quan hệ của các chủng được

phân lập từ cùng một nguồn gốc.

2. TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT

 Độ lặp lại

+ Đặc biệt quan trọng khi xây dựng cơ sở dữ liệu của các

chúng đã biết dùng so sánh với các chủng chưa biết.

+ Sự biểu hiện kiểu hình không ổn định, ví dụ biểu hiện gen

 Tính dễ dùng và giá thành của phương pháp

độc lực không liên tục, có thể gây khó khăn cho việc lặp lại

2. TIÊU CHÍ CỦA MỘT PP ĐỊNH TYP TỐT

 Các phương pháp định typ dựa trên kiểu hình nói chung

 Các phương pháp dựa trên trình tự ADN hay kiểu gen cho

không đáp ứng được hết các yêu cầu trên

phép khắc phục các yếu điểm này:

+ Tránh được nhu cầu về môi trường nuôi cấy

+ Tăng độ nhạy và độ ổn định của các thử nghiệm

+ Rút ngắn thời gian

 Việc định typ phân tử xuất phát từ dấu ấn ADN hay trình tự

nuclceotid thu được nhiều thông tin.

3. PHÂN LOẠI PP ĐỊNH TYP PHÂN TỬ

 Các phương pháp định typ phân tử có thể được chia làm ba

nhóm:

a) Phân tích dấu ấn nhiễm sắc thể sử dụng kỹ thuật

khuếch đại gen

b) Cắt giới hạn nhiễm sắc thể vi khuẩn

c) Khuếch đại một gen và phân tích trình tự

4. LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ

 Việc phân tích chủng từ các trình tự nucleotid hiện đã đủ mạnh để phân biệt các vi khuẩn cụ thể, khi phối hợp với PCR một đoạn gen với định trình tự tự động, nó có thể cung cấp thông tin chi tiết về kiểu gen một cách nhanh chóng.

+ Các trình tự ADN ribosom đã đươc chứng minh là hữu hiệu trong việc phân biệt các nhánh sinh loài của các họ vi khuẩn có quan hệ xa.

+ Các trình tự rARN của tiểu đơn vị nhỏ, đã được chứng minh rất hữu hiệu các quan hệ tiến hóa trong ngành khuẩn lam.

4. LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ

 Có nhiều yếu tố bên trong các gen mã hóa của vi khuẩn có thể dẫn đến việc xem xét chúng hữu dụng như là dấu chỉ phân tử để phân biệt chủng:

a) Mức độ biến thiên của trình tự nucleotid vượt xa các trình tự rADN tiểu đơn vị nhỏ và lớn.

b) Protein được mã hóa có chức năng được bảo tồn xuyên suốt trong nhiều chi, chứng tỏ gen sẽ toàn vẹn trong các loài có liên hệ xa.

c) Vị trí vật lý của gen trên nhiễm sắc thể vi khuẩn chứng tỏ có sự điều hưởng giữa các đơn vị phân loại khác xa nhau.

4. LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ

 Việc sử dụng các đoạn dò phân tử và các locus nhiễm sắc thể khác nhau để phác họa kiểu gen của vi khuẩn có thể phát sinh sai sót.

 Gen được sử dụng để phân biệt loài này có thể không chứa trình tự biến thiên cần thiêt để phân biệt với các chủng của một loài không liên quan khác.

 Việc xác định hiệu quả định typ thực nghiệm đối với một đơn vị phân loại cụ thể đôi khi rất tốn kém về thời gian và tiền bạc.

 Đặc tính siêu nhạy của các kỹ thuật định typ phân tử, nhất là các kỹ thuật có liên quan đến PCR, làm cho việc phòng tránh ngoại nhiễm trở thành một vấn đề lớn.

Nhược điểm của phương pháp phân tử

4. LỰA CHỌN GEN ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PP PHÂN TỬ

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐANG ĐƯỢC ỨNG DỤNG

 Dấu ấn dựa trên PCR của nhiễm sắc thể vi khuẩn

 Các phương pháp cắt giới hạn bộ gen

 Định trình tự DNA

5. PHƯƠNG PHÁP PCR

KỸ THUẬT CHUNG

Có nhiều phương pháp để làm dấu ấn bộ gen vi khuẩn dựa

 Phân tích dấu ấn bằng PCR mồi lặp, rep-PCR, dựa vào một

trên phản ứng khuếch đại.

số nhóm trình tự được bảo tồn của các yếu tố ADN lặp

phân tích VNTR ở nhân thật, các oligonucleotid được Sử

được phân bố trong nhiễm sắc thể vi khuẩn. Tương tự như

dụng trong rep-PCR phát hiện sự đa hình kích thước bằng

cách khuếch đại các vùng nhiễm sắc thể nằm giữa các yếu

tố lặp. Bằng cách này, sơ đồ các mảnh khuếch đại làm một

hàm số của vị trí vật lý của yếu tố lặp trên nhiêm sắc thể.

5. PHƯƠNG PHÁP PCR

 Phân tích PCR của vùng xen giữa 16S và 23S, “ribotyp”, cũng cho thông tin về kiểu gen của chủng dưới dạng sự đa hình kích thước. Mỗi oligonucleotid được thiết kế từ đâu 3’ của 16S rADN và đầu 5’ của 23S rADN để khuếch đại vùng xen giữa (IGS) hai tiểu đơn vị rARN.

 Phân tích ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD- PCR), sử dụng phản ứng khuêch đại các phần bất kỳ của ADN nhiễm sắc thể nhờ một hay nhiều đoạn mồi tùy ý ngắn. Phân tích trên gel agarose cho một phổ các sản phẩm khuếch đại thường đặc trưng cho một chủng cụ thể.

KỸ THUẬT CHUNG

tạo ra một hỗn hợp các mảnh ADN có chiêu dài khác nhau.

cuối các mảnh ADN trên. Các đoạn môi đặc hiệu với đoạn

Các đoạn nôi oligonucleotid Sợi đôi lúc này được nối vào

nối với các nucleotid chọn lọc 3’ khác nhau được dùng đê

PCR ở chổ bước khuếch đại không hoàn toàn ngẫu nhiên

khuêch đại một Sô mảnh từ hỗn hợp. AFLP khác với RAPD-

và khác với REP-PCR ở chổ nó không dựa vào trình tự

chung đã biêt của vi khuân. Nói cách khác, AFLP dựa vào

sự khuếch đại chọn lọc một phần các mảnh có trình tự

tương đồng với mồi PCR.

5. PHƯƠNG PHÁP PCR

 Sự đa hình chiều dài đoạn khuếch đại (AFLP) là một kỹ thuật hiệu quả khác để phân biệt các chủng vi khuẩn có liên quan gần dựa trên PCR. AFLP khuếch đại ADN sau khi đã cắt với enzym giới hạn.

 ADN vi khuẩn được cắt trước với enzym giới hạn (ví dụ EcoRI và MseI) tạo ra một hỗn hợp các mảnh ADN có chiều dài khác nhau. Các đoạn nối oligonucleotid Sợi đôi lúc này được nối vào cuối các mảnh ADN trên. Các đoạn mồii đặc hiệu với đoạn nối với các nucleotid chọn lọc 3’ khác nhau được dùng để khuếch đại một số mảnh từ hỗn hợp. AFLP khác với RAPD-PCR ở chổ bước khuếch đại không hoàn toàn ngẫu nhiên và khác với REP-PCR ở chổ nó không dựa vào trình tự chung đã biêt của vi khuân. Nói cách khác, AFLP dựa vào sự khuếch đại chọn lọc một phần các mảnh có trình tự tương đồng với mồi PCR.

KỸ THUẬT CHUNG

5. PHƯƠNG PHÁP PCR

KỸ THUẬT CHUNG

 Sự đa hình chiều dài đoạn khuếch đại (AFLP) là một kỹ thuật hiệu quả khác đê phân biệt các chủng vi khuẩn có liên quan gần dựa trên PCR. AFLP khuêch đại ADN sau khi đã căt với enzym giới hạn. Một cách vắn tắt, ADN vi khuẩn được cắt trước với enzym giới hạn (ví dụ EcoRI và MseI) tạo ra một hỗn hợp các mảnh ADN có chiêu dài khác nhau. Các đoạn nối oligonucleotid Sợi đôi lúc này được nối vào cuối các mảnh ADN trên. Các đoạn môi đặc hiệu với đoạn nối với các nucleotid chọn lọc 3’ khác nhau được dùng đê khuêch đại một Sô mảnh từ hỗn hợp. AFLP khác với RAPD- PCR ở chổ bước khuếch đại không hoàn toàn ngẫu nhiên và khác với REP-PCR ở chổ nó không dựa vào trình tự chung đã biêt của vi khuân. Nói cách khác, AFLP dựa vào sự khuếch đại chọn lọc một phần các mảnh có trình tự tương đồng với mồi PCR.