Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền

Chia sẻ: Cvcxbv Cvcxbv | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:44

Thêm vào BST

Báo xấu

646
lượt xem 106
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền là tài liệu hướng dẫn kỹ thuật, giáo trình này đương nhiên giới thiệu các bước kỹ thuật thường được thực hiện trong di truyền và sinh học phân tử. Nhưng quan trọng hơn vẫn là thông qua các bước kỹ thuật cụ thể giúp người học nắm được những điểm cơ bản về nghiên cứu phát triển sinh học phân tử được các nhà nghiên cứu nhiều thế hệ sáng tạo và thực hiện trong quá khứ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền

Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền LỜI MỞ ĐẦU Đây là tài liệu hướng dẫn kỹ thuật, giáo trình này đương nhiên giới thiệu các bước kỹ thuật thường được thực hiện trong di truyền và sinh học phân tử. Nhưng quan trọng hơn vẫn là thông qua các bước kỹ thuật cụ thể giúp người học nắm được những điểm cơ bản về nghiên cứu phát triển sinh học phân tử được các nhà nghiên cứu nhiều thế hệ sáng tạo và thực hiện trong quá khứ. Nhờ những kết quả nghiên cứu đó, chúng tôi đã vẽ lại bức tranh toàn cảnh về thế giới như đã được khái quát hóa trong nhiều tài liệu sinh học và các thí nghiệm thực hành. Mong muốn của người biên soạn là người học nắm được những điểm cốt yếu của kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử. Trên cơ sở đó phát triển những kỹ thuật sẽ cải tiến những bước hoặc quy trình cho phù hợp với thực tiễn nghiên cứu. Với những yêu cầu cao bao quát cả lịch sử phát triển lẫn cập nhật hóa kiến thức, việc biên soạn một giáo trình thực hành về lĩnh vực này gặp rất nhiều khó khăn. Tuy vậy, chúng tôi cố gắng đưa vào tài liệu này những vấn đề liên quan đến thực hành sinh học phân tử chọn lọc từ những thành quả mà nhiều nhà nghiên cứu đã mô tả trong nhiều bài báo chuyên ngành liên quan sinh học, một số thuyết trình hướng dẫn của một số hướng cung cấp thiết bị nghiên cứu sinh học cũng như từ kinh nghiệm cá nhân. Nhiều kỹ thuật và "thực đơn" cụ thể giới thiệu trong tài liệu này rất cũ nhằm giúp người học tránh những quan niệm đơn giản hóa con đường nghiên cứu khoa học. Những "thực đơn" mới liên quan được giới thiệu nhiều khi ở dưới dạng khái quát. Người học cần lưu ý rằng hầu như tất cả những "thực đơn" được đưa ra đều là kết quả của kinh nghiệm nghiên cứu và suy luận khoa học của cá nhân trong quá trình "tối ưu hóa". Vì vậy, người làm thí nghiệm có thể cải tiến để có kết quả tốt hơn phù hợp điều kiện của mình. Khó khăn khác mà việc biên soạn gặp phải là yêu cầu dung lượng giáo trình trong 60 tiết hạn chế số lượng trang in cũng như các kỹ thuật được chọn lọc. Để bù lại, học viên cần tìm nhiều nội dung bổ trợ trong các giáo trình lý thuyết liên quan trong bộ sách này, như "Nhập môn sinh học phân tử", "Công nghệ sinh học", "Công nghệ DNA tái tổ hợp", "Công nghệ chuyển gen động vật, thực vật" và "Công nghệ protein"... Tuy nhiên, các kỹ thuật được giới thiệu cũng không thể tránh khỏi sự buồn tẻ của các thử nghiệm, tuyển chọn kết quả thử nghiệm, sàng lọc sản phẩm, dùng sản phẩm này làm nguyên liệu cho các thử nghiệm tiếp theo...Bên cạnh đó, dù được chuẩn bị khá kỹ càng, chúng tôi không tránh khỏi sai sót, rất mong được nhận sự góp ý xây dựng của các đồng nghiệp và người đọc. BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHOA CNSH & KTMT Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 1
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 1: MỘT SỐ THIẾT BỊ THÔNG DỤNG VÀ CÁC THAO TÁC CƠ BẢN I – MÔ TẢ VÀ CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM Ngoài các dụng cụ thường dùng cho các thao tác vi sinh, sinh hoá như dụng cụ thuỷ tinh (Ống nghiệm, ống hút, becher, đĩa petri…), que cấy, giá đỡ ống nghiệm…, trong thao tác sinh học phân tử, người ta còn sử dụng một số dụng cụ đặc trưng sau: - Ống eppendorf: là loại ống nghiệm bằng nhựa polythylene hay polypropylene, dùng để chứa những thể tích dung dịch nhỏ. Có nhiều cỡ thể tích 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2ml. Các eppendorf có thể được hấp khử trùng ở điều kiện thông thường (1atm, 1200C, 20 phút), chịu được nhiệt độ thấp (-200C) và các dung môi hữu cơ như chloroform…Trong những thí nghiệm cần độ an toàn cao, tránh sự thất thoát mẫu chứa, người ta sử dụng eppendorf có ngấn an toàn. - Micropipette (pipetman): là dụng cụ dùng để thu nhận những thể tích nhỏ, cần độ chính xác cao; thường đựơc chia thành 4 cỡ tuỳ theo thể tích dung dịch tối đa cho mỗi lần hút: + Cỡ nhỏ: thể tích tối đa 10l - 20l - 50l (0,5 -10l hoặc 5 – 50l) + Cỡ trung bình: thể tích tối đa 100l - 200l (10-100 l hoặc 20-200l) + Cỡ lớn: thể tích tối đa 1000l (100-1000l) + Cỡ rất lớn: thể tích tối đa 5000l (ít sử dụng) * Lưu ý: Cần thận trọng khi hút các dung môi hữu cơ, không để gần nguồn nhiệt (đèn cồn), không hấp khử trùng (trừ khi có chỉ định cảu hãng sản xuất), tuyệt đối không điều chỉnh dưới ngưỡng tối thiểu và trên ngưỡng tối đa cho phép. - Các micropipette luôn luôn được sử dụng với các đầu tip. Các típ này thường chỉ được sử dụng 1 lần và cũng gồm 4 loại tương ứng với 4 kích cỡ đã nêu. Các típ được tiệt trùng bằng hấp khử trùng ở điều kiện thông thường. II – MỘT SỐ NGUYÊN TẮC PHA HÓA CHẤT Hoá chất được pha với nước cất hai lần và khử trùng ở điều kiện thông thường. Đối với một số hoá chất không thể thanh trùng bằng nhiệt, việc thanh trùng được tiến hành với những phin lọc có đường kính lỗ lọc là 0,2l hoặc 0,45l Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 2
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Các dung dịch thường được pha và bảo quản dưới dạng đậm đặc (dung dịch mẹ). Dung dịch mẹ được loãng với nước cất hai lần khử trùng để đạt nồng độ cần mỗi lần sử dụng. Dung dịch đã pha có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, ở nhiệt độ 4 C hoặc nhiệt độ lạnh sâu -200C theo khuyến cáo cho từng loại hoá chất. Dung 0 dịch bảo quản ở -200C thường đựơc phân thành những phân đoạn nhỏ. Mỗi lần sử dụng chỉ cần giải đông một phân đoạn. Lưu ý: Các loại hoá chất dùng trong thao tác với acide ribonucleic thường được để riêng, không lẫn lộn với loại hoá chất dùng cho các mục khác. Người thao tác phải mang găng tay khi tiếp xúc với các bình chứa hoá chất. Trong lúc thực hiện thao tác cân, tuyệt đối không dùng dụng cụ múc mà trút trực tiếp vào bình chứa hoặc giấy bạc Chuẩn bị các dung dịch gốc Dung dịch đệm khác nhau trong đó có dung dịch đệm sử dụng cho điện di... nên chế thành dung dịch gốc có nồng độ cao để khi cần thì pha loãng hay hỗn hợp rất tiện lợi. Dưới đây là một số dung dịch nên pha sẵn ở dạng dung dịch gốc. 1) Tris-HCl 2M (pH 7,5): 121,1 g/500 ml, hoặc 1M: 121,1 g/1.000 ml. Trizma- base (của Sigma...) khi cần điều chỉnh pH cần phải thêm lượng lớn HCl, vì vậy khi đó nhiệt độ dung dịch tăng lên. Khi nhiệt độ tăng pH của dung dịch giảm, khi nhiệt độ giảm pH dung dịch tăng. Cho nên cần điều chỉnh pH đến gần mức cần thiết (pH 7,5), để nguội đến nhiệt độ phòng rồi điều chỉnh pH cho đúng. Sau đó cần hấp cao áp tiệt trùng. 2) NaCl 5M: 146,1 g/500 ml nước cất. Hấp cao áp tiệt trùng. 3) EDTA 0,5M (pH 8,0): pha 93,05 g Na2EDTA.2H2O vào trong khoảng 400 ml nước cất, vừa khuấy vừa thêm NaOH tinh thể để đạt đến pH 8,0 rồi thêm nước cho đủ 500 ml. Nếu pH không đạt đến gần 8,0 th. ở nhiệt độ ph.ng EDTA không tan. Hấp cao áp tiệt trùng. 4) SDS 10% hoặc SDS 20%: h.a tan SDS trong nước cất ở 65oC sau 1 giờ xử lý, lọc qua lọc vi khuẩn tiệt trùng. 5) SSC 20× (standard saline citrate đậm 20 lần): NaCl 175,3 g, sodium citrate 88,2 g, pha nước cho đủ 1 lít, chỉnh bằng NaOH 0,1N hoặc HCl 0,1N đến pH 7,0. Hấp cao áp tiệt trùng. (SSC 1× là dung dịch NaCl 0,15M với sodium citrate 0,015M). 6) MgCl2 1M: h.a tan 20,3 g MgCl2.6H2O vào 100 ml nước. Lọc khử trùng. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 3
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 7) NaOH 10N: 200 g/500 ml. Bảo quản trong lọ chất dẻo. 8) DTT (dithiothreitol) 1M: 3,09 g/20 ml hoặc DTT 0,5M: 3,09 g/40 ml. Lọc khử trùng. Chia nhỏ ra ống 0,5 ~ 1 ml bảo quản ở −20 ºC. 9) Nucleotide triphosphate: chế thành dung dịch bảo tồn 10 ~ 100 mM, pha nước để thành dung dịch có lượng nhiều hơn lượng cần dùng chút ít. Dung dịch này có tính acid nên cần thêm bột Tris-base cho đến pH trung tính bằng cách kiểm tra giấy đo pH. Lấy một phần kiểm tra OD ở bước sóng có độ hấp thụ cực đại để điều chỉnh nồng độ chính xác. Các nucleotide có bước sóng hấp thụ cực đại như bảng sau: Bảo quản ở −20 ºC. 10) TBE 20×: Tris 121,1 g, Na3EDTA.3H2O 8,2 g, boric acid 60 g, pha nước cho đủ 1 lít, pH sẽ khoảng 8,2. Không cần điều chỉnh pH. Lượng trên tương ứng với: 1 M Tris, 20 mM Na3EDTA và 0,97 M boric acid. Dung dịch này dùng cho điện di gel polyacrylamide. 11) Howly 20×: Tris 96,9 g, trisodium acetate 54,4 g, Na3EDTA.3H2O 3,7 g. Điều chỉnh pH bằng acetic acid. Hấp cao áp diệt trùng. (Tương đương: 0,8 M Tris- acetate (pH 7,8), 0,4 M sodium acetate, 20 mM EDTA). 12) Sodium acetate 3M (pH 5,2): trisodium acetate 81,62 g, pha vào 200 ml nước. Dung dịch sẽ có độ pH 5,2. III- MỘT SỐ THIỆT BỊ THÔNG DỤNG 1 – Máy lắc ổn nhiệt: được sử dụng cho các phản ứng cần nhiện độ ổn định (phản ứng enzyme, lai…). Máy bao gồm một bể nước có nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc 2 – Tủ cấy vô trùng: được sử dụng khi cần thao tác trong điều kiện vô trùng. Tủ cấy phải luôn được giữ sạch, giữ cho bề mặt khu vực thí nghiệm bằng cách khử trùng bằng cồn 70o. Trước và sau khi sử dụng, phải thanh trùng bên trong tủ bằng cách bật đèn tử ngoại trong ít nhất 15 phút. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 4
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 3- Máy li tâm: dùng để phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong một dung dịch và được điều chỉnh ở các mức độ ly tâm khác nhau tùy theo mong muốn của người sử dụng. Nguyên tắc: Sự phân tách các phần tử khác nhau trong một dung dịch được thực hiện dựa trên vận tốc lắng khác nhau của chúng dưới tác động của một lực li tâm. Tuỳ thuộc vào đặc điểm dùng để phân tách (khối lượng hay tỉ trọng của các phần tử vật chất) mà người ta chia làm hai loại: Li tâm phân đoạn và li tâm đẳng tỉ trọng. Li tâm phân đoạn (li tâm vùng) Phương pháp này cho phép phân tách các phần tử vật chất dựa vàokhối lượng của chúng. Các phần tử vật chất sẽ di chuyển về phía đáy ống li tâm với vận tốc tuỳ thuộc lực li tâm và sự ma sát giữa chúng với dung dịch li tâm tức tuỳ thuộc vào hình dạng các phần tử). Như vậy trong li tâm vùng, để thu nhận một loại phần tử vật chất nhất định cần sử dụng một lực li tâm và thời gian li tâm nhất định phù hợp Li tâm đẳng tỉ trọng Đây là phương pháp phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỉ trọng giữa chúng. Phương pháp này cho hiệu quả phân tách ất cao, các phân đoạn được phân tách rất thuần khiết. Ống li tâm chứa một dung dịch cótỉtrọng tăng dần từ miệng đến ống tạo nên một gradient tỉ trọng. Tỉ trọng của các phần tử cần phân tách phải nằm trong vùng gradient tỉ trọng này. Trong quá trình li tâm, các phần tử vật chất sẽ lắng xuống đáy ống, khi đến vùng dung dịch có tỉ trọng tương đương, phân tử sẽ dừng lại do đã đạt trạng thái cân bằng. Trạng thái này không thay đổi dù tăng thời gian hay lực li tâm. Các loại phân tử thường được dùng để thiết lập gradient tỉ trọng là Saccharose hay Glycerol khi cần phân đoạn các bào qua, Cesium chloride (CsCl) khi cần phân tách protein và nucleic acide. IV- THỰC HÀNH Sinh viên quan sát các thiết bị, tập cách sử dụng micropipette, các thiết bị cần thiết cho việc thí nghiệm và ghi nhớ các công thức pha chế dung dịch mẹ. V – YÊU CẦU Sinh viên có khả năng sử dụng thành thạo, đúng quy cách, yêu cầu và mục đích từng loại hoá chất, dụng cụ, thiết bị trong các quá trình thực hành sau này. Chụp hình các dụng cụ, thiết bị dùng trong thực hành các kỹ thuật di truyền và vận dụng thành thạo từng dụng cụ & thiết bị trong kỹ thuật di truyền. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 5
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 2 : TÁCH CHIẾT DNA THEO PHƢƠNG PHÁP BOOM I –NGUYÊN TẮC: Việc thu nhận DNA từ mô gan được tiến hành thông qua nhiều bước. Phân đoạn nhân được cô lập trong bước thứ nhất và DNA được tách chiếttrong bước thứ hai chủ yếu dựa trên kỹ thuật li tâm vùng. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân (2) Loại protein (3) Tủa DNA Phá màng tế bào và màng nhân Mô gan thường được sử dụng làm vật liệu để cô lập nhân và tách chiết DNA vì tế bào gan tương đối đồng nhất về kích thước, thích hợp cho việc phân đoạn kỹ thuật li tâm. Người tacó thể phá màng tế bào bằng phương pháp hoá học, cơ học hay siêu âm. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, tế bào được phá vỡ trong những điều kiện gần với điều kiện sinh lý bình thường (dung dịch đẳng trưởng, pH sinh lý, sự hiện diện của một số Ion…). Huyền phù tế bào trong môi trường vừa kể có tên là dịch đồng nhất (homogenate). Dịch đồng nhất được phân đoạn qua li tâm, các bào qua sẽ được phân tách dựa vào khối lượng của chúng. Loại protein Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần nhiễm, mà quan trọngnhất là Protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hoà tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acide / protein) trong hai pha không hoà tan Phenol, chloroform). Một số tác nhân tách chiết thông dụng là: (1) Phenol: một chất biến tính protein mạnh, không hoà tan nucleic acid (2) Chloroform: thường đi kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol, chloroform cũng làm tan biến tính protein nhưng yếu hơnphennol; isoamylaclohol làm giảm bọt , ổn định hai pha nước và chloroform sau li tâm (3) Isobutanol: có hai công dụng là tách các phân tử hữu cơ như ethidium bromide và làm đậm dung dịch nucleic acid Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 6
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền (4) Cũng có thể tóm bắt Nucleic Acid bằng các hạt Celite mà không cần bắt các protein biến tính Kết tủa DNA (DNA precipitation) Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid được tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với li tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hoà lại trong nước tho nồgn độ mong muốn. Có các kiểu chính: - Tủa bằng ethanol: được thực hiện ở nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao (2-2,5 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa). Nhiệt độ thấp thúc đẩy sự tủa - Tủa bằng isopropanol: khác với kiểu tủa trên là không cần muối, có thể sử dụng 0,8 – 1 thể tích isopropanol/thể tích dung dịch cần tủa. Những đoạn DNA thật ngắn dù ở nồng độ cao cũng không tủa bằng cách này nên có thể dễ dàng loại chúng II- DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT 1 – Hoá chất  Dung dịch Diatom - Nước cất - HCl đđ - Hạt celite (diatom)  Dung dịch đệm li giải L6 - Guanidine thyocynate - Tris HCl - EDTA - Triton X-100 (hoac SDS 10%)  Dung dịch đệm rửa L2 - Guanidine thyocynate - Tris HCl  Triton X -100  SDS 10%  Chloroform: isoamylalchohol (24:1)  Dung dịch TE 10X (Tris 0,1M – EDTA 0,001M)  Ethanol tuyệt đối  Ethanol 70% Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 7
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền  Dung dịch acétol 2 – Vật liệu và dụng cụ  Mô động vật  Eppendorf 1,5ml  Eppendorf 2ml  Pipetman các loại 20l – 100l, 200l - 1000l đầu típ tương ứng  Pipette pasteur  Que thuỷ tinh đầu uốn cong  Ống nghiệm thuỷ tinh  Cốc đựng đá  Cốc đựng típ và chất thải  Vải lược, dao cắt  Máy nghiền  Máy li tâm Mỗi nhóm chuẩn bị 2 Eppendorf 1.5ml chứa: - Dung dịch L6 900l - Dung dịch diatom 20 l - Huyết thanh hoặc mẫu mô 100l III – PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Tiến hành theo các bước sau Bƣớc 1 Nhóm trực cân 30g mẫu mô động vật bổ sung 70ml nước cất, nghiền nhỏ và làm lạnh trong đá. Dùng vải lọc để lọc phần nghiền để thu dịch đồng nhất và tiếp tục được giữ lạnh trong đá Bƣớc 2 Mỗi nhóm bổ sung vào eppendorf 1.5 (chứa L6 và Diatom) 100l dịch đồng nhất, tiến hành vortex trong 10 phút sau đó ly tâm 13.000vòng/phút trong 20 giây Bƣớc 3 Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 8
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Hút bỏ phần dịch nổi và chừa khoảng 100l phần dịch cặn. Bổ sung 1ml dd L2, đem ly tâm 13.000vòng/phút trong 10 giây. Tiếp tục lặp lại bước 3 thêm hai lần nữa. Bƣớc 4 Rửa bằng 1ml ethanol 70% (thao tác tương tự bước 3) 2 lần. Rửa 1 lần bằng 1ml acétone. Sau đó hút bỏ acétone và để khô tự nhiên. Bƣớc 5 Bổ sung 60l dd TE 1X đem Vortex 10 phút; sau đó ly tâm tiếp 13.000vòng/phút trong 20 giây. Hút 200l phần dịch nổi (chứa ADN) qua 1eppendorf khác và bảo quản lạnh. IV – YÊU CẦU Mỗi nhóm thu nhận DNA vào một eppendorf sạch có ghi tên nhóm, lưu trữ để làm nguyên liệu cho bài sau V - TRẢ LỜI CÂU HỎI 1. Nêu các vai trò và cấu tạo của các hóa chất dùng trong bài như dung dịch L2, L6 hay Diatom? 2. Giải thích tại sao lại sử dụng L2, L6 hay Diatom trong việc tách chiết DNA? 3. Có thể thay thế mẫu gan bò thành các mẫu nguyên liệu khác không như mẫu tóc, mẫu da hay mẫu máu ở người? 4. Mục đích của việc ly tâm hay vortex nhiều lần là gì? 5. Nêu vai trò và tác dụng của ethanol và acetone trong tách chiết DNA. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 9
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 3 : TÁCH CHIẾT RNA TOÀN PHẦN CỦA VI KHUẨN I –NGUYÊN TẮC: Việc tách chiết RNA cũng gồm những bước cơ bản như tách chiết DNA : (1) Phá màng tế bào (2) Loại protein (3) Tủa RNA Nhưng RNA là phân tử dễ bị thuỷ giải bởi RNase, khó bảo quản nguyên vẹn trong quá trình tách chiết nên trong thao tác cần tuân thủmột số nguyên tắc chung : - Sử dụng một số chất có kả năng biến tính Rnase, thông dụng nhất là guanidinium thiocyanate. Nước được sử dụng thường được xử lý với DEPC (Diethlpyrocarbonate) để loại Rnase - Sử dụng phenol pH 4.0 để ức chế RNase, loại protein và DNA - Thao tác trong điều kiện nghiêm ngặt tối đa: lạnh, mang găng tay, thao tác trong tủ cấy vô trùng… Trong bài này, phenol và guanidinium thiocyanate có trong thành phần dd Trizol là những chất biến tính protein mạnh. Khi xử lý với hai hoá chất này, tế bào vi khuẩn sẽ phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein…Sau khi li tâm, dung dịch vi khuẩn xử lý với Trizol sẽ phân tách thành hai lớp: lớp dưới là phenol chứa DNA, lớp trên là nứơc chứa RNA. Phần protein bị biến tính sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ cùng với DNA trong pha phenol. Ngoài tác dụng biến tính protein, phenol ở pH 4.0 còn có tác dụng hấp thụ DNA vào pha phenol. Vì vậy, phần dịch nổi ở trên chỉ còn chứa RNA. RNA sẽ thu nhận bằng cách tủa với isopropanol lạnh. Phương pháp tách chiết RNA này cho phép thu nhận RNA toàn phần có chất lượng đủ đảm bảo cho các thao tác sinh học phân tử tiếp theo. II- DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT 1 – Hoá chất  Dung dịch phenol 4 pH  Ethanol 70% bảo quản lạnh Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 10
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền  Potasium acétate 5% 2 – Vật liệu và dụng cụ  Vi khuẩn E.Coli hoặc nấm men  Eppendorf 1,5ml  Eppendorf 2ml  Pipetman các loại 20l – 100l, 200l - 1000l đầu típ tương ứng  Pipette pasteur  Ống nghiệm thuỷ tinh  Cốc đựng đá  Cốc đựng típ và chất thải  Vải lược, dao cắt  Máy nghiền  Máy li tâm Mỗi nhóm chuẩn bị 2 Eppendorf 1.5ml chứa: - Dung dịch phenol 600l III – PHÖÔNG PHAÙP TIEÁN HAØNH Tiến hành theo các bước sau: Bƣớc 1 Nhóm trực cân 30g mẫu men, bổ sung 70ml nước cất, nghiền nhỏ. Dùng vải lọc để lọc phần nghiền để thu dịch đồng nhất. Bƣớc 2 Mỗi nhóm bổ sung vào eppendorf 1.5 thêm 100l dịch đồng nhất, tiến hành vortex trong 10 phút sau đó ly tâm 5.000vòng/phút trong 10phút. Bƣớc 3 Hút phần dịch nổi khoảng 500l. Đem ly tâm 7.000vòng/phút trong 10 phút. Bƣớc 4 Thu 400l dịch nổi vào Eppendorf khác, bổ sung 100l potassium acétat 5% và 500l ethanol lạnh.Vortex 10 phút (ủ lạnh và vortex gián đoạn). Ly tâm 7000vòng/phút trong 15 phút. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 11
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bƣớc 5 Hút bỏ dịch nổi, bảo quản lạnh âm. IV – YÊU CẦU Mỗi nhóm thu nhận RNA vào một eppendorf sạch có ghi tên nhóm, lưu trữ để làm nguyên liệu cho bài sau. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 12
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 4 ĐỊNH LƢỢNG NUCLEIC ACID BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG I - NGUYÊN TẮC Ánh sáng khi đi qua môi trường lỏng sẽ bị các phần tử vật chất trong môi trường đó hấp thu một phần. sự hấp thu ánh sáng gia tăng khi nồng độ các phần tử vật chất trong môi trường đó gia tăng. Dựa vào nguyên lý trên người ta có thể đo nồng độ các phần tử vật chất trong môi trường lỏng thông qua mối quan hệ giữa cường độ ánh sáng trước và sau khi đi qua môi trường. Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tuỳ thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ : đỉnh hấp thụ các nucleic acid là ở 260nm trong vùng tử ngoại. sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Sự hấp thụ ở dây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Một đơn vị đơn vị hệ số chuyển đổi OD tương ứng với : - 50g/ml DNA sợi đôi - 40g/ml DNA sợi đơn hay RNA Từ giá trị OD đo được, người ta có thể suy ra nồng độ nucleic acid của dung dịch. C (mg/ml) = A260. k .n C: nồng độ ADN, ARN A260: trị số OD đo được k: đơn vị hệ số chuyển đổi n: số lần pha loãng Bên cạnh đó, người ta còn tính tỷ lệ OD260/OD280 để ước lượng độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2 dung dịch nucleic acid được xem là tinh sạch. Nếu nhiễm protein hay phenol, tỉ lệ này sẽ thấp hơn nhiều khi đó việc định lương nucleic acid bằng mật độ quang sẽ không còn chính xác. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 13
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Đối với dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thụ bước sóng 260nm tăng lên khi phân tử DNA bị biến tính tức là khi hai sợi đơn tách rời nhau. Người ta gọi đó là hiệu quả siêu sắc. II- DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT 1- Hoá chất: Nước cất vô trùng 2- Vật liệu và dụng cụ: - Dung dịch DNA, RNA - Curvet - Eppendorf 1,5ml - Pipetman các loại 0,5l – 10l; 20l – 100l; 200 l – 1000l, đầu típ tương ứng - Cốc chứa nước thải, giấy thấm - Máy đo mật độ quang III – PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Tiến hành tương tự như nhau ở cả hai loại dd DNA và RNA theo các bước sau Bƣớc 1 Pha loãng 10 lần bằng cách trộn chung 100l dịch acid nucleic với 0.9ml nước cất, trộn kỹ bằng pipetman và xen lẫn vortex. Lưu giữ lạnh và đậy nắp kỹ. Bƣớc 2 Pha loãng tiếp 2 lần bằng cách hút bổ sung 1ml nước cất Bƣớc 3 Chuẩn OD bằng nước cất và tiến hành đo ở 2 bước sóng 260 nm và 280 nm Bƣớc 4 Ghi nhận kết quả và tính toán kết quả IV – YÊU CẦU Sinh viên tiến hành thí nghiệm, ghi nhận kết quả, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. V – CÂU HỎI 1. Nêu mục đích của việc đo mật độ quang (OD) của sợi DNA hay RNA ở bước sóng 260 và 280? Tại sao phải quan tâm đến tỷ lệ OD260/OD280? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 14
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2. Nếu tỷ lệ OD260/OD280 vượt quá tỷ lệ cho phép hoặc chưa đạt tỷ lệ cho phép thì chúng ta có thể kết luận như thế nào về mẫu DNA/RNA vừa tinh sạch được? 3. Nêu các cách định lượng DNA/RNA theo quan điểm của anh/chị? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 15
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 5 : PHÂN TÍCH DNA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS) I. NGUYÊN TẮC Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối lượng, phân tử nào có diện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn. Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein. Bài này chỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid. Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn là các gel. Các gel này là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic acid đi qua, phân tử có kích thước càng lớn thì di chuyển trong gel càng chậm. Tùy theo kích thước các phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người ta sẽ sử dụng một trong hai loại gel là agarose hay polyacrylamide. Hình 1: Cấu tạo của một bể điện di nằm ngang. Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di có thể quan sát được các băng DNA nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất liệu chế đáy bể thấu qua đối với UV) - Gel agarose với lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleotide (cặp base – bp). Các Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 16
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau. - Gel polyacrylamide có lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA sợi đơn có kích thước dưới 500 bp. Với gel polyacrylamide người ta có thể phân tách hai phân tử DNA chỉ sai khác nhau một nucleotide. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta sử dụng một số phương pháp làm hiện hình như sau: - Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Hoặc có thể hiện hình các Nu AgNO3 1% tạo muối bạc trong môi trường kiềm. - Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Chúng còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt. Hình 2: Sơ đồ một mẫu khuôn bản gel polyacrylamide đơn giản. Trước khi đổ dịch tạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặc kẹp trong giá chuyên dụng) cho kín các mép hai bên và đáy. - Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn (DNA ladder). Đó là hỗn hợp của nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết, khi cho điện di cùng khúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn DNA mẫu dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn. Một số thang DNA thông dụng: X174-Hae III, -Hind III… II. DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 1. Hóa chất - Agarose nóng chảy ở nhiệt độ thấp Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 17
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền - Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X) - Dung dịch nập mẫu - Ethidium bromide (10mg/ml) - AgNO3 1% 2. Vật liệu và dụng cụ - Dung dịch DNA, RNA - Pipetman 0,5l - 10l, đầu tip - Bộ điện di, bàn đèn UV - Lò viba III. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Đổ gel agarose 1. Cân 0,5g agarose, cho vào erlen 100ml, bổ sung 25ml dung dịch TAE 1X 2. Đun chảy, để nguội đến 35-40oC, thêm vào 2l Ethidium bromide (hoặc AgNO3 1%), lắc đều 3. Trong lúc chờ nguội, chuẩn bị bản điện di, lắp lược vào khuôn 4. Đổ agarose lỏng vào khuôn 5. Đợi khi gel đông, đặt bản điện di vào bồn điện di và tháo lược ra. Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu 1. Chuẩn bị một miếng parafilm, hút 5l dung dịch DNA ở mẫu điện di đặt lên miếng parafilm, (Đối với sản phẩm cắt giới hạn, sử dụng hết lượng mẫu có 10l). 2. Thay đầu tip, hút 3l dung dịch nạp mẫu, trộn đều với dung dịch DNA ở trên 3. Dùng pipetman hút toàn bộ dịch vừa trộn nạp vào giếng 4. Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực 5. Điện di với hiệu điện thế 120V, trong 20-120 phút 6. Xem kết quả bằng đèn UV. Phân tích kết quả IV. YÊU CẦU Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhóm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. V. CÂU HỎI 1. So sánh sự khác biệt trong việc sử dụng gel agarose và polyacrylamide trong kỹ thuật điện di ? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 18
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2. Hãy cho biết ứng dụng 1 số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose và polyacrylamide mà em biết trong thực tiễn nghiên cứu các kỹ thuật di truyền ? (3 ứng dụng). Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 19
Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 6: PHÂN TÍCH RNA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS) VI. NGUYÊN TẮC Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối lượng, phân tử nào có diện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn. Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein. Bài này chỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid. Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn là các gel. Các gel này là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic acid đi qua, phân tử có kích thước càng lớn thì di chuyển trong gel càng chậm. Tùy theo kích thước các phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người ta sẽ sử dụng một trong hai loại gel là agarose hay polyacrylamide. Hình 1: Cấu tạo của một bể điện di nằm ngang. Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di có thể quan sát được các băng DNA nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất liệu chế đáy bể thấu qua đối với UV) - Gel agarose với lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleotide (cặp base – bp). Các Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 20