zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Báo cáo khoa học

Báo cáo khoa học: " PHÁT TRI ỂN QUI TRÌNH MRT-PCR PHÁT HI ỆN GAV (Gill-associated virus) VÀ BETA–ACTI N Ở TÔM SÚ"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Báo xấu

80
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

RT-PCR giao thức được phát triển để phát hiện GAV và Beta-actin gen nội sinh của tôm sú Penaeus monodon. Sáu mẫu GAV tích cực đã được phát hiện bởi IQ2000 YHV / GAV giao thức được sử dụng để thử nghiệm với giao thức của Cowley et al. (2000).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo khoa học: " PHÁT TRI ỂN QUI TRÌNH MRT-PCR PHÁT HI ỆN GAV (Gill-associated virus) VÀ BETA–ACTI N Ở TÔM SÚ"

Tạ p chí Khoa họ c 2008 (1): 176-180 Tr ường Đạ i họ c Cần Th ơ PHÁT TRI ỂN QUI TRÌNH MRT-PCR PHÁT HI ỆN GAV (Gill-associated virus) VÀ BETA–ACTI N Ở TÔM SÚ Trầ n Việt Tiên 1, Trần Th ị Mỹ Duyên1 và Đặng Th ị Hoàng Oanh 1 ABS TRACT Multiplex RT-PCR protocol was developed to detect GAV and Beta-actin endogenous gene of black tiger shrimp Penaeus monodon. Six GAV positive samples which were detected by IQ2000 YHV/GAV protocol were used to test with protocol of Cowley et al. (2000). The multiplex RT-PCR was then developed in combination of protocol for beta actin detection of Oanh ( 2007) to obtain PCR products of 317 bp for GAV and 216 bp for beta actin. This optimized protocol can now be used for GAV detection in P. monodon in our laboratory. K eywords: GAV, RT-PCR, Penaeus monodon Title: Development of multiplex RT-PCR to detect GAV and beta actin of Penaeus monodon TÓM TẮT Qui trình đ ược th ực hiện nh ằm ứng dụ ng ph ương pháp RT-PCR đ ể phát hiện GAV trên tôm sú giống có sử d ụng nộ i chu ẩn Beta-actin. Sáu mẫu d ương tính với GAV phân tích b ằng kit IQ2000 YHV/GAV đ ược ch ọn đ ể th ực hiện qui trình phát hiện GAV củ a Cowley et al. (2000). Sau đó kết h ợp qui trình RT-PCR củ a Cowley et al., (2000) và qui trình RT-PCR phát hiện gen Beta-actin của Oanh (2007) phát hiện đ ồng thời gen Beta-actin củ a tôm (216 bp) và GAV (317 bp). Qui trình đ ược chuẩn hoá có th ể ứng d ụng trong nghiên cứu và xét nghiệm GAV trên tôm sú tạ i Khoa Th ủ y sản. Từ khóa: GAV, RT-PCR, Penaeus monodon 1 GIỚ I THIỆU Sự p hát triển nhanh của nghề nuôi tôm đã đ em l ại l ợi ích đáng kể v ề mặt kinh t ế và xã hội. Tuy nhiên nghề nuôi tôm hi ện đang phải đương đầu v ới nhi ều lo ại b ệnh xuất hiện trong quá trình nuôi tôm nhất là bệnh do vi-rút gây ra như vi-rút gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome sirus - WSSV), vi-rút gây hội chứ ng Taura (Taura syndrome virus - TSV), vi rút gây bệnh đ ầu vàng (yellow head virus - YHV) và vi rút gây bệnh mang (gill- associated virus - GAV). Do chư a có thuốc chữ a trị đặ c hi ệu nên công tác phòng ngừ a và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truy ền thống như quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp phân t ử như lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục nhữ ng nhược điểm trên. Phương pháp PCR hiện đang được sử dụng rất rộng r ải và hiệu qu ả t rong vi ệc xét nghi ệm tôm giống. Tuy nhiên một trong nhữ ng h ạn ch ế đáng kể của PCR là hiện t ượng âm tính giả. Trong số các qui trình PCR phát hiện vi-rút trên tôm được sử dụng thường không có nội chuẩn nhằm kiểm soát trường hợp âm tính giả. Để t ừ ng bước khắc phục vấn đề này và cũng để t hự c hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV t ại Khoa Thủy sản chúng tôi phát triển qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và gen Beta-actin củ a tôm sú để xác định các trường hợp âm tính giả v à nâng cao tính chính xác của qui trình xét nghi ệm. 1 B ộ Môn Sinh học và B ệnh thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học C ần Thơ 176
Tạ p chí Khoa họ c 2008 (1): 176-180 Tr ường Đạ i họ c Cần Th ơ 2 PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U 2.1 Vật li ệu nghiên cứu Một trăm sáu mươi chín mẫu tôm giống cỡ Pl 12-15 được xét nghiệm t ại Khoa Thủy sản từ t háng 02–05/2007 bằng phương pháp PCR hai bước sử dụng kit IQ2000 YHV/GAV. M ẫu tôm được thu và vận chuyển trong túi nilon 2 lớp có bơm oxy mỗi túi có 100-200 tôm giống. Thao tác ly trích ARN và khuếch đại phát hiện GAV được thự c hiện theo qui trình hướng dẫn của Công ty Farming Intelligene Technology Corperation, Đài Loan. N guồn vi-rút sử dụng làm đối chứ ng dương được ly trích từ t ôm nhiễm GAV ở Úc. 2.2 Q ui trình RT- PCR phát hi ệ n GAV M ẫu tôm dương tính với GAV theo kit IQ2000YH V/GAV được sử dụng đ ể t hự c hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV theo Cowley et al., (2000). 2.2.1 Ly trích ARN Cho 50-100 mg mẫu vào ống eppendorf 1,5 ml có chứ a 750 µl Trizol (Invitrogen). Nghiền mẫu và giữ ở nhi ệt độ p hòng 5 phút. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút để t ạo phần viên. Chuy ển dịch trong sang một ống eppendorf mới. Thêm 200 µl chloroform/1ml 0 Trizol. Lắc c ẩn thận bằng tay trong 15 giây. Ủ ở 15-30 C t ừ 2-3 phút. Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút. Chuy ển phần trong phía trên sang một ống eppendorf 1,5 ml mới. 0 Thêm 500 µl isopropanol/1ml Trizol. Ủ ở 15-30 C t rong 10 phút. Ly tâm 12.000 vòng 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol. Rử a phần viên bằng ethanol 75 % (sử sụng 1ml ethanol 75% cho 1ml Trizol). Trộn đều bằng vortex và ly tâm 7.500 vòng trong 5 phút, sau đó 0 làm khô phần viên. Hòa tan phần viên với 40 µl nước cất và trữ ở -80 C. 2.2.2 Tạo cDNA: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứ ng RT-PCR - Hỗn hợp A: ARN được ly trích t ừ mẫu tôm bệnh được đo và pha loãng ở hàm lượng 200 ng/µl. Thành phần hóa chất hỗn hợp A gồm có 0,5 µl dNTP (10mM ) ; 1 µl mồi random hexamer (50 ng/µl); 5 µl ARN (200ng/µl) ; 0,5 µl nướ c c ất. Hỗn hợp được ủ 0 0 0 65 C t rong 5 phút, sau đó giữ t rong nước đá 5 phút rồi để ở nhiệt độ 20 C – 25 C. - Hỗn hợp B: Thành phần hóa chất gồm có 2 µl dung dịch đệ m 5X; 0,5 µl DDT và 0,5 µl supper reverse transcriptase III. Hỗn hợp được ủ 420C trong 5 phút, sau đó giữ ở 0 0 0 nhiệt độ 20 C – 25 C trong 5 phút rồi giữ ở 4 C. 0 - T rộn hỗn hợp A và B và t ổng h ợp cDNA trong điều kiện nhiệt độ là 25 C trong 7 0 0 0 phút, 55 C trong 50 phút , 70 C trong 15 phút và giữ ở 20 C. 2.2.3 Khuếch đại ADN - PCR bước 1: Thành phần hóa ch ất phản ứ ng khuế ch đạ i bước 1 của qui trình Cowley et al., (2000) gồ m 2,5 µl dung dị ch đệm 10X; 2,5 µl M gCl2 (50 mM ); 0,5 µl dNTPs (10mM ); 0,25 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl; 15,75 µl nước; 2,5 µl mồi GAV 5/6 0 (25pmol) và 1 µl sản phẩm sao mã ngược. Chu kỳ nhiệt thự c hiện phản ứ ng là 94 C 0 0 0 trong 1 phút; sau đó 94 C trong 30 giây, 58 C trong 30 giây, 72 C trong 40 giây; lặp lại chu kì trên 35 lần; 720C trong 7 phút; giữ 200C trong 10 phút. - PCR bước 2: Thành phần hóa ch ất phản ứ ng khuế ch đạ i bước 2 của qui trình Cowley et al., (2000) gồm có 2,5 µl dung dị ch đệm 10X; 1,5 µl M gCl2 (50 mM ); 0,5 µl dNTPs (10mM ); 0,25 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl; 14,75 µl nước; 2,5 µl mồi GAV 1/2 0 (25pmol); 2 µl sản phẩm sao mã ngược. Chu kỳ nhiệt thự c hiện phản ứ ng là 94 C 0 0 0 trong 1 phút; sau đó 94 C trong 30 giây, 58 C trong 30 giây, 72 C trong 45 giây; lặp 0 0 lại chu kì trên 35 lần; 72 C trong 7 phút; giữ 20 C trong 10 phút. 177
Tạ p chí Khoa họ c 2008 (1): 176-180 Tr ường Đạ i họ c Cần Th ơ 2.2.4 Đọc k ết quả 10 µl sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel 1.5% agarose (ABgene, UK) trong dung dịch đệ m ×1 TAE (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0.1 mM EDTA). Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Thang ADN 1 kb plus (Invitrogen) được chạy chung vớ i m ẫu đ ể xác đ ịnh kích thước của cách vạ ch ADN. M ẫu hiện lên v ạch 317 bp là mẫu dương tính vớ i GAV. 2.3 Q ui trình RT-PCR phát hi ệ n gen Beta-actin ở tôm T hành phần hóa chất khuếch đại qui trình RT-PCR phát hiện gen Beta-actin (Oanh, 2007) gồm có 2,5 µl dung dịch đệm 10X; 2,5 µl M gCl2 (50 mM ); 0,5 µl dNTPs (10mM ); 0,25 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl; 15,75 µl nước; 1,25 µl mồ i Beta-actin F (25pmol); 1,25 µl mồi Beta-actin R (25pmol); 1 µl sản phẩm sao mã ngược. Chu kỳ nhiệt của phản ứ ng 0 0 0 0 là: 94 C trong 1 phút; sau đó 94 C trong 25 giây, 58 C trong 30 giây, 72 C trong 30 giây; lặp lại chu kì trên 35 lần ;720C trong 7 phút; Giữ 200C trong 20 phút. M ẫu hiện lên vạch 216 bp là gen Beta–actin của tôm. 2.4 Q ui trình mRT-PCR phát hi ệ n đồng thời GAV và Beta–actin T hành phần hóa chất tham gia vào phản ứ ng khuếch đại qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và Beta–actin trên tôm gồm có 2,5 µl dung dịch đệm 10X; 2,5 µl M gCl2 (50 mM ); 0,5 µl dNTPs (10mM ); 0,25 µl Taq ADN polymerase 5UI/µl; 12,25 µl nước; 2,5 µl mồi GAV 1/2 (25pmol); 1,25 µl mồi Beta-actin F (25pmol); 1,25 µl mồi Beta-actin R 0 (25pmol); 2 µl sản phẩm sao mã ngược. Chu kỳ nhiệt của phản ứ ng là 94 C trong 1 phút; 0 0 0 sau đó 94 C trong 30 giây, 58 C trong 30 giây, 72 C trong 45 giây; l ặp lại chu kì trên 35 0 0 lầ n; 72 C trong 7 phút; giữ 20 C trong 10 phút. 3 KẾT QUẢ 3.1 Thực hi ện qui trình RT-PCR phát hi ệ n GAV trên tôm sú theo phươ ng pháp của Cowley Hình 1: Kết qu ả PCR phát hiện GAV theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) M: Thang đ o; 1: Đối ch ứng d ương; 2: Đối ch ứng âm (n ướ c); 3: Mẫu nhiễm GAV T rong thời gian t ừ t háng 2-5/2007 phân tích 169 mẫu tôm sú giống t ại phòng thí nghiệm với kit IQ2000 YH V/GAV đã phát hiện được 18 m ẫu tôm nhiễ m GAV. Sáu mẫu trong số này được chọn ra để ly trích ARN. Hàm lượng ARN ly trích được pha loãng mẫu ở hàm lượng 200 ng ARN/µl để t hự c hiện qui trình RT-PCR theo Cowley et al., (2000). Kết quả 1 78
Tạ p chí Khoa họ c 2008 (1): 176-180 Tr ường Đạ i họ c Cần Th ơ điện di (Hình 1) cho thấy sản phẩm PCR có kích thước 317bp giống như đối chứ ng dương, kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả của Cowley et al., (2000). 3.2 Thực hi ện qui trình RT-PCR phát hi ệ n gen Beta-actin của tôm Sau khi thự c hiện qui trình phát hiện GAV, qui trình phát hiện gen Beta-actin của tôm được thự c hiện bằng cách sử dụng mồi Beta–actin. Chọn ngẫu nhiên mẫu 123 và 124 để t iến hành qui trình. Kết quả cho thấy đã phát hiện được gen Beta-actin của tôm ở cả hai mẫu thử vị t rí 216 bp giống như đối chứ ng dương, k ết quả hoàn toàn phù hợp với k ết quả của Oanh (2007). Hình 2: Kết qu ả ch ạy PCR theo qui trình RT-PCR phát hiện gen. Beta–actin (Oanh, 2007) M: Thang đ o; 1: Đối ch ứng âm (n ướ c); 2: Đối ch ứng d ươ ng; 3 và 4: vạch ch ỉ gen Beta-actin củ a tôm tươ ng ứng với mẫu 123 và 124 3.3 Thực hi ện qui trình mRT-PCR phát hi ệ n đồng thờ i GAV và Beta–actin Hình 3: Kết qu ả ch ạy PCR theo qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và Beta–actin trên tôm. Giếng M: thang đ o; giếng 1: đối ch ứng âm; Giếng 2: mẫu ch ạy theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000); Giếng 3: mẫu ch ạy theo qui trình RT-PCR phát hiện gen Beta–actin (Oanh, 2007); Giếng 4: mẫu ch ạy theo qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và Beta–actin tôm 179
Tạ p chí Khoa họ c 2008 (1): 176-180 Tr ường Đạ i họ c Cần Th ơ Kết quả điện di (Hình 3) cho thấy khi chạy với qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và Beta–actin củ a tôm thì ở giếng 4 sẽ h iện 2 v ạch t ương ứ ng 317 bp (GAV) và 216 bp (Beta–actin). 4 THẢO LUẬN T hông thường phản ứ ng PCR phải có các đối chứ ng sau: (i) đối chứ ng âm để k iểm soát trường hợp t ạp nhiễm; (ii) đối chứ ng ADN/ARNtt cuả vật chủ để chắc chắn acid nucleic của mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu vớ i hệ gen vật chủ và (iii) đối chứ ng dương chứ ng t ỏ p hản ứ ng PCR có mạch khuôn đặc hiệu vớ i mồi. Trên cơ sở qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) phát hiện GAV trên tôm và qui trình RT-PCR phát hiện gen Beta–actin (Oanh, 2007) của tôm, qui trình mRT-PCR kết hợp 2 qui trình trên được thự c hiện đ ã phát hiện đồng thời GAV ở vị t rí 317 bp và Beta-actin ở vị t rí 216 bp. T ừ kết quả đạt được cho thấy qui trình có thể ứ ng dụng để p hát hiện GAV và nh ằm kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong quá trình phát hiện GAV thông qua gen nội sinh Beta-actin. 5 KẾT LUẬN T hự c hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV theo Cowley et al., (2000), sản phẩm PCR cho kết quả ở 317 bp. Khả năng ứ ng dụng t ốt của qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV (vị t rí 317 bp) và Beta -actin của tôm (ở vị t rí 216 bp). M ặc khác qui trình khá ổn định có thể sử dụng trong đ iều kiện phòng thí nghiệm của Khoa Thủy sản và có khả năng thay thế kit IQ2000 trong việc ch ẩn đoán phát hiện GAV trên tôm. LỜ I CẢM TẠ Các n ộ i dung nghiên cứu trong báo cáo này được th ực hiện t ừ n guồ n kinh phí nghiên cứu khoa họ c của Bộ môn Sinh h ọc và Bệnh T h ủy sản, Khoa Th ủy sản. Đại h ọ c Cần Th ơ. TÀI LIỆU THAM KHẢO C owley, J.A., C.M. Dimmock, K.M. Spann, P.J. Walker. 2000. Detection of Australian gill-associated virus (GAV) and lymphoid organ virus (LOV) of Penaeus monodon by RT-nested PCR amplification. Dis Aquat Org. 39: 159-167 Dang Thi Hoang Oanh, 2007. RNA interference in Penaeid prawns. PhD thesis, School of Molecular and Microbial Sciences, The University of Queensland, Australia. Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạn Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thùy Dương. 2003. Phát hiện vi-rút gây bệnh đầu vàng bằng phương pháp RT-PCR. T ạp chí di truyền và ứng dụng. S ố 2 : 1-4 Spann K.M., J.A. Cowley, P.J. Walker and R.J.G (1997). A Yellow head like virus from Penaeus mondon culture in Australia. Dis. Aquat. Org 31: 169-179 180

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

TL.01: Bộ Tiểu Luận Triết Học

207 tài liệu

1470 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.