BÁO CÁO KHOA HỌC: "THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN PEPTID TỔNG HỢP"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

86
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Peptid là các phân tử được cấu tạo từ các phân tử nhỏ hơn gọi là các axit amin bằng liên kết peptid giữa các axit amin. So với phân tử protein các peptid có những khác biệt nhất định: (a) Protein chỉ được cấu tạo từ 20 axit amin khac nhau, trong khi đó peptid được cấu tạo từ 20 axit amin này của protein và các axit amin khác có thể có trong tự nhiên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN PEPTID TỔNG HỢP"

THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN PEPTID TỔNG HỢP Vũ Thị Bích Hường, Lã Thị Huyền, Lê Trần Bình, Lê Quang Huấn Viện Công nghệ sinh học Peptid là các phân tử được cấu tạo từ các phân tử nhỏ hơn gọi là các axit amin bằng liên kết peptid giữa các axit amin. So với phân tử protein các peptid có những khác biệt nhất định: (a) Protein chỉ được cấu tạo từ 20 axit amin khac nhau, trong khi đó peptid được cấu tạo từ 20 axit amin này của protein và các axit amin khác có thể có trong tự nhiên. (b) Protein có các chuỗi axit amin dài hơn peptid, do sự khác nhau này mà protein và peptid có sự khác nhau về các dạng cấu trúc không gian và các chức năng sinh học [ 4, 5 ]. Một số peptid có thẻ tuân theo cấu trúc không gian ba chiều (cấu trúc bậc 2) như protein có cấu trúc đặc trưng bởi 2 dạng chính: dạng xoắn alpha và dạng nếp gấp beta; Một số peptid khác không tuân theo một dạng cấu trúc bền vững đặc biệt nào mà chỉ cuộn lại một cách ngẫu nhiên, hoăc ở
dạng vô định hình trong dịch tê bào, chúng chỉ thể hiện rõ cấu trúc của mình khi đã tiếp cận và liên kết với màng tế bào đích. Thông thường các peptid là những tác nhân điều hoà hoạt tính của các phân tử khác (chẳng hạn các phân tử protein). Sự điều hoà này thông qua mối tương tác của peptid với các phân tử chịu sự điều hoà. Như vậy có các peptít với hoạt tính hoocmon, các peptid khác với hoạt tính kháng khuẩn... Một số peptid được cơ thể tổng hợp trực tiếp, một số khác là sản phẩm thuỷ phân của các phân tử protein. Vì vậy, peptid này có hoạt tính sinh học xác định, peptid kia chỉ là sản phẩm trung gian của quá trình thuỷ phân tới các sản phẩm cuối cùng [2, 6]. Để góp phần hiểu rõ về vai trò của các peptid trong cơ thể sống cũng như tác dụng của các peptid trong y học chúng tôi trình bầy những kết quả nghiên cứu thiết kế vectơ để biểu hiện peptid được tổng hợp theo phương pháp hoá học. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu, hoá chất
Dựa vào tính chất đặc trưng của các axit amin và trình tự xắp xếp của chúng trong các phân tử peptid có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus đã được xác định chúng tôi tổng hợp đoạn gen mã hoá cho một peptid theo phương pháp hoá học có trình tự như sau: Chủng vi sinh vật E.coli BL21; Vectơ biểu hiện pMAL-c2; Các hoá chất sử dụng trong thí nghiệm: IPTG (isopopyl - D- Thiogalactopyranoside) (Sigma), SephadexG-75, sephadex G-25 (Sigma), Cột sắc ký ái lực amylose resin của hãng New England Biolab, Maltose (Sigma), Factor-Xa và các hoá chất sử dụng khác đều là những hoá chất tinh khiết. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: môi trường lỏng LB ( 2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl); môi trường chọn lọc là môi trường LB bổ sung ampicillin nồng độ 100g/ml.
Phương pháp 1.Thiết kế vectơ biểu hiện gen tổng hợp Như đã trình bầy ở phần trên đoạn gen được tổng hợp dưới dạng hai chuỗi đơn nucleotid, sau khi chúng kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ trợ theo chu trình nhiệt mà chúng tôi đã trình bầy trong thông báo trước đây [1], cụ thể: trộn hai dung dịch chúa cùng nồng độ các chuỗi nucleotid đã tổng hợp, biến tính 950C trong khoảng thời gian là 5 phút, sau đó để lạnh từ từ tới nhiệt độ phòng. Đoạn ADN tạo thành sau phản ứng là một sợi kép với hai dầu dính có trình tự các nucleotid đặc trưng cho trình tự đoạn ADN đã được cắt bởi các các enzym hạn chế EcoR I và Hind III. Đoạn ADN này sẽ được gắn vào vectơ biểu hiện pMAL-C2 sau khi đã được cắt bỏ vùng cắt gắn đa vị từ vị trí nhận biết của enzym hạn chế EcoR I tới vị trí nhận biết của enzym hạn chế Hind III (hình 1).
Hình 1: Trình tự vùng cắt gắn đa vị của vectơ pMAL-c2 2. Tách chiết và tinh chế protein liên kết Từ 300ml dịch nuôi cấy tế bào sau khi cảm ứng 3giờ được ly tâm với vận tốc 5000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, phần tế bào kết lắng được hoà lại trong 15ml dung dịch đệm (10mM Tris-HCl, pH=8,0; 1mM EDTA). Sau đó sự thuỷ giải tế bào được thực hiện bằng siêu âm hoặc enzym lysozym (100g/ml). Lấy 1ml dịch thuỷ giải tế bào đưa lên cột ái lực amylose resin. Sau khi rửa cột với 15 ml dung dịch đệm (20mM Tris-HCL, pH=8,0, 1mM EDTA, 200mM NaCl), protein liên kết được giải hấp với dung dịch đệm trên có bổ sung maltose (20mM Tris-HCL, pH=8,0, 1mM EDTA, 200mM
NaCl, 10mM maltose). Thu 10 phân đoạn (mỗi phân đoạn 1ml) ngay sau khi đưa mẫu lên cột. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Thiết kế vectơ mang gen peptid tái tổ hợp Gen tổng hợp sau khi được gắn vào vectơ pMAL-C2 nhờ các enzyme giới hạn EcoR I và Hind III được biến nạp vào chủng vi khuẩn tách dòng E.coli DH5 và chọn lọc trên môi trường LB chứa ampicillin (100g/ml). Để kiểm tra kết quả biến nạp, chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN plasmid vectơ đã thiết kế được và nhân trong tế bào E.coli chủng DH5 mang gen peptid tổng hợp (Hình 2)
Hình 2: Kết quả tách chiết ADN plasmid Kênh 1-4: ADN plasmit thu được từ các thể biến nạp Kênh 5: ADN plasmit gốc (vectơ pMAL-c2 gốc). Trên điện di đồ ta thấy các mẫu ADN plasmit thu được có độ tinh khiết cao, các mẫu ADN plasmit tách từ các thể biến nạp thu được đều có kích thước lớn hơn so với kích thước của ADN plasmit gốc (vectơ pMAL-c2 gốc). Để tuyển chọn các plasmit thực sự mang đoạn gen mã hoá peptid tổng hợp chúng tôi đã tiến hành căts kiểm tra ADN plasmit đồng thời với cả hai enzym hạn chế EcoR I và HindIII. Kết quả xử lý đồng thời với cả hai enzym hạn chế EcoR I và HindIII được kiểm tra bằng điện di trên gel
polyacrylamide 5% (hình 3). Trên điện di đồ ta thấy xuất hiện một băng phụ có kích thước tương ứng với kích thước của đoạn oligonucleotid tổng hợp. Hình3: Kết quả điện di ADN plasmid sau khi cắt bằng các enzyme EcoR I và Hind III Kênh 1, 2, 3: ADN plasmid các khuẩn lạc sau khi xử lý với EcoR I và Hind III Kênh 4, 5: Đoạn oligonucleotid tổng hợp Từ các kết quả trên đây có thể khảng định rằng đoạn
oligonucleotid do chúng tôi tổng hợp đã được gắn vào vectơ pMAL-C2 và thay thế cho đoạn polylinker từ vùng nhận biết của enzym hạn chế EcoR I tới vị trí nhận biết của enzym Hind III. Để khẳng định kết quả gắn gen mã hoá peptid tổng hợp vào vectơ pMAL-c2 chúng tôi đã cắt kiểm tra vectơ tái tổ hợp thu được và vectơ pMAL-c2 gốc bằng enzym hạn chê BamH I, vì trong đoạn gen tổng hợp không có vị trí nhận biết của enzym BamH I, trong khi đó vùng cắt gắn đa vị của vectơ pMAL-c2 có vị trí nhận biết của enzym cắt hạn chế BamH I. Kết quả cắt với enzym hạn chế BamH I (Hình 4) cho thấy khi cắt vectơ tạo được với enzym BamH I thì vectơ không bị cắt mở vòng, còn vectơ gốc bị cắt và mở vòng xoắn. Điều này có nghĩa là đã nhận được một vectơ tái tổ hợp không mang đoạn cắt gắn đa vị mà mang đoạn gen tông hợp.
Hình 3: Điện di đồ kết quả xử lý với enzym cắt hạn chế BamH I -Kênh 1: Vectơ gốc pMAL-c2 không xử lý với enzym cắt hạn chế BamH I -Kênh 2: Vectơ gốc pMAL-c2 xử lý với enzym cắt hạn chế BamH I -Kênh 3, 4, 5: Các vectơ thiết kế đã nhận được và đã xử lý với enzym BamH I -Kênh 6, 7: Các vectơ thiết kế đã nhận được và không xử lý với enzym BamH I 2. Biểu hiện gen tái tổ hợp Sau khi biến nạp vectơ đã thiết kế mang peptid vào chủng
vi khuẩn E. coli BL-21. Các tế bào vi khuẩn biến nạp được nuôi lắc ở 370C trong môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin (100g/ml) tới khi đạt OD600= 0,5, bổ chất cảm ứng IPTG tới nồng độ cuối cùng là 0,3mM. Nuôi tiếp 3 giờ ở 370C, sau đó thu nhận tế bào và tách chiết protein. Kết quả biểu hiện gen tái tổ hợp được trình bầy trên hình 4 Hình 4: Điện di đồ của protein tế bào vi khuẩn trước và sau khi cảm ứng bằng IPTG Kênh 5: Marker protein Các kênh 1, 3, 6, 8 là mẫu chiết tế bào trước khi cảm ứng bằng IPTG Các kênh 2, 4, 7, 9 là mẫu chiết tế bào sau khi cảm ứng bằng IPTG.
Trên hình 4, sau khi cảm ứng bằng IPTG ta thấy lượng protein có trọng lượng phân tử khoảng 43 kDa xuất hiện rất rõ so với trước khi gây cảm ứng. Điều này có nghĩa là gen tái tổ hợp trong vectơ đã hoạt động mạnh (tổng hợp một lượng lớn protein tái tổ hợp) sau khi bổ sung IPTG vào môi trường nuôi cấy. 3. Tinh chế peptid Pha loãng dịch chiết tế bào bằng dung dịch đệm (50mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% EDTA và 100mM NaCl), sau đó cho lên cột sắc ký ái lực với chất amylose resin, giải hấp bằng dung dịch đệm có bổ sung maltose. Các phân đoạn chứa protein liên kết được kiểm tra bằng điện di trên SDS- PAGE. Kết quả thu được một băng protein có trọng lượng phân tử khoảng 43kDa (Hình 5).
Hình 5: Điện di đồ các phân đoạn thu được bằng sắc ký ái lực trên amylose resin Kênh 1: Marker protein Kênh 2, 3, 4, 5, 6: Protein của các phân đoạn thu được sau khi bổ sung maltose. 4. KẾT LUẬN Đã thiết kế được vectơ mang gen mã hoá peptid, đoạn 1. gen này được gắn vào vectơ pMAL-c2 thay cho đoạn cắt gắn đa vị giữa điểm nhận biết của các enzyme giới hạn EcoR I và Hind III Gen mã hoá peptid được gắn kết với gen mã hoá 2.
protein malE trong cùng một operon và do đó chúng được tổng hợp dưới dạng một protein liên kết và được biểu hiện mạnh trong vi khuẩn E.coli BL21 sau khi cảm ứng bằng IPTG. Protein liên kết có độ tinh sạch cao khi sử dụng cột sắc 3. ký ái lực amylose resin. TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Quang Huấn, Đinh Duy Kháng, Trương Nam Hải, 1. Đồng Văn Quyền, Lê Trần Bình, 2000, Thu nhận peptid kháng khuẩn tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền, Hội nghị khoa học cơ bản toàn Quốc, Hà nội, 8-9 tháng 8, p.89-94. Lê Quang Huấn, Nguyễn Thị Minh Huyền, Lê Trần 2. Bình (2001), Phân lập và xác định trình tự gen mã hoá peptid melittin từ ong vàng polistes sp. C. 3. Le, H.Q., Truong, H.N. and Le, B.T, 2001 Synthetic construct mRNA for putative antimicrobial protein (pep- H), Đăng ký trình tự gen trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế 19/8/2001, Số AJ318492.
4. GANTZ, T., LEHRER, R. I. (1999), ANTIBIOTIC PEPTIDES FROM HIGHER EYKARYOTES: BIOLOGY AND APPLICATIONS. MOL. MED. TODAY, VOL. 5 (7), 292-297. 5. SPITZNAGEL, J.K. (1998) ORIGINS AND DEVELOPMENT OF PEPTIDE ANTIBIOTIC RESEARCH. MOLECULAR BIOTECHNOLOGY, VOL. 10. 237-242. 6. TAKEI, Y. (2000), STRUCTURAL AND FUNCTIONAL EVOLUTION OF THE NATRIURETIC PEPTIDE SYSTEM IN VERTEBRATES. INT. REV. CYTOL. 194, 1-6. SUMMARY Construction of the expression vector for synthetic peptide Antimicrobial peptides are ubiquitously produced throughout nature. Many of these relatively short peptides (6-50 residues) are lethal towards bacteria and fungi, yet
they display minimal toxicity towards mammalian cells. All of the peptides are highly cationic and hydrophobic. Despite the different three-dimensional structural motifs of the various classes, they all have similar amphiphilic surfaces that are well-suited for membrane binding. Many antimicrobial peptides bind in a membrane-parallel orientation, interacting only with one face of the bilayer. An understanding of the key features of primary structure of peptides on bactericidal and hemolytic activity can aid the rational design of improved analogs for clinical use. So that, here we report our experiment about the synthetic antimicrobial peptides, its capacity express in bacterial expression system and effective method of purification for fusion protein. We have constructed the expressible vector for synthetic peptide having 14 amino acids in length. One of the oligonucleotids have the sequence:5’- AATTCATGAGAAGTGGTGTTATAGAAAGAAACCA- TATAGAAAATGTAGATGA-3’ and the other have sequence 5’- AGCTTCATCTACATTTTCTATAT- GGTTTCTTTCTATAACACCACTTCTCATG-3’. Making of ligation these two oligonucletit by mixture of two
oligonucleotid in equal mole, heating 5 minutes at 950C, and then to cold in room temperature. The ligated product was inserted into vector pMAL-c2 has been treated with two restrictive enzymes, EcoR I and Hind III, in reaction tube in present T4 ligaze at 140C overnight. The constructed vector carrying out synthetic gene was transformed into cloning strain E.coli DH5 and expressing strain E.coli BL21. The cloned gene is inserted downstream from the malE gene of E. coli, which encodes maltose-binding protein (MBP), by replacing polylinker region from recognized site of EcoR I to recognized site of Hind III-restrictive enzyme, resulting in the expression of an MBP fusion protein. This allows MBP to be cleaved from the protein of interest after purification. Our synthetic gene coding antimicrobial peptide in combined with the gene that encode for protein malE was effectively expressed in E.coli BL21 strain after IPTG induction and MBP fusion protein was obtained in homogeneous form by using the affinity chromatography on the column with amylose resin.
Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Thị Kim Cúc.