Bảo quản tinh trùng cá basa, cá tra

Chia sẻ: Up Upload | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

111
lượt xem 20
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo tài liệu 'bảo quản tinh trùng cá basa, cá tra', nông - lâm - ngư, ngư nghiệp phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bảo quản tinh trùng cá basa, cá tra

I. PHÖÔNG PHAÙP BAÛO QUAÛN TINH TRUØNG CAÙ TRA VAØ BA SA DAØI NGAØY BAÈNG NITÔ LOÛNG a/ Thí nghieäm: Ñaùnh giaù söï vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong Nitô loûng. Qui trình baûo quaûn tinh truøng ñöôïc trình baøy caùc böôùc sau. Tinh truøng sau khi ñöôïc vuoát Pha loaõng tæ leä 1: 10 Dung dòch coá ñònh Chaát baûo veä ôû noàng ñoä 5-20% Thôøi gian caân baèng 10 phuùt Cho vaøo oáng nhöïa 0,5mL Ñoâng laïnh ôû toác ñoä haï nhieät 5-70C ñat ñeán –800C Thaû tröïc tieáp vaøo bình Nitô loûng Sau 3 thaùng baûo quaûn Ñaùnh giaù chaát löôïng tinh 1
Vôùi chaát baûo veä laø - Dimethyl sulfoxide (DMSO) (theo Tiersch vaø ctv., 1994) - Glycerol (G) (Theo Tiersch vaø ctv., 1994) - Methanol (M) (theo Tiersch vaø ctv., 1994). Vaø ôû 4 noàng ñoä: 5%, 10%, 15%, 20%. II. KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN A. Keát Quaû Caù Tra 1. Phöông phaùp baûo quaûn ngaén ngaøy tinh truøng caù tra Pagasius hypophthalmus Tinh truøng ñöôïc vuoát ra khoûi caù ñöïc vaø chæ hoaït ñoäng khi ñöôïc tieáp xuùc vôùi nöôùc. Söï thuï tinh giöõa tinh truøng vaø tröùng dieãn ra raát nhanh trong voøng vaøi giaây sau khi tinh truøng hoaït ñoäng. Ñeå baûo quaûn tinh truøng sau khi rôøi khoûi cô theå, tieán haønh tröõ tinh truøng trong caùc dung dòch coá ñònh. Chuùng toâi söû duïng boán dung dòch coá ñònh tinh truøng. Ñoù laø dung dòch nöôùc muoái sinh lyù NaCl 0,9%, dung dòch HBSS (dung dòch muoái caân baèng Hank), dung dòch CF-HBSS (dung dòch muoái caâng baèng Hank khoâng chöùa Calcium) vaø dung dòch ñeäm Tris (goàm NaCl 0,9% vaø pH=7), vôùi tyû leä pha loaõng giöõa tinh vaø dung dòch coá ñònh tinh truøng laø 1:10, tröõ ôû nhieät ñoä 4-100C. Ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng tinh truøng baûo quaûn thay ñoåi theo thôøi gian vaø dung dòch coá ñònh, thoâng qua chæ tieâu ñaùnh giaù phaàn traêm vaän ñoäng tinh truøng, thôøi gian tinh truøng vaän ñoäng, kieåu tinh truøng vaän ñoäng cuõng nhö ñaùnh giaù qua tyû leä thuï tinh, tyû leä nôû, tyû leä soáng vaø tæ leä dò hình. 2. Ñaùnh giaù söï vaän ñoäng tinh truøng theo thôøi gian baûo quaûn Söï vaän ñoäng tinh truøng ñöôïc baûo quaûn trong caùc dung dòch coá ñònh thay ñoåi theo thôøi gian baûo quaûn töø 12 giôø ñeán 96 giôø. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 1 Theo keát quaû baûng 4.1, phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng giaûm daàn theo thôøi gian baûo quaûn vaø cuõng thay ñoåi theo dung dòch coá ñònh tinh truøng. Keát quaû thí nghieäm cho thaáy ôû thôøi gian baûo quaûn 24 giôø, phaàn traêm vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong dung dòch coá ñònh Tris so vôùi phaàn traêm vaän ñoäng tinh truøng ñoái chöùng (100%) thì khoâng sai khaùc. Traùi laïi, caùc dung dòch coá ñònh tinh truøng coøn laïi cho thaáy phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng coøn laïi 63,3- 73,3% so vôùi ñoái chöùng coù söï sai khaùc. Vaäy ôû thôøi gian baûo quaûn 24 giôø thì dung dòch coá ñònh Tris giuùp tinh truøng vaän ñoäng toát nhaát. Tinh truøng baûo quaûn sau thôøi gian 48 giôø baét ñaàu coù söï thay ñoåi khaù roõ. Trong dung dòch coá ñònh HBSS, phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng baèng khoâng, nghóa laø söï soáng cuûa chuùng khoâng coøn nöõa. Tuy nhieân, ñoái vôùi dung dòch coá ñònh CF-HBSS, Tris vaø nöôùc muoái sinh lyù NaCl 0,9% thì keát quaû thí nghieäm cho thaáy phaàn traêm vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn coøn 2
toát, maëc duø so vôùi ñoái chöùng (100%) thì ñaõ giaûm khaù nhieàu. Cuï theå nhö dung dòch Tris (43,3%), CF-HBSS (36,7%) vaø dung dòch NaCl (50,0%). Ñeán thôøi gian baûo quaûn sau 72 giôø, phaàn traêm vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong caùc dung dòch coá ñònh giaûm raát nhieàu. Cuï theå nhö dung dòch coá ñònh Tris(26,7%), dung dòch CF-HBSS vaø NaCl (13,3%), roài ñeán HBSS (baèng khoâng). Thôøi gian baûo quaûn tinh truøng caøng keùo daøi thì phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng caøng giaûm. Ñeán thôøi gian baûo quaûn 96 giôø, chæ coøn khoaûng 10% tinh truøng vaän ñoäng ñöôïc baûo quaûn trong dung dòch coá ñònh Tris vaø NaCl 0,9%. Nhaän xeùt thaáy raèng, chaát löôïng tinh truøng thoâng qua chæ tieâu ñaùnh giaù phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng trong ñieàu kieän khoâng cung caáp oxygen vaø thuoác khaùng sinh, 50% tinh truøng coøn soáng vaø vaän ñoäng sau 48 giôø trong dung dòch coá ñònh Tris vaø NaCl 0,9%. Baûng 1 Phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng theo thôøi gian baûo quaûn vaø dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Thôøi gian Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 12 giôø 100,0b 73,3a 63,3a 93,3b 73,3a 24 giôø 100,0d 0,0a 56,7b 73,3c 70,0c 36 giôø 100,0d 0,0a 36,7b 43,3bc 50,0c 48 giôø 100,0d 0,0a 26,7b 36,7c 30,0b 60 giôø 100,0d 0,0a 13,3b 26,7c 13,3b 72 giôø 100,0d 0,0a 0,0a 23,3c 13,3b 84 giôø 100,0c 0,0a 0,0a 13,3b 8,3b 96 giôø Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
nhaân daãn ñeán phaàn naøo chaát löôïng tinh truøng keùm. Ngöôïc laïi, aùp suaát thaåm thaáu dung dòch nöôùc muoái sinh lyù NaCl 0,9% laø 300 mOsmol/Kg, CF-HBSS laø 320 mOsmol/Kg vaø Tris laø 310 mOsmol/Kg cao hôn dung dòch coá ñònh HBSS neân chaát löôïng tinh truøng ñöôïc baûo quaûn mang laïi keát quaû toát hôn. Khi so saùnh vôùi keát quaû cuûa Mongkopunya vaø ctv., 1996 baûo quaûn tinh truøng caù tra vôùi caùc dung dòch coá ñònh. Keát quaû tinh truøng baûo quaûn ñeán thôøi gian 96 giôø thì keát quaû töông töï. Tuy nhieân, theo baùo caùo keát quaû cuûa Mongkopunya vaø ctv., 1996 coù söû duïng thuoác khaùng sinh neân ñaõ keùo daøi thôøi gian soáng tinh truøng ñöôïc 6 ngaøy. Tuy nhieân, caû hai keát quaû naøy thì thaáy raèng phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng toát nhaát laø 2 ngaøy. Baûng 2 Thôøi gian tinh truøng vaän ñoäng theo thôøi gian baûo quaûn vaø dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Thôøi gian Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 50,3ab 57,3b 52,7ab 55,0b 43,7a 12 giôø 50,3b 42,7a 43,3ab 47,7ab 41,0a 24 giôø 50,3d 0,0a 37,3b 45,0cd 42,0bc 36 giôø 50,3c 0,0a 31,0b 37,3b 31,7b 48 giôø 50,3d 0,0a 28,0b 34,0c 26,7b 60 giôø 50,3c 0,0a 21,3b 27,3b 22,0b 72 giôø 50,3c 0,0a 0,0a 20,0b 22,0b 84 giôø 50,3c 0,0a 0,0a 17,7b 16,3b 96 giôø Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
so vôùi dung dòch coá ñònh HBSS (chæ sau 36 giôø baûo quaûn, tinh truøng ñaõ khoâng coøn soáng soùt). Ñeán thôøi gian 96 giôø baûo quaûn tinh truøng trong dung dòch coá ñònh Tris vaø NaCl 0,9% thì tinh truøng vaãn coøn vaän ñoäng trung bình töø 16-17 giaây so vôùi 50 giaây cuûa ñoái chöùng, coøn dung dòch coá ñònh HBSS vaø CF-HBSS mang laïi keát quaû keùm nhaát. Ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng tinh truøng khi qua chæ tieâu ñaùnh giaù söï vaän ñoäng tinh truøng thì kieåu vaän ñoäng tinh truøng laø yeáu toá quan troïng, aûnh höôûng ñeán khaû naêng tieáp xuùc giöõa tinh truøng vaø tröùng. Kieåu vaän ñoäng tinh truøng giaûm daàn theo thöù töï töø tinh truøng di ñoäng raát nhanh khoâng theå nhìn thaáy töøng caù theå, roài ñeán kieåu di ñoäng chaäm, di ñoäng taïi choã vaø baát ñoäng. Döïa vaøo thang ñaùnh giaù kieåu vaän ñoäng tinh truøng cuûa Sanchez- Rodiguez vaø Billard (1977), ñeå tieán haønh ñaùnh giaù söï vaän ñoäng tinh truøng. Keát quaû ñöôïc theå hieän qua baûng 4.3 sau. Baûng 3 Kieåu tinh truøng vaän ñoäng theo thôøi gian baûo quaûn vaø dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Thôøi gian Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 5,0a 5,0a 5,0a 5,0a 5,0a 12 giôø 5,0b 4,3a 4,0a 5,0b 4,3a 24 giôø 5,0c 0,0a 3,7b 4,0b 4,0b 36 giôø 5,0d 0,0a 2,7b 3,0bc 3,3c 48 giôø 5,0e 0,0a 1,3b 2,7d 2,0c 60 giôø 5,0d 0,0a 1,0b 1,7c 1,0b 72 giôø 5,0c 0,0a 0,0a 1,3b 1,0b 84 giôø 5,0c 0,0a 0,0a 1,0b 1,0b 96 giôø Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
nhanh maø maét thöôøng khoâng theå nhìn thaáy roõ töøng caù theå). Tuy nhieân caùc dung dòch coá ñònh khaùc cho keát quaû töông ñoái thaáp hôn (trung bình töø kieåu 4-5). Khi thôøi gian tinh truøng baûo quaûn ñeán 48 giôø trong caùc dung dòch coá ñònh, kieåu tinh truøng vaän ñoäng ñaõ coù söï thay ñoåi lôùn hôn. Dung dòch coá ñònh HBSS cho keát quaû tinh truøng baát ñoäng (kieåu 0). Ñoái vôùi dung dòch coá ñònh Tris, NaCl 0,9% vaø dung dòch CF-HBSS thì kieåu tinh truøng vaän ñoäng giaûm xuoáng (kieåu 3: tinh truøng vaän ñoäng bao goàm tinh truøng vaän ñoäng nhanh, vaän ñoäng chaäm vaø khoâng vaän ñoäng). Sau thôøi gian 72 giôø tinh truøng baûo quaûn trôû ñi thì kieåu vaän ñoäng giaûm haún (töø kieåu 2 giaûm xuoáng ñeán kieåu 0). Qua vieäc ñaùnh giaù chaát löôïng tinh truøng thoâng qua chæ tieâu ñaùnh giaù söï vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong caùc dung dòch coá ñònh, cho thaáy raèng chaát löôïng tinh truøng baûo quaûn giaûm daàn theo thôøi gian baûo quaûn vaø thay ñoåi theo dung dòch coá ñònh tinh truøng. Trong thí nghieäm naøy, vieäc ñaùnh giaù ban ñaàu cho thaáy dung dòch coá ñònh Tris, nöôùc muoái sinh lyù NaCl 0,9% laø toát nhaát, keá ñeán laø dung dòch CF-HBSS vaø sau cuøng laø dung dòch coá ñònh HBSS. 3. Khaû naêng thuï tinh cuûa tinh truøng baûo quaûn Ñaây laø chæ tieâu ñaùnh giaù quan troïng nhaát ñeå cho thaáy chaát löôïng tinh truøng ñöôïc baûo quaûn trong caùc dung dòch coá ñònh. Chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm cho thuï tinh giöõa tröùng vaø tinh truøng baûo quaûn trong caùc dung dòch coá ñònh theo thôøi gian baûo quaûn töø 24-72 giôø. Do keát quaû thuï tinh, ngoaøi vieäc leä thuoäc vaøo chaát löôïng tinh truøng coøn leä thuoäc ñeán chaát löôïng tröùng, cho neân chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm laäp laïi söï thuï tinh treân ba caù caùi. Sau ñaây laø keát quaû tæ leä thuï tinh, tæ leä nôû, tæ leä dò hình, vaø chaát löôïng caù boät theo thôøi gian baûo quaûn tinh truøng vaø dung dòch coá ñònh tinh truøng. a/ Ñaùnh giaù tæ leä thuï tinh Baûng 4 Tæ leä thuï tinh sau thôøi gian baûo quaûn 24 giôø tinh truøng ñöôïc baûo quaûn trong caùc dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 80,7a 92,8b 92,4b 93,5b 83,6a Caù caùi 1 93,5c 69,4a 72,9ab 87,6bc 91,2c Caù caùi 2 80,1bc 68,6a 72,8a 86,2c 79,4b Caù caùi 3 86,0a 76,9a 79,3a 89,1a 84,7a Trung bình 6
Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
Baûng 6 Tæ leä thuï tinh sau thôøi gian baûo quaûn 72 giôø tinh truøng ñöôïc baûo quaûn trong caùc dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 93,6c 38,9ab 42,5b 49,5b 27,7a Caù caùi 1 88,0c 48,5b 40,3ab 45,3b 32,1a Caù caùi 2 92,0c 53,0a 50,4a 73,5b 50,9a Caù caùi 3 91,2c 46,8ab 44,4ab 56,1b 36,9a Trung bình Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
Theo thôøi gian tinh truøng baûo quaûn, keát quaû thí nghieäm ôû baûng 4.7 cho thaáy sau 24 giôø tinh truøng baûo quaûn trong dung dòch coá ñònh HBSS vaø CF-HBSS cho keát quaû tæ leä nôû caù boät (85,7- 89,0%) so vôùi ñoái chöùng (92,6%) coù sai khaùc nhöng raát ít. Ñoái vôùi hai dung dòch coá ñònh Tris vaø NaCl 0,9% cho keát quaû tæ leä nôû (91,9- 92,0%) khoâng sai khaùc so vôùi ñoái chöùng (92,6%). Khi thôøi gian baûo quaûn tinh truøng ñeán 48 giôø, tæ leä nôû coù söï sai khaùc vôùi ñoái chöùng (baûng 4.8). Tinh truøng baûo quaûn trong dung dòch NaCl 0,9%, HBSS coù tæ leä nôû baèng khoâng, trong khi hai dung dòch coá ñònh Tris vaø CF-HBSS daãn ñeán tæ leä nôû khaù cao laàn löôït laø 82,6% vaø 61,8%. Nhö vaäy, sau 48 giôø tinh truøng baûo quaûn, chæ coù dung dòch coá ñònh Tris cho keát quaû töông ñöông vôùi ñoái chöùng, keá ñeán laø dung dòch coá ñònh CF-HBSS, coøn hai dung dòch coá ñònh HBSS vaø NaCl 0,9% cho keát quaû keùm nhaát. Baûng 7 Tæ leä nôû caù boät sau thôøi gian 24 giôø baûo quaûn tinh truøng trong caùc dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 89,0ab 87,1a 87,6ab 88,9ab 90,6b Caù caùi 1 93,7a 83,5a 93,3a 94,4a 94,9a Caù caùi 2 94,9d 86,6ab 85,9a 92,7cd 90,2bc Caù caùi 3 92,6b 85,7a 89,0ab 92,0b 91,9b Trung bình Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
Baûng .8 Tæ leä nôû caù boät sau thôøi gian 48 giôø baûo quaûn tinh truøng trong caùc dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 94,5d 0,0a 71,5b 86,8c 0,0a Caù caùi 1 83,7c 0,0a 58,5b 82,9c 0,0a Caù caùi 2 80,0c 0,0a 55,4b 78,1c 0,0a Caù caùi 3 86,1c 0,0a 61,8b 82,6c 0,0a Trung bình Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
trong voøng 24 giôø. Nhöng khi thôøi gian baûo quaûn keùo daøi (töø 48- 72 giôø), thì chæ coù dung dòch coá ñònh Tris laø toát nhaát. Nhaän xeùt thaáy raèng, töông töï nhö vieäc ñaùnh giaù söï vaän ñoäng tinh truøng cuõng nhö ñaùnh giaù tæ leä thuï tinh, thì tæ leä nôû sau thôøi gian baûo quaûn tinh truøng trong dung dòch coá ñònh giaûm daàn theo thôøi gian baûo quaûn vaø thay ñoåi theo dung dòch coá ñònh. c/ Ñaùnh giaù tæ leä soáng ÔÛ caù tra P. hypophthalmus, khi caù boät ñöôïc moät ngaøy tuoåi thì chuùng baét ñaàu coù hieän töôïng caén nhau. Do ñoù, ñeå ñaùnh giaù tæ leä soáng caù boät chuùng toâi tieán haønh ñaùnh giaù sau 24 giôø caù boät soáng. ÔÛ keát quaû baûng 4.10, tæ leä soáng töông töï nhö keát quaû tæ leä thuï tinh vaø tæ leä nôû, nghóa laø thôøi gian 24 giôø tinh truøng baûo quaûn trong dung dòch coá ñònh (94,5- 96,4%) khoâng coù sai khaùc so vôùi ñoái chöùng (95,0%). Baûng 10 Tæ leä soáng caù boät sau thôøi gian 24 giôø baûo quaûn tinh truøng trong caùc dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 96,6bc 97,2c 92,5ab 96,5bc 91,8a Caù caùi 1 96,7a 98,3ab 99,6b 98,2ab 98,8ab Caù caùi 2 91,8a 93,3a 96,2a 94,6a 92,9a Caù caùi 3 95,0a 96,3a 96,1a 96,4a 94,5a Trung bình Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
Baûng 11 Tæ leä soáng caù boät sau thôøi gian 48 giôø baûo quaûn tinh truøng trong caùc dung dòch coá ñònh Dung dòch coá ñònh Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS Tris NaCl 98,1c 0,0a 87,9b 89,9b 0,0a Caù caùi 1 95,9b 0,0a 96,4bc 98,1c 0,0a Caù caùi 2 96,8c 0,0a 93,3b 91,4b 0,0a Caù caùi 3 96,93b 0,0a 92,53b 93,13b 0,0a Trung bình Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
1,3a 1,6a 0,5a 0,5a 0,8a Caù caùi 3 0,9a 1,4a 1,3a 0,9a 1,0a Trung bình Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
Tinh truøng ñöôïc pha loaõng vôùi dung dòch coá ñònh, sau ñoù cho vaøo dung dòch chaát baûo veä vaøo ñeå haï thaáp ñieåm ñoâng cuûa moâi tröôøng ngoaïi baøo vaø toác ñoä khöû nöôùc cuûa teá baøo. Trong thí nghieäm, chuùng toâi söû duïng ba dung dòch coá ñònh cho keát quaû toát nhaát (keát quaû ôû phaàn baûo quaûn ngaén ngaøy) laø dung dòch coá ñònh Tris, CF-HBSS, nöôùc muoái sinh lyù NaCl 0,9%, vaø söû duïng ba chaát baûo veä laø DMSO (dimethyl sulfoxide), methanol, glycerol ôû noàng ñoä 5%, 10%, 15%, 20%. Sau ñoù, baét ñaàu ñoâng laïnh vôùi toác ñoä haï nhieät 5-70C cho ñeán khi ñaït ñeán -800C, roài thaû tröïc tieáp vaøo Nitô. Kieåm tra chaát löôïng tinh truøng thoâng qua söï vaän ñoäng tinh truøng sau thôøi gian tröõ tinh ba thaùng vôùi cheá ñoä giaûi ñoâng baèng phöông phaùp xoa tay trong 15 giaây. Keát quaû ñaùnh giaù hoaït löïc vaø söï soáng tinh truøng baûo quaûn trong 3 thaùng trong Nitô loûng ñöôïc trình baøy ôû baûng 14, 15, 16. Baûng 14 Phaàn traêm vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong Nitô loûng Chaát baûo veä tinh truøng Dung Ñoái DMSO Glycerol Methanol dòch chöùng 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% Tris 70,0 26,7 23,3 16,7 5,0 0,0 23,3 16,7 6,7 0,0 0,0 6,7 6,7 CF-HBSS 70,0 36,7 33,3 16,7 16,7 0,0 33,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 NaCl 70,0 5,0 1,7 16,7 1,7 0,0 23,3 30,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Baûng 15 Thôøi gian vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong Nitô loûng Chaát baûo veä tinh truøng Dung Ñoái DMSO Glycerol Metanol Dòch chöùng 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% Tris 56,3 54,3 52,3 55,0 0,0 61,3 53,0 57,0 0,0 0,0 24,7 37,7 51,0 CF-HBSS 51,0 61,3 68,7 67,3 66,0 0,0 66,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 NaCl 51,0 11,0 5,7 3,7 2,3 0,0 73,0 56,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 14
Baûng 16 Kieåu vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong Nitô loûng Chaát baûo veä tinh truøng Dung Ñoái DMSO Glycerol Metanol dòch chöùng 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% Tris 0,7 4,0 2,0 2,0 1,3 1,7 0,0 1,0 1,0 1,0 0,0 0,0 0,7 CF-HBSS 4,0 2,0 2,0 2,0 1,7 0,0 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 NaCl 4,0 2,0 0,3 0,3 1,7 0,0 1,3 1,0 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Qua caùc baûng keát quaû ñaùnh giaù khaû naêng vaän ñoäng tinh truøng baûo quaûn trong Nitô loûng, theo taùc giaû nhaän xeùt thaáy raèng ôû noàng ñoä DMSO 5% vaø 10% thì khaû naêng vaän ñoäng tinh truøng (26,7-33,3% tinh truøng vaän ñoäng vaø kieåu tinh truøng vaän ñoäng laø 2 ôû dung dòch coá ñònh Tris vaø CF-HBSS) toát hôn so vôùi noàng ñoä DMSO 15% vaø 20% (1,7-16,7% tinh truøng vaän ñoäng vaø vaän ñoäng kieåu 1-2). Ñoái vôùi chaát baûo veä glycerol ôû noàng ñoä 10% thì coù keát quaû söï vaän ñoäng tinh truøng (22,3-33,3% tinh truøng vaän ñoäng vaø kieåu tinh truøng vaän ñoäng laø 1-2) trong caùc dung dòch coá ñònh cao hôn so vôùi caùc noàng ñoä khaùc cuûa chaát baûo veä glycerol. Rieâng ñoái chaát baûo veä methanol cho keát quaû hoaït löïc tinh truøng keùm nhaát. Tuy nhieân, chaát löôïng tinh truøng baûo quaûn trong Nitô loûng raát keùm so vôùi ñoái chöùng (70% tinh truøng vaän ñoäng vaø vaän ñoäng kieåu boán). Nhaän xeùt thaáy raèng, söùc soáng tinh truøng baûo quaûn trong Nitô loûng so vôùi tinh truøng töôi thì khoâng ñaït keát quaû nhö yù muoán. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích do trong quaù trình baûo quaûn, söï thaåm thaáu chaát baûo veä chöa ñöôïc xaùc ñònh toát nhaát cuõng nhö toác ñoä haï nhieät chöa phuø hôïp… Thôøi gian caân baèng nhaèm giuùp cho chaát baûo veä thaåm thaáu vaøo teá baøo tinh truøng, giöõa moâi tröôøng ngoaøi vaø beân trong teá baøo ñöôïc caân baèng tröôùc khi cho haï toác ñoä nhieät. Ñieàu naøy coøn tuøy thuoäc vaøo chaát baûo veä vaø noàng ñoä chaát baûo veä. Ñoái vôùi chaát baûo veä laø dung dòch chöùa nhieàu nöôùc vaø khaû naêng gaây ñoäc cho teá baøo. Caùc chaát baûo veä nhö DMSO, 15
methanol, glycerol laø nhöõng chaát coù khaû naêng thaåm thaáu vaøo trong teá baøo. Khaû naêng thaåm thaáu naøy coù lieân quan ñeán troïng löôïng phaân töû cuûa chaát baûo veä. Chaát baûo veä coù troïng löôïng phaân töû thaáp thì coù khaû naêng xuyeân qua maøng teá baøo moät caùch deã daøng (goïi laø chaát baûo veä noäi baøo). Trong thí nghieäm, chaát baûo veä methanol coù troïng löôïng phaân töû thaáp nhaát (32,04), ñeán DMSO (78,13) vaø glycerol (92,1). Ñoái vôùi noàng ñoä chaát baûo veä, do baûn thaân chuùng laø chaát gaây ñoäc cho giao töû nhaát laø ôû noàng ñoä cao; laøm giaûm söï soáng tinh truøng. Chaát baûo veä methanol deå daøng thaåm thaáu nhaát nhöng neáu keùo daøi thôøi gian caân baèng laøm cho teá baøo protein bò bieán tính (Shlafer, 1981), ñieàu naøy aûnh höôûng ñeán khaû naêng soáng soùt cuûa tinh truøng tröôùc khi ñoâng. Chaát baûo veä mang tính thaám cho vaøo dung dòch tinh truøng thì coù hieän töôïng nöôùc töø moâi tröôøng ngoaïi baøo baét ñaàu ñi vaøo beân trong teá baøo tinh truøng. Khi haï ñieåm ñoâng xuoáng thì teá baøo coù hieän töôïng tröông phoàng leân; neáu haï nhieät ñoä xuoáng chaäm quaù, vieäc hình thaønh caùc tinh theå ñaù seõ gaây haïi ñeán teá baøo tinh truøng baèng caùch laøm caùc teá baøo phoàng leân vaø coù theå bò vôõ tung. Do ñoù, chaát baûo veä ngoaïi baøo coù vai troø trong vieäc giuùp moâi tröôøng ngoaïi baøo vaø noäi baøo ñöôïc caân baèng. Ñieàu naøy coù nghóa laø teá baøo phoàng leân (ñaõ cho chaát baûo veä noäi baøo vaøo) roài cho chaát baûo veä ngoaïi baøo vaøo thì coù hieän töôïng nöôùc beân trong teá baøo seõ thoaùt ra ngoaøi, luùc naøy teá baøo khoâng hoàng leân maø ñöôïc co laïi. Khi haï nhieät ñoä xuoáng ñieåm ñoâng, caùc teá baøo tinh tuøng trôû laïi traïng thaùi caân baèng. Quay laïi vôùi keát quaû trong thí nghieäm cho thaáy ñaõ khoâng söû duïng chaát baûo veä ngoaïi baøo, cho neân ñaõ aûnh höôûng ñeán chaát löôïng tinh truøng. Tuy nhieân, trong dung dòch CF-HBSS coù chöùa löôïng glucose neân phaàn naøo giuùp ñöôïc chaát löôïng tinh truøng baûo quaûn toát hôn so vôùi caùc dung dòch coá ñònh khaùc. Toác ñoä laøm laïnh laø chìa khoùa daãn ñeán thaønh coâng trong vieäc baûo quaûn tinh truøng. Neáu teá baøo ñöôïc laøm laøm laïnh nhanh quaù thì vieäc khöû nöôùc khoâng xaûy ra thoûa ñaùng vaø söï hình thaønh tinh theå ñaù laø nguyeân nhaân gaây haïi ñeán caùc cô quan vaø maøng teá baøo; ngöôïc laïi, neáu teá baøo tinh ñöôïc laøm laïnh chaäm quaù thì cuõng aûnh höôûng ñeán chaát löôïng tinh truøng. Trong thí nghieäm, coù theå chöa ñieàu chænh ñöôïc toác ñoä haï nhieät hoaëc nhieät ñoä haï chöa phuø hôïp. Qua vieäc ñaùnh giaù chaát löôïng tinh truøng thoâng qua chæ tieâu ñaùnh giaù söï vaän ñoäng tinh truøng, böôùc ñaàu cho thaáy trong thí nghieäm chaát baûo veä DMSO (noàng ñoä 5%- 10%) vaø glycerol (noàng ñoä 10%) trong dung dòch coá ñònh tinh truøng CF-HBSS vaø Tris mang laïi keát quaû cao so vôùi chaát baûo veä methanol vaø trong dung dòch coá ñònh nöôùc muoái sinh lyù NaCl 0,9%. B. KEÁT QUAÛ CAÙ BASA 1. Phöông phaùp baûo quaûn ngaén ngaøy tinh truøng caù basa Tinh truøng caù sau khi vuoát ra ñöôïc giöõ coá ñònh vaø baûo quaûn trong caùc dung dòch NaCl 0,9%, CF-HBSS, HBSS vaø Tris vôùi tæ leä pha loaõng 1/10 sau ñoù dung dòch tinh truøng naøy ñöôïc giöõ laïnh trong tuû laïnh coù nhieät ñoä töø 4-100C. Chaát löôïng tinh truøng caù seõ thay ñoåi tuøy theo thôøi gian baûo quaûn vaø dung dòch coá ñònh tinh truøng. 16
Ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng tinh truøng sau thôøi gian baûo quaûn trong caùc dung dòch naøy chuùng toâi döïa vaøo caùc chæ tieâu sau a. Phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng Tinh truøng caù Basa ñöôïc baûo quaûn trong caùc dung dòch laøm baát hoaït tinh truøng laø NaCl 0,9%, CF-HBSS, HBSS vaø Tris. Theo thôøi gian, cöù sau 12 giôø baûo quaûn chuùng toâi kieåm tra tinh truøng moät laàn. Laáy khoaûng 0,1mL tinh truøng ñöôïc giöõ trong moãi dung dòch coá ñònh quan saùt döôùi kinh hieån vi ñeå ñaùnh giaù phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng. Keát quaû thu ñöôïc ôû baûng 4.17 Baûng 17 Phaàn traêm tinh truøng vaän ñoäng theo thôøi gian baûo quaûn vaø dung dòch coá ñònh tinh truøng (ñôn vò %) Dung dòch coá ñònh tinh truøng Thôøi gian Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS TRIS NaCl 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 100,0a 12giôø 100,0b 76,7a 100,0b 100,0b 100,0b 24 giôø 100,0c 58,3a 46,7a 86,7b 86,7b 36 giôø 100,0c 23,3a 20,0a 80,0b 80,0b 48 giôø 100,0c 10,0a 10,0a 36,7b 33,3b 60 giôø 100,0c 0,0a 0,0a 16,7b 16,7b 72 giôø 100,0c 0,0a 0,0a 6,7b 5.0b 84 giôø Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
truøng baûo quaûn trong hai dung dòch naøy ñaõ bò cheát hoaøn toaøn. Chaát löôïng tinh truøng baûo quaûn trong hai dung dòch coá ñònh NaCl 0,9% vaø Tris toát hôn ôû hai dung dòch coá ñònh HBSS vaø CF-HBSS. Sau 48 giôø baûo quaûn thì soá löôïng tinh truøng vaän ñoäng ôû dung dòch coá ñònh Tris vaø NaCl 0,9% laø nhö nhau baèng 80% so vôùi ñoái chöùng 100%. Ñeán 84 giôø sau khi vuoát, tinh truøng trong hai dung dòch coá ñònh Tris vaø NaCl 0,9% coøn soáng nhöng soá löôïng khoâng nhieàu. Soá löôïng tinh truøng vaän ñoäng ôû dung dòch Tris laø 6,7% vaø ôû dung dòch NaCl laø 5%. Ñeå giaûi thích ñieàu naøy, theo taùc giaû döïa vaøo aùp suaát thaåm thaáu cuûa caùc dòch baûo quaûn. Theo nghieân cöùu veà thaønh phaàn tinh dòch cuûa Mongkonpunya vaø ctv., 1996 (trích bôûi Terrence R. Tiersch vaø Patricia M. Mazik, 2000), cho raèng, dung dòch coá ñònh tinh truøng neân ñieàu chænh ôû khoaûng 300 mOsmol/kg ñeå giöõ cho tinh truøng soáng laâu. Trong khi ñoù, aùp suaát thaåm thaáu cuûa dung dòch Tris laø 310 mosmol/kg, dung dòch NaCl 0,9% laø 300 mosmol/kg. Hai aùp suaát thaåm thaáu naøy laøm cho chaát löôïng tinh truøng toát. Coøn aùp suaát thaåm thaáu cuûa dung dòch HBSS laø hôi thaáp 286 mosmol/kg, vaø hôi cao ôû dung dòch CF-HBSS laø 320 mosmol/kg neân cho chaát löôïng tinh truøng khoâng toát. b. Thôøi gian tinh truøng vaän ñoäng Song song vôùi vieäc ñaùnh giaù % tinh truøng vaän ñoäng, chuùng toâi duøng ñoàng hoà baám giaây ñeå tính thôøi gian töø khi tinh truøng baét ñaàu vaän ñoäng ñeán khi tinh truøng ngöøng haún. Keát quaû thu ñöôïc ôû baûng 18 Baûng 18 Thôøi gian tinh truøng vaän ñoäng thay ñoåi theo thôøi gian baûo quaûn vaø dung dòch coá ñònh tinh truøng (ñôn vò: giaây) Dung dòch coá ñònh tinh truøng Thôøi gian Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS TRIS NaCl 95,3c 52,0a 60,0a 92,7a 73,3b 12 giôø 95,3c 40,0a 55,3b 89,3a 60,7b 24 giôø 95,3d 38,7a 49,3b 71,3c 50,7b 36 giôø 95,3d 22,3a 24,7a 65,3c 49,3b 48 giôø 95,3c 10,7a 9,3a 28,0b 24,7b 60 giôø 95,3c 0,0a 0,0a 15,3b 15,3b 72 giôø 95,3c 0,0a 0,0a 8,3b 7,0b 84 giôø 18
Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P
Baûng 19 Kieåu vaän ñoäng tinh truøng thay ñoåi theo töøng dung dòch coá ñònh tinh truøng vaø thôøi gian baûo quaûn (ñôn vò: ñieåm) Dung dòch coá ñònh tinh truøng Thôøi gian Ñoái chöùng HBSS CF-HBSS TRIS NaCl 5,0a 5,0a 5,0a 5,0a 5,0a 12giôø 5,0b 4,0a 4,0a 4,0a 4,0a 24 giôø 5,0d 2,7ab 2,3a 3,7c 3,3bc 36 giôø 5,0c 1,7ab 1,3a 2,3a 2,3b 48 giôø 5,0d 0,7ab 0,3a 1,7c 1,3bc 60 giôø 5,0c 0,0a 0,0a 1,3b 1,0b 72 giôø 5,0c 0,0a 0,0a 1,0b 1,0b 84 giôø Caùc giaù trò cuøng haøng coù cuøng maãu töï thì khoâng coù söï sai khaùc ôû xaùc suaát 95% (P