Biến đổi bệnh lý ở tôm chân trắng bị nhiễm gill-associated virus

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 4/2014<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> BIẾN ĐỔI BỆNH LÝ Ở TÔM CHÂN TRẮNG BỊ NHIỄM<br /> GILL - ASSOCIATED VIRUS<br /> PATHOLOGICAL CHANGES IN GILL - ASSOCIATED VIRUS<br /> INFECTED WHITELEG SHRIMP<br /> Nguyễn Thị Thùy Giang1<br /> Ngày nhận bài: 03/3/2014; Ngày phản biện thông qua: 03/6/2014; Ngày duyệt đăng: 01/12/2014<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Bằng phương pháp mô bệnh học và mô hóa miễn dịch, thí nghiệm tập trung quan sát sự biến đổi bệnh lý ở ba cơ quan<br /> đích là cơ quan lympho, mang và gan tụy của Gill-associated virus cảm nhiễm trên tôm chân trắng. Sự biến đổi mô bệnh<br /> học ở cơ quan lympho được đặc trưng bởi sự hình thành và phát triển của các spheroid bắt màu tím được bao bọc bởi các<br /> tế bào dạng sợi, ở mô liên kết, xen giữa các ống lympho. Sự xuất hiện và phát triển của các spheroid có thể là nguyên nhân<br /> gây ra sự biến dạng của cấu trúc ống mô lympho. Ngoài ra, xuất hiện rất nhiều các không bào, các tế bào có nhân bị phân<br /> tán và kết đặc ở cơ quan lympho, đặc biệt ở trong các spheroid. Đây là dấu hiệu cho thấy hiện tượng hoại tử tế bào đang<br /> diễn ra. Không tìm thấy sự xuất hiện của thể spheroid ở cơ quan gan tụy và mang. Tuy nhiên, quan sát thấy hiện tượng nhân<br /> tế bào bị phân tán và kết đặc xuất hiện rải rác ở gan tụy và mang tôm bị nhiễm GAV.<br /> Từ khóa: Gill-associated virus, mô bệnh học, (Lito) penaeus vannamei, thể spheroid của cơ quan lympho<br /> <br /> ABSTRACT<br /> By H&E staining and immunohistochemistry, histopathological changes in target organs (the lymphoid organ,<br /> gill and hepatopancreas) of Gill-associated virus (GAV) infected with whiteled shrimp. Overall, histopathological features<br /> of GAV infection in the lymphoid organ were characterized and developed by spheroid formation, pyknosis, karyorrhexis<br /> and cellular vacuolization. The appearance and development of lymphoid organ spheroid could result in distortion and<br /> disorganization and loss of normal structure of adjacent lymphoid organ tubule. Few histopathological features distinguished<br /> the other target organs of GAV-infected shrimp such as gills and hepatopancreas from those of negative control shrimp.<br /> Pyknotic and karyorrhectic nuclei were infrequently detected in connective tissue of the hepatopancreas and gill.<br /> Keywords: Gill-associated virus, histopathology, (Lito) penaeus vannamei, lymphoid organ spheroid<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Gill-associated virus (GAV) đã được thông báo<br /> là nguyên nhân gây ra tỷ lệ chết rất cao ở tôm sú<br /> Penaeus monodon nuôi tại Úc 1996-1997 (Spann<br /> et al.,1997). Do được xác định là có tới 80 - 85%<br /> sự tương đồng với bộ gen của Yellow head virus<br /> (YHV), nên GAV (hay còn gọi là YHV type 2) được<br /> xếp vào nhóm Yellow head complex virus (YHVC)<br /> (Cowley et al., 1999). Tuy nhiên, cho tới nay, chưa<br /> có thông tin chính thức nào về GAV cảm nhiễm<br /> tự nhiên và gây chết ở tôm chân trắng Penaeus<br /> (Litopenaeus) vannamei. Mặc dù vậy, theo<br /> <br /> 1<br /> <br /> Nguyễn Thị Thùy Giang (2012), GAV không gây<br /> chết sau 14 ngày cảm nhiễm nhưng có khả năng<br /> gây bệnh ở P. vannamei với dấu hiệu bệnh lý như:<br /> ruột rỗng do bỏ ăn, cơ thể nhợt nhạt, vỏ mềm. Cơ<br /> quan đích của GAV khi cảm nhiễm ở P. vannamei<br /> đã được xác định là: cơ quan lympho, mang, gan<br /> tụy, cơ quan tạo máu, dạ dày, ruột tịt, tuyến sinh<br /> dục, hạch thần kinh, tuyến anten và các phần phụ.<br /> Để làm rõ hơn về khả năng gây bệnh của GAV trên<br /> tôm chân trắng, nghiên cứu này tập trung tìm hiểu<br /> sự biến đổi bệnh lý trong tế bào và mô ở một số cơ<br /> quan đích của tôm P. vannamei do tác hại của GAV.<br /> <br /> Nguyễn Thị Thùy Giang: Viện Nuôi trồng thủy sản – Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> 34 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Địa điểm nghiên cứu<br /> - Phòng Virus học của Khoa Thú y, Trường Đại<br /> học Ghent (Vương quốc Bỉ).<br /> - Phòng Thực nghiệm ướt của Khoa Thú y,<br /> Trường Đại học Ghent (Vương quốc Bỉ).<br /> 2. Vật liệu<br /> 2.1. Tôm chân trắng khỏe dùng cho thí nghiệm<br /> Hậu ấu trùng tôm chân trắng P. vannamei SPF<br /> (specific pathogen free) không bị nhiễm các loại<br /> virus nguy hiểm như: White spot syndrome virus<br /> (WSSV), Taura syndrome virus (TSV), Infectious<br /> hypodermal and hematopoietic necrosis (IHHNV),<br /> Infectious myonecrosis virus (IMN) và Yellow head<br /> virus (YHV), được ương nuôi trong hệ thống nước<br /> tuần hoàn ở nhiệt độ 28 ± 10C, pH: 7,8 - 8,1 và độ<br /> mặn 35 ppt.<br /> 2.2. Chủng virus GAV<br /> Một chủng GAV được cung cấp bởi Viện Nông<br /> nghiệp Nhiệt đới Úc (CSIRO), chủng virus này<br /> được phân lập từ tôm sú (Penaeus monodon) nuôi<br /> bị nhiễm GAV tại quốc gia này (AUS-96-Ref strain<br /> of GAV).<br /> Phương pháp tạo virus stock được mô tả theo<br /> Nguyễn Thị Thùy Giang (2012).<br /> 2.3. Kháng thể đơn dòng (Mab) để xác định kháng<br /> nguyên của YHV trong kỹ thuật hóa mô miễn dịch<br /> Y19 là kháng thể đơn dòng kháng lại nucleoprotein<br /> p20 của YHV (Sithigorngul et al, 2002) được cung<br /> cấp từ Phòng Sinh vật học, Khoa Khoa học, thuộc<br /> Đại học Srinakharinwirot, Bangkok, Thái Lan.<br /> 2.4. Kháng thể thứ cấp Biotinylated sheep<br /> anti-mouse IgG antibody (RPN1001 Amersham<br /> Biosciences, UK)<br /> Được sử dụng như kháng thể thứ cấp trong<br /> phương pháp mô hóa miễn dịch. Kháng thể chiết<br /> xuất từ cừu được gắn Biotin này sẽ tạo nên phản<br /> ứng đặc hiệu với Immunoglobulin của kháng thể<br /> sơ cấp Mab Y19. Kháng thể này tiếp tục sẽ được<br /> nhận biết bởi phức hợp chứa enzyme Streptavidine<br /> biotinylated horseradish peroxidase complex<br /> (RPN1051 Amersham Biosciences, UK) theo mối<br /> gắn kết Biotin - strepavidine trong bước tiếp theo<br /> của phương pháp mô hóa miễn dịch.<br /> 3. Thiết kế thí nghiệm<br /> 60 con tôm có kích cỡ 15-20 g/con được sử<br /> dụng cho thí nghiệm cảm nhiễm GAV. Dịch virus<br /> stock (mô tả ở mục 2.2.) được pha loãng với PBS<br /> theo tỷ lệ 1:3 (có pH = 7,4). Dịch virus này được tiêm<br /> vào cơ bụng (đốt bụng 3 hoặc 4) của 50 con tôm khỏe<br /> với liều 50 µl/con tôm và 10 con tôm khỏe khác ở<br /> nghiệm thức đối chứng được tiêm 50 µl Phosphate<br /> buffered saline (PBS)/con tôm. Sau cảm nhiễm,<br /> <br /> Số 4/2014<br /> tôm được nuôi dưỡng tách biệt trong các bể kính có<br /> thể tích 10 lít với nước biển nhân tạo có độ mặn<br /> 35 ppt và nhiệt độ nước 27 ± 10C, sục khí liên tục<br /> ngày đêm. Tôm cảm nhiễm virus được thu mỗi lần 5<br /> con ở các thời điểm 0, 6, 12, 18, 24, 48, 72, 120, 168,<br /> 240 và 336 h sau cảm nhiễm (hour post infection hpi). Trong khi đó, tôm đối chứng được thu mỗi lần 5<br /> con ở 72 và 336 hpi. Theo phương pháp của Bell &<br /> Lightner (1988) & Lightner (1996), mẫu thu được cố<br /> định bằng cách tiêm 2ml dung dịch Davidson vào<br /> phần đầu ngực và phần bụng của mỗi con tôm, sau<br /> đó được cố định trong dung dịch Davidson với tỷ lệ về<br /> thể tích là 1:10. Sau 48h, các mẫu này được chuyển<br /> sang cồn ethanol 50% để bảo quản. Mẫu sẽ được<br /> đưa vào xử lý, đúc paraffin và cắt lát khoảng 5µm bề<br /> dày, cố định lên lam và lưu giữ trong điều kiện nhiệt<br /> độ phòng cho các bước phân tích tiếp theo.<br /> 4. Phương pháp phân tích mẫu tôm<br /> 4.1. Phương pháp hóa mô miễn dịch<br /> (Immunohistochemistry - IHC)<br /> Phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC)<br /> được giới thiệu bởi Sithrigorngul et al. (2000) và<br /> Escobedo-Bonilla et al. (2007) được sử dụng trong<br /> nghiên cứu này để xác định các loại mô đích và cơ<br /> quan đích của GAV khi virus này cảm nhiễm vào<br /> tôm chân trắng bằng phương pháp tiêm cơ.<br /> Các tiêu bản đã được gắn với các lát cắt của<br /> mô tôm được bảo quản ở 550C, trong 30 phút. Tiếp<br /> theo các tiêu bản này được làm mất parafin và no<br /> nước bằng cách đặt các lam mẫu trong xilen và cồn<br /> ethanol có nồng độ giảm dần: 100%, 95%, 70% và<br /> 50%, trong 5 phút cho mỗi bước thực hiện. Sau đó các<br /> lam mẫu được rửa trong dung dịch đệm Tris-NaCl,<br /> trong 5 phút. Ủ các lam mẫu này trong dung dịch gồm:<br /> 1% sodium azide và 0,02% hydrogen peroxidase<br /> trong dung địch đệm Tris có pH = 7,4. Tiếp tục các<br /> lam mẫu này được ủ với kháng thể sơ cấp Y19 với<br /> độ pha loãng 1/200, ở nhiệt độ 370C, trong thời gian<br /> 1 giờ, sau đó các lam mẫu được rửa trong dung dịch<br /> Tris-có muối (NaCl). Các slides mẫu được ủ tiếp<br /> kháng thể thứ cấp, biotinylated sheep antimouse<br /> IgG antibody, trong 1 giờ ở nhiệt độ 370C. Các lam<br /> mẫu lại được rửa một lần nữa với đệm Tris-NaCl<br /> trước khi ủ với dung dịch streptavidine biotinyllated<br /> horseradish peroxidase (RPN1051, Amersham<br /> Biosciences - UK) ở độ pha loãng 1/200, trong 30 phút<br /> ở nhiệt độ phòng. Phát triển màu cho các mẫu mô<br /> được làm với 0,01% của 3, 3’- diaminobenzidine -DAB<br /> (D8001 Sigma-Aldrich, Đức) trong đệm Tris không<br /> có NaCl, trong 10 - 15 phút. Các lam mẫu được<br /> nhuộm với hematoxylin, sau đó rửa, làm mất nước<br /> trong cồn ethanol, làm trong mẫu trong xilen và<br /> đậy mẫu bằng lamen với keo dán kính. Quan sát<br /> các lam mẫu này dưới kính hiển vi quang học.<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 35<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Các vùng mô dương tính với GAV (YHV type 2) thể<br /> hiện có màu nâu, khác biệt với các vùng mô âm tính<br /> có màu xanh đen của hematoxylin.<br /> 4.2. Phương pháp mô bệnh học (Hematoxylin &<br /> Eosin staining - H&E)<br /> Các tiêu bản đã gắn lát cắt mô của tôm chân<br /> trắng được đưa vào nhuộm H & E theo quy trình của<br /> Lightner (1996). Quá trình này được thực hiện bằng<br /> máy nhuộm tự động Linear Stainer II SAKURA. Các<br /> lam chứa mẫu sẽ được làm no nước qua các bước<br /> xử lý xylene, cồn ethanol (ở các nồng độ: 100%,<br /> 95%, 80%, 75%, 50%) và nước. Sau đó mẫu sẽ<br /> được nhuộm với Hematoxylin, rửa nước và nhuộm<br /> tiếp với Eosin. Sau đó mẫu được rửa nước và xử<br /> lý qua các nồng độ cồn ethanol (ngược lại trình tự<br /> trên) và xylene để khử nước và làm trong mẫu.<br /> Thời gian 1’45s/bước. Sau khi được phủ Distyrene<br /> Plasticizer Xylene (DPX), mẫu được gắn lamen.<br /> Các tiêu bản này được quan sát dưới kính hiển vi<br /> quang học (LEICA) ở các độ phóng đại khác nhau:<br /> 100, 200, 400 và 1000 lần.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Ở 72 hpi, rất nhiều các spheroid đã xuất hiện,<br /> bắt màu tím được hình thành xen giữa các ống mô<br /> lymphoid bắt màu hồng đỏ. Một số spheroid chứa<br /> nhiều tế bào phình to và được bao bọc bởi những<br /> cấu trúc màng mỏng. Cấu trúc của các ống lympho<br /> hầu như không có biến đổi đặc biệt nào so với mẫu<br /> đối chứng.<br /> Tuy nhiên, vào các thời điểm tiếp theo (120 và<br /> 168 hpi), những vùng mô bị thương tổn được quan<br /> sát rõ ràng hơn. Ở thời gian này đã xuất hiện rất<br /> nhiều các thể spheroid bắt màu tím đậm. Sự hoại<br /> tử tế bào bắt đầu được quan sát thấy ở trong các<br /> thể spheroid với sự xuất hiện của các không bào<br /> và các tế bào với nhân bị kết đặc hoặc phân tán.<br /> Sự hình thành rất nhiều các thể spheroid có thể<br /> là nguyên nhân gây ra sự biến dạng về cấu trúc<br /> mô của các ống lympho. Kích thước của các thể<br /> spheroid tăng nhanh theo thời gian. Từ ngày thứ<br /> 10 trở đi (240 - 336 hpi), hiện tượng hoại tử tế bào<br /> trong các spheroid diễn ra nghiêm trọng hơn. Các<br /> spheroid chứa chủ yếu là các tế bào với nhân tế bào<br /> kết đặc hoặc phân tán cũng như rất nhiều các không<br /> bào. Hiện tượng hoại tử tế bào cũng được tìm thấy<br /> ở các ống lympho tuy nhiên không phổ biến như ở<br /> trong các spheroid (hình 1).<br /> Như vậy, sự biến đổi bệnh lý ở cơ quan lympho<br /> của tôm chân trắng bị nhiễm GAV được đặc trưng<br /> bởi sự hình thành và phát triển của các spheroid<br /> (Lymphoid organ spheroid - LOS). Sự biến dạng của<br /> cấu trúc ống ở cơ quan lympho (Lymphoid organ<br /> tubule - LOT) chỉ được quan sát thấy ở thời gian<br /> cuối của thí nghiệm cảm nhiễm. Nguyên nhân có thể<br /> do sự xuất hiện dày đặc và sự phình to của các thể<br /> spheroid nằm xen giữa các ống lympho, gây chèn ép.<br /> <br /> Tôm đối chứng âm<br /> <br /> 1. Biến đổi mô bệnh học ở cơ quan lympho<br /> Mặc dù bằng phương pháp mô hóa miễn dịch,<br /> dấu hiệu GAV(+) ở cơ quan lympho được phát hiện<br /> ở 24 hpi nhưng không có sự biến đổi đặc trưng nào<br /> trong mô và tế bào, cũng như không có sự hình<br /> thành spheroid được quan sát thấy ở cơ quan này.<br /> Những biến đổi đầu tiên ở cơ quan lympho của<br /> của P. vannamei bị cảm nhiễm GAV được quan sát<br /> thấy sau 48h cảm nhiễm, đó là sự xuất hiện các<br /> không bào và sự tập trung của các tế bào máu ở<br /> phần mô liên kết bên ngoài các ống lympho.<br /> <br /> Số 4/2014<br /> <br /> B1<br /> <br /> A2.<br /> <br /> B2. GAV(+) (mũi tên)<br /> <br /> 24 hpi<br /> <br /> A1. Ống lympho (mũi tên)<br /> <br /> 36 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> 48 hpi<br /> <br /> Số 4/2014<br /> <br /> C2<br /> <br /> D1. Sự xuất hiện các thể spheroid (mũi tên trắng),<br /> ống lympho (mũi tên đen)<br /> <br /> D2<br /> <br /> E1. Ống lympho bị biến dạng (mũi tên trắng), nhân tế bào bị kết đặc<br /> (mũi tên đen)<br /> <br /> E2<br /> <br /> F1. Thể spheroid (mũi tên trắng) chứa nhiều không bào (mũi tên đen)<br /> <br /> F2<br /> <br /> G1. Không bào và nhân tế bào bị phân tán và kết đặc (mũi tên) bên<br /> trong thể spheroid<br /> <br /> G2<br /> <br /> 240-336hpi<br /> <br /> 168 hpi<br /> <br /> 120hpi<br /> <br /> 72hpi<br /> <br /> C1. Sự xuất hiện các không bào và các tế bào máu ở mô liên kết<br /> (vòng tròn)<br /> <br /> Hình 1. Biến đổi bệnh lý ở cơ quan lympho của tôm bị nhiễm GAV<br /> A1-G1: nhuộm H&E, A2-G2: nhuộm IHC, màu nâu là phản ứng GAV (+)<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 37<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 4/2014<br /> <br /> 2. Biến đổi mô bệnh học ở cơ quan mang và<br /> gan tụy<br /> Dù chưa có hiện tượng chết khi tôm chân trắng<br /> bị nhiễm GAV sau 14 ngày, nhưng bệnh lý ở tế bào<br /> và mô của mang và gan tụy đã thể hiện tương tự<br /> như tôm sú bị nhiễm GAV (Spann et al.,1997). Ở mô<br /> mang của tôm bệnh xuất hiện các tế bào có nhân<br /> <br /> A<br /> <br /> bị phân tán hoặc bị kết đặc, tuy nhiên không phát<br /> hiện được các spheroid ở tổ chức này (hình 2). Ở tổ<br /> chức gan tụy, hầu như không quan sát được sự bất<br /> thường ở biểu mô hình ống, nhưng tại các mô liên<br /> kết nối các ống gan tụy đã thể hiện sự biến đổi: xuất<br /> hiện hoại tử, sự tách rời của các tế bào, nhân tế bào<br /> bị đông kết hay phân tán (hình 3).<br /> <br /> B. Mũi tên: nhân kết đặc<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 2. Biến đổi bệnh lý ở mang của tôm bị nhiễm GAV<br /> A&B: nhuộm H&E, C: nhuộm IHC<br /> <br /> A<br /> <br /> B. Mô liên kết bị hoại tử và nhân kết đặc<br /> (mũi tên)<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 3. Biến đổi bệnh lý ở gan tụy A&B: nhuộm H&E, C: nhuộm IHC<br /> <br /> 3. Thảo luận<br /> Cơ quan lympho được cho là cơ quan đích<br /> chính của nhiều tác nhân virus cũng như có liên<br /> quan đến phản ứng tiêu diệt virus của vật chủ. Sự<br /> hình thành các spheroid trong cơ quan lymphoid<br /> của tôm bị nhiễm virus YHCV được ghi nhận bởi<br /> các báo cáo khác như: Spann et al. (1997, 2003),<br /> Duangsuwan et al. (2008), Annantasombon et al.<br /> (2008). Tuy nhiên, thông tin về nguyên nhân hình<br /> thành spheroid và chức năng hoạt động vẫn còn rất<br /> hạn chế.<br /> Một số ý kiến cho rằng các spheroid có vai<br /> trò cô lập, tiêu diệt virus cảm nhiễm và liên quan<br /> đến hiện tượng cảm nhiễm mãn tính của GAV ở<br /> P. vannamei. Trong giai đoạn sớm của bệnh, virus<br /> GAV tồn tại trong các tế bào mô liên kết của cơ quan<br /> lymphoid. Sau đó, các tế bào này bị thực bào và<br /> được các tế bào thực bào chuyển vào trong các<br /> thể LOS. Các virus ở trong các LOS sẽ bị cô lập và<br /> tiêu diệt bằng hiện tượng hoại tử của tế bào (necrosis<br /> và apoptosis). Ở giai đoạn cảm nhiễm mãn tính, một<br /> lượng virus vẫn tồn tại và các LOS sẽ tiếp tục được<br /> hình thành. Do đó trong giai đoạn mãn tính, virus<br /> chỉ được phát hiện ở trong các spheroid, ngược lại<br /> trong giai đoạn cấp tính, virus hầu như được phát<br /> hiện ở trong các tế bào LOT (Hasson et al., 1999;<br /> <br /> 38 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Spann et al., 2003; Anggraeni et al., 2000;<br /> Duangsuwan et al.; 2008, Rusaini et al., 2010). Điều<br /> này cũng được thể hiện trong nghiên cứu này, các<br /> LOS xuất hiện ở cơ quan lympho của tôm chân<br /> trắng sau 48h cảm nhiễm GAV và một lượng lớn<br /> các LOS thể hiện dấu hiệu GAV(+) vẫn tồn tại ở cơ<br /> quan lympho sau 2 tuần cảm nhiễm.<br /> Sự hình thành LOS còn được cho rằng có liên<br /> quan đến sự chống chịu của P. vannamei với YHV<br /> hay GAV. Anantasomnoon et al. (2008) báo cáo rằng<br /> những con tôm sống sót sau dịch bệnh YHV hoặc<br /> bị cảm nhiễm YHV với cường độ thấp có khả năng<br /> tiếp tục sinh trưởng và phát triển như những sinh<br /> vật mang virus. Sự thương tổn bệnh lý ở LOT ở giai<br /> đoạn đầu cảm nhiễm bị thay thế bởi trạng thái bình<br /> thường của LOT cùng với sự xuất hiện rất nhiều<br /> LOS có phản ứng (+) với YHV.<br /> Ngoài ra, trong nghiên cứu này, sự xuất hiện<br /> của các không bào và các tế bào với nhân bị phân<br /> tán và kết đặc cũng được chú ý, đây là dấu hiệu cho<br /> thấy hiện tượng hoại tử tế bào đang diễn ra. Hiện<br /> tượng hoại tử tế bào ở các cơ quan đích của tôm<br /> bị nhiễm YHCV cũng được công bố bởi nhiều nhóm<br /> tác giả (Chantanachookin et al., 1993; Khanobdee et<br /> al., 2002; Anantasomnoon et al., 2008). Khanobdee<br /> et al. (2002) cho rằng sự hoại tử tế bào chính<br /> <br />