CHƢƠNG II. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT – NHÂN GIỐNG IN VITRO

Chia sẻ: Nguyễn Thị Phương Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST

Báo xấu

1.028
lượt xem 292
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

CHƢƠNG II. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT – NHÂN GIỐNG IN VITRO Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đây là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học.

Chủ đề:

Bình luận(2) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CHƢƠNG II. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT – NHÂN GIỐNG IN VITRO

CHƢƠNG II. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT – NHÂN GIỐNG IN VITRO Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đây là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật này đã làm nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Những kiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng được củng cố và có nhiều bước tiến rõ rệt. Với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện được. 1. Giới thiệu sơ lƣợc về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.1. Giới thiệu Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hoá học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người. 1.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt l n đ u tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. 8 
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua. Năm 1964, Ball là người đ u tiên tìm ra m m rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành ph n dinh dưỡng quan trọng c n thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy. Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đ u tiên được thương mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa. 1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. 1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, có thể tiến hành so sánh đặc tính cơ thể với các hợp ph n của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra mối tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo, từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của mình. Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo 9 
hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể tiến hành nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy, rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó, tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật, giúp cho việc phòng bệnh cho cây tốt hơn, đỡ tốn kém hơn. 1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tác giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất: sinh khối được tạo ra vẫn giữ nguyên được thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn trong nông nghiệp. Hình 2.1. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô 2. Các bƣớc nhân giống in vitro 2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy c n lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy ngân,... 2.2. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. 10 
2.3. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài. Hình 2.2. Các bước nhân giống in vitro 2.4. Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đ y đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy g n với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. 2.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,... Sau khoảng 2 tu n, cây đã bắt đ u thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh 11 
dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, trong những ngày đ u tiên c n phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ d n d n lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. 3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 3.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro: Kiểu di truyền Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá m m thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá m m và cây hạt tr n rất khó tái sinh (trừ khi chúng còn non). Trong một số cây hai lá m m thì Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae và Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên thì chúng h u như dễ tái sinh in vitro. Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của cây Kalanchoe farinacea h u như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy. Tuổi của cây Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu cấy mô. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi. Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đ u. Đôi khi qua nhiều l n cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như nho (Pinus vinifera), táo tây (Malus sylvestris), cây tuyết tùng (Cryptomeria japonica). Tuổi của mô và cơ quan Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái 12 
sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như cây cải âm (Lunaria annua), cây báo xuân (Primula obconica). Tình trạng sinh lý Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản. Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này. Vị trí của mẫu cấy trên cây Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phát triển in vitro sau khi tách mẫu ở cây lãnh sam (Pseudotsuga menziesii), ông nhận thấy những chồi ban đ u được tách từ vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ ph n gốc của vảy hành tốt hơn từ ph n đỉnh. Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ những ph n khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau. Kích thước mẫu cấy Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các ph n được tách rời khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, ph n trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Vết thương Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngoài ra, có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương. Phương pháp cấy Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với ph n gốc cắm xuống môi trường) hoặc không có cực (cắm ph n ngọn xuống môi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy không cực. Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đ y đủ oxy nhưng 13 
những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng. Ph n gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường. Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae, sự tái sinh chỉ xảy ra ở ph n gốc của vảy hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành ph n môi trường. Thành ph n này thay đổi tuỳ theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành ph n môi trường cũng thay đổi. Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tuy nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành ph n: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Khoáng đa lƣợng: nhu c u khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng c n phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe. Khoáng vi lƣợng: nhu c u khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hoá chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp ph n nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng c n cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo… Carbon và nguồn năng lƣợng: trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose ban đ u có thể ảnh hưởng đến một số tham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy. Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin c n thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng c n vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở 14 
thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật: có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Miller là người đ u tiên nhận thấy tỉ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy. Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau.  Auxin tự nhiên là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc g n giống IAA và có cùng vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin (như IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid). Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh). Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ, auxin c n phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tổng hợp được), amino acid (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho- diphenolic (như cafeic acid, chlorogenic acid).  Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và RNA. Hợp chất cytokinin đ u tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là zeatin – một hợp chất có trong ph n lớn thực vật và vài vi khuẩn, cấu trúc g n giống kinetin nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 l n. Sau zeatin, hơn 30 cytokinin khác nhau đã được cô lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm hợp chất, thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống kinetin. Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, thí dụ như BA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy các mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách; sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào lá trưởng thành. Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ Auxin/Cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi. Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối 15 
kháng giữa auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin (giúp tạo chồi); sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển. Hình 2.3. Công thức của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài năm thành ph n cơ bản trên, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành ph n xác định (amino acid, EDTA,…) và một số chất có thành ph n không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… vào môi trường nuôi cấy. Các hợp chất hữu cơ không xác định: bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô. Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua. Tuy nhiên, chỉ có nước dừa và protein hydrolysate được sử dụng rộng rãi. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác: mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid c n thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu c u của tế bào và nguồn nitơ này được tế bào hấp thu nhanh hơn so với nitơ vô cơ. Các nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L- glutamine, L-asparine và adenine. Than hoạt tính: việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng và làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởng của mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hoà sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2iP. Khả 16 
năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. Yếu tố làm đặc môi trƣờng: agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ở nhiệt độ 60 - 100oC, đặc lại khi nhiệt độ xuống còn 45oC vì vậy agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa, agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường. Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5 (Gamborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn. 4. Nuôi cấy mô tạo ra cây hoàn chỉnh 4.1. Nuôi cấy nốt đơn thân Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn. Chồi được thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá tiếp tục được cấy chuyền đến khi đạt đủ số lượng chồi c n thiết thì chúng được cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất. Tuy nhiên khi áp dụng phương pháp này có một số điểm c n lưu ý:  Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp theo dạng hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng bị nhiễm cao. Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh.  Để giảm khả năng bị nhiễm, nên chọn những chồi còn khép kín. Nếu như cây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.  Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào số lượng chồi có sẵn. Chồi tăng trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống.  Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt đối với cây thân gỗ, tăng trưởng hơn rất nhiều so với chồi trưởng thành.  Sự tạo rễ trên các chồi đã trưởng thành khó thực hiện vì vậy c n phải trẻ hóa chồi để có thể cảm ứng được sự ra rễ. 17 
Phương pháp này đã được thực hiện thành công trên một số đối tượng như: cây măng tây, khoai tây, lê, hoa hồng, cà chua, dưa chuột, cà tím,… 4.2. Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân. Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thường không c n đến cytokinin để phát triển. Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này được tiếp tục chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục được tạo ra... Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh. Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung: đ u tiên, chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự hình thành các chồi bên. Phương pháp nhân giống bằng chồi bên được tiến hành l n đ u tiên trên cây cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền. Hiện nay, phương pháp này được áp dụng cho nhiều loài thực vật và phổ biến là ở một số loài cây ăn trái. 4.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đặc biệt, virus có thể chuyển sang các thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu tính và cả trong quá trình nhân giống vô tính in vitro. Trong đỉnh sinh trưởng của thực vật có một sự cạnh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo ra các tế bào con. Ở vùng mô phân sinh, trong suốt quá trình phân chia của tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucleic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho sự tăng sinh của virus. Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch bệnh virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn. Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu được cây sạch bệnh thấp. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng với những cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily,... Một số cây thân gỗ như anh đào, mâm 18 
xôi, nho, cây đ u xuân,... cũng được nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh. 4.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn K ỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép (DH, double haploid). Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo. Đây là kỹ thuật không phức tạp lắm, nhưng lại rất có hiệu quả trong chọn tạo giống cây trồng, nhất là đối với cây trồng cho hạt như lúa. Kỹ thuật nuôi cấy b ao phấn và hạt phấn đã được phát triển thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội. Sử dụng phương pháp này, các nhà chọn giống lúa đã rút ngắn rất nhiều thời gian và cũng giảm bớt các chi phí về lao động, không gian c n thiết để tạo ra các dòng thu n. 5. Một số hệ thống nuôi cấy mới 5.1. Nuôi cấy lỏng có sục khí – Bioreactor Hiện nay, h u hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiện trên những hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểm chung là mẫu cấy đều phát triển trên môi trường đặc. Nuôi cấy trên môi trường đặc chủ yếu trên những thiết bị nuôi có kích thước nhỏ nên môi trường nuôi cấy không đủ đáp ứng cho sự phát triển lâu dài của mẫu cấy. Hơn nữa, khi nuôi cấy trên môi trường đặc, môi trường bị lãng phí do cây không hấp thu hết các chất dinh dưỡng ở ph n đáy của bình nuôi cấy. Các hệ thống nuôi cấy lỏng trên máy lắc ban đ u dựa trên mô hình nuôi cấy vi sinh vật và tế bào động vật nhằm phục vụ trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào và thu nhận các hợp chất thứ cấp. Mẫu cấy trong môi trường lỏng có khả năng tăng trưởng nhanh hơn so với môi trường đặc. Có thể do mẫu cấy được tiếp xúc hoàn toàn trong môi trường nên hấp thu đều các chất dinh dưỡng từ môi trường. Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc của các bình lên men nhưng các cánh khuấy bằng kim loại được thay bằng các ống silicon sục khí, có thể điều khiển được tốc độ dòng khí vào để hạn chế sự tương tác bất lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu. Vì thế, hệ thống bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như: nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, củ khoai tây bi in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc biệt là nuôi cấy thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ nhân sâm. 19 
Hình 2.4. Hệ thống nuôi cấy bioreactor 5.2. Nuôi cấy quang tự dưỡng Nuôi cấy quang tự dưỡng đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất giống cây trồng. Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng của cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và làm hạ giá thành cây in vitro. Phương pháp mới này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuyết tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình nuôi cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành ph n không khí, ẩm độ, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy,…) thay vì chỉ nghiên cứu thành ph n hóa học của môi trường nuôi cấy như nồng độ đường, muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cấy mô vẫn thường quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Nói đúng hơn là không sử dụng các cơ chất hữu cơ bao gồm cả các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi trường. Điều này dựa trên cơ sở trong tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp lục tố điều có khả năng tự quang hợp để tồn tại và phát triển. Tất cả các cơ quan dùng trong nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khả năng quang hợp. Chúng có thể nhận CO2 trong không khí làm nguồn carbon trong quá trình quang hợp mà không c n đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy. Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Sự loại bỏ đường trong 20 
môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm. Điều này đem lại ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể song song với việc giảm nguyên vật liệu. Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa cây cấy mô được xem như một nhà kính thu nhỏ. Với phương pháp này sự tăng trưởng và phát triển của cây in vitro ph n lớn chịu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, nồng độ CO2, sự trao đổi khí. Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai yếu tố quan trong nhất trong nuôi cấy mô quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố. Sự gia tăng khác biệt giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài hộp nuôi cấy cùng với sự gia tăng cường độ ánh sáng làm cho hiệu suất quang hợp tăng. 6. Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống:  Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn,... mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được.  Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn, trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu c u thương mại.  Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền.  Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.  Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,...  Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích rất nhỏ.  Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.  Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn cây đực (cây măng tây) theo mong muốn.  Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gene. Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã được đề cập ở ph n trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm c n phải được khắc phục:  Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao.  Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và c n khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm.  Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình.  Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. 21 