CHƢƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN – THU NHẬN SẢN PHẨM THỨ CẤP

Chia sẻ: Nguyễn Thị Phương Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST

Báo xấu

792
lượt xem 147
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

CHƢƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN – THU NHẬN SẢN PHẨM THỨ CẤP Đã từ lâu, các nhà khoa học đã cho rằng tế bào thực vật là một đơn vị độc lập trong cơ thể thực vật. Đã là đơn vị độc lập thì chúng hoàn toàn có khả năng tự trao đổi chất, sinh sản và phát triển. Nuôi cấy mô thực vật có giá trị đối với nghiên cứu sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp và cũng có thể cung cấp các phương thức sản xuất các sản phẩm chuyển...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CHƢƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN – THU NHẬN SẢN PHẨM THỨ CẤP

Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn CHƢƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN – THU NHẬN SẢN PHẨM THỨ CẤP Đã từ lâu, các nhà khoa học đã cho rằng tế bào thực vật là một đơn vị độc lập trong cơ thể thực vật. Đã là đơn vị độc lập thì chúng hoàn toàn có khả năng tự trao đổi chất, sinh sản và phát triển. Nuôi cấy mô thực vật có giá trị đối với nghiên cứu sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp và cũng có thể cung cấp các phương thức sản xuất các sản phẩm chuyển hóa quan trọng của thực vật. 1. Khái niệm tế bào đơn và sản phẩm thứ cấp Năm 1838, Schleiden – giáo sư thực vật học ở Jena – đã cho rằng: “Tế bào là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc thực vật”. Theo ông, quá trình căn bản trong sự phát triển thực vật là sự thành lập các tế bào sống độc lập trong một kiểu cấu trúc nào đó của cá thể thực vật nguyên vẹn. Mãi đến năm 1954, Muir và các cộng sự mới bắt đầu những nghiên cứu về sự phát triển của tế bào đơn thực vật trong môi trường nhân tạo. Tuy nhiên, những nghiên cứu của họ chưa hoàn chỉnh và các nghiên cứu này chỉ mang tính chất thăm dò. Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những tác giả đầu tiên tách và nuôi cấy thành công tế bào đơn của thực vật trong các bình lên men với môi trường nhân tạo. Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỉ XX đến nay, các nhà khoa học đã công bố hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy tế bào đơn của các loài thực vật khác nhau để thu nhận những sản phẩm thứ cấp. Trong đó, đáng lưu ý nhất là những kết quả của Street. Ông đã hoàn chỉnh toàn bộ công nghệ nuôi cấy từ giai đoạn đầu đến giai đoạn tinh sạch các sản phẩm bậc 2. Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào đi ra môi trường ngoài. Phần lớn các chất thứ cấp thường không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối với bản thân các tế bào. Quá trình tạo ra những sản phẩm bậc 2 chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa. Tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các hệ thống thích hợp để sản xuất ra những hợp chất thứ cấp với sản lượng cao hơn cây nguyên vẹn (Bảng 4.1). 35
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Bảng 4.1. Các sản phẩm thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy tế bào Hợp chất Nguồn thực vật Dạng nuôi cấy Shikonin Lithospermum erythrorhizon S Ginsenoside Panax ginseng C Anthraquinone Morinda citrifolia S Ajmalicine Catharanthus roseus S Acid rosmarinic Coleus blumeii S Ubiquinone-10 Nicotiana tabacum S Diosgenin Dioscorea deltoides S Benzylisoquinoline alkaloid Coptis japonica S Berberine Thalictrum minor S Nicotin Nicotiana tabacum C Bisoclaurine Stephania cepharantha S Tripdiolide Tripteryqium wilfordii S Ghi chú: C – Callus (mô sẹo); S – Cell suspension (huyền phù tế bào) Điểm khác biệt giữa nuôi cấy tế bào đơn thực vật và nuôi cấy tế bào vi sinh vật: Nuôi cấy tế bào đơn thực vật đòi hỏi mức độ vô trùng cao hơn rất nhiều so - với mức độ vô trùng trong nuôi cấy vi sinh vật. - Trong quá trình phát triển ở môi trường nuôi cấy nhân tạo, các tế bào vi sinh vật thường tồn tại độc lập trong khi tế bào đơn của thực vật tạo ra những huyền phù tế bào. - Tế bào thực vật thường phân chia chậm hơn tế bào vi sinh vật. Vì thế, trong một thời gian nhất định, lượng sinh khối thu được từ tế bào vi khuẩn cao hơn nhiều so với tế bào thực vật. - Các chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật và của tế bào đơn thực vật hoàn toàn khác nhau. - Tế bào thực vật thuộc loại quang tự dưỡng trong khi phần lớn tế bào vi sinh vật lại thuộc loại dị dưỡng. 2. Nuôi cấy tế bào đơn 2.1. Đặc điểm sinh lý của tế bào đơn trong nuôi cấy Tế bào đơn khi phát triển trong môi trường lỏng theo phương pháp nuôi cấy gián đoạn thường tạo ra dòng tế bào. Dòng tế bào là một huyền phù gồm rất nhiều tế bào tạo thành. Dòng tế bào có những điểm quan trọng sau: - Dòng tế bào cho phép tách riêng từng tế bào rất dễ dàng. 36
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Các tế bào trong dòng tế bào có độ đồng nhất cao. - Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường có nhân to hơn, - nguyên sinh chất đậm đặc hơn so với tế bào nguyên thủy trong mô thực vật. - Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường chứa nhiều hạt tinh bột (năng lượng dự trữ của thực vật). - Tế bào có khả năng phân chia trong khoảng 24 – 72 giờ. - Tế bào bị mất tính toàn năng. - Tế bào bị tăng mức bội thể. Trong quá trình phát triển trong môi trường lỏng, các tế bào đơn của thực vật thường phát triển qua bốn giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy tàn. Trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng theo phương pháp chu kỳ, tế bào thực vật thường tạo ra một quần thể dị biệt. Phổ biến dị của tế bào thực vật lớn và rất dễ nhận thấy trong khi nuôi cấy. Do đó, việc kiểm soát quá trình nuôi cấy phải được thực hiện nghiêm ngặt. Trong phương pháp nuôi cấy từng mẻ sẽ xảy ra hệ thống phân chia đồng bộ, hệ thống này tạo ra những thế hệ tế bào có cùng tuổi sinh lý, phát triển, có cùng thời điểm trao đổi chất mạnh hoặc trao đổi chất yếu. Do đó trong quá trình nuôi cần chú ý thay đổi chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng và thay đổi điều kiện chiếu sang cho phù hợp với từng thời kỳ phát triển. Nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng là những tế bào mô sẹo hoặc những tế bào lai hữu tính. Trong quá trình nuôi cấy có thể xảy ra những thay đổi về mặt di truyền do tác động của các yếu tố bên ngoài. Chính vì thế, việc kiểm soát thường xuyên phải được thực hiện để loại những tính trạng xấu làm thoái hóa tế bào và giữ lại những tính trạng tốt để duy trì và làm tăng giá trị của tế bào. 2.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng 2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng rất lớn đến sinh lý tế bào trong quá trình nuôi cấy - Phần lớn các chất điều hòa sinh trưởng thực vật làm tăng quá trình phân bào. - Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đặc biệt làm tăng quá trình biệt hóa tế bào để tạo ra những cơ quan riêng biệt của cây như rễ, than, lá,… 37
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng đến việc tạo ra những - sản phẩm thứ cấp. 2.2.2. Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng - Nguồn đạm: nguồn đạm từ các muối nitrate thường được tế bào dễ hấp thu hơn cả. Đôi khi người ta sử dụng nguồn đạm từ hỗn hợp nitrate và ammonium. Cũng có nhiều trường hợp người ta sử dụng nguồn đạm hữu cơ. Nhưng về căn bản, các nguồn đạm từ muối vô cơ hòa tan thường thích hợp nhất cho nuôi cấy tế bào đơn. - Nguồn carbon: người ta thường sử dụng saccharose như nguồn carbon trong nuôi cấy tế bào đơn thực vật. Điều này cũng còn tùy thuộc vào từng loại cây mà ta thu nhận tế bào. Đối với nhiều loại thực vật, tế bào lại cần mannose, galactose hay glucose hơn. - Ánh sáng: tế bào thực vật là loại tế bào tự dưỡng. Trong quá trình phát triển, chúng cần ánh sáng cho quá trình quang hợp. Chu kỳ tối, sang có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần và số lượng các sản phẩm trao đổi chất bậc 2. Do đó, trong quá trình nuôi cấy, việc điều khiển cường độ ánh sang, thời gian chiếu sáng là điều đặc biệt quan trọng. - Các chất vi lượng và các chất khác: tùy theo loài thực vật mà nhu cầu về các nguyên tố vi lượng, vitamin và các chất khác sẽ khác nhau. Do đó, khi nuôi cấy phải chú ý đến nhu cầu sinh lý của chúng để tạo ra môi trường nuôi cấy thích hợp. 3. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn thu nhận sản phẩm thứ cấp Tế bào thực vật cũng tuân theo quy luật trao đổi chất giống như tất cả các tế bào sinh vật khác. Quy luật tạo ra sản phẩm tiết kiệm nhất và hợp lý nhất ở các tế bào, đặc biệt là ở tế bào thực vật. Vì thế, việc thu nhận sinh khối tế bào thực vật khi tiến hành nuôi cấy trong môi trường lỏng không có khó khăn gì. Nhưng mục tiêu ở đây là các sản phẩm bậc 2 do đó vấn đề sẽ rất phức tạp. Trong quá trình nghiên cứu, lúc đầu các nhà khoa học đưa ra 2 kết luận: - Nuôi cấy tế bào đơn không thích hợp cho việc thu nhận sản phẩm bậc 2. - Trong nuôi cấy tế bào đơn có xảy ra những quá trình chuyển hóa vật chất để tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau. Tuy nhiên, những quá trình chuyển hóa này thường cho năng suất thấp. Đây là hai khó khăn thường gặp nhất khi nuôi cấy tế bào đơn thực vật để thu nhận các sản phẩm bậc 2. Để giải quyết 2 khó khăn trên, các nhà khoa học đã đưa ra những hướng giải quyết sau: 38
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Không nên nuôi cấy tế bào đơn một cách đại trà mà không tính toán đến - khả năng tạo ra những sản phẩm đặc biệt của loài thực vật đó. Vấn đề đầu tiên là phải chọn ra được một loài thực vật nào đó có khả năng sinh tổng hợp ra những chất mà ta quan tâm. Đặc tính tổng hợp chất chuyên biệt này do một gene trong cấu trúc DNA quyết định và chúng có đặc tính loài rất cao. Việc chọn sai đối tượng sẽ đồng nghĩa với sự thất bại trong nuôi cấy về sau. - Thực vật là cơ thể đa bào, do đó không phải tất cả các cơ quan đều có khả năng tạo ra chất mà ta quan tâm. Ở đó, chỉ có những cơ quan đặc biệt mới tạo ra những chất đặc biệt. Do đó, việc xác định cơ quan nào có khả năng sinh tổng hợp chất mà ta quan tâm để tiến hành nuôi cấy là điều rất quan trọng. - Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến hành tuyển chọn, lai tạo và chuyển gene để nâng cao năng suất tạo ra các sản phẩm bậc 2 mà ta quan tâm. - Cũng như quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng ở vi sinh vật, quá trình tổng hợp hay chuyển hóa ở tế bào thực vật cũng rất cần đến những cơ chất tương ứng. Do đó, việc cung cấp những cơ chất tương ứng cho quá trình nuôi cấy là điều bắt buộc. - Cuối cùng là phải tìm cho được môi trường đặc hiệu riêng cho từng loại tế bào. 3.1. Kỹ thuật nuôi cấy Mẫu tế bào dùng để nuôi cấy phải được lấy từ cây đã biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp chất cần quan tâm; mẫu tế bào phải được lấy từ cơ quan hay bộ phận mà ở đó hàm lượng các chất yêu cầu có khả năng được tổng hợp hay chuyển hóa cao nhất; mẫu tế bào phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất. Khi chọn được mẫu thực vật để tiến hành nuôi cấy, người ta tiến hành các quá trình xử lý như trong vi nhân giống. Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, người ta cấy mô sẹo này vào môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn. Môi trường có thành phần khoáng MS, ngoài ra còn có bổ sung thêm nước dừa, auxin, dịch chiết nấm men, saccharose,… tùy theo loài thực vật và loại mô nuôi cấy. Đầu tiên, mô sẹo được nuôi cấy trong các bình tam giác và đặt trên máy lắc. Cứ 2 – 3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra bằng cách đếm dưới kính hiển vi sau đó xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào. 39
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Sau 1 – 2 tuần nuôi cấy (tùy theo loài thực vật), trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào. Trong huyền phù tế bào có 2 loại tế bào là tế bào có khả năng sinh phôi và tế bào không có khả năng sinh phôi. Theo kinh nghiệm nuôi cấy của các nhà khoa học cho thấy sinh khối thu được cao nhất ở ngày thứ 8. Ta chuyển toàn bộ sinh khối này sang quá trình nuôi cấy kế tiếp. Dung tích mỗi lần nuôi sau nhiều hơn lần nuôi trước khoảng 10 – 15 lần. Cứ như vậy, ta nhân giống cho đến khi đủ lượng giống cho sản xuất lớn. Tỉ lệ tiếp giống trong sản xuất lớn khoảng 1 – 5 %. Hiện nay người ta đã thiết kế những thiết bị nuôi cấy tế bào đơn với dung tích hàng chục m3. Trong thiết kế và chế tạo các bình nuôi cấy tế bào đơn thực vật, về cơ bản không khác những thiết bị lên men trong công nghệ vi sinh vật. Có hai điểm khác cần lưu ý là các thiết bị nuôi cấy tế bào đơn không có hệ thống cung cấp oxygen mà chỉ có cánh khuấy. Thứ hai, thiết bị nuôi cấy phải có hệ thống chiếu sáng đảm bảo cho quá trình tự dưỡng của tế bào xảy ra. Trong khi tiến hành nuôi cấy, người ta có thể tiến hành nuôi cấy theo chu kỳ (theo từng mẻ), cũng có thể nuôi cấy liên tục như trong kỹ thuật nuôi cấy và lên men vi sinh vật. Huyền phù tế bào sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy được đem đi ly tâm. Sản phẩm bậc 2 ở trong dung dịch ly tâm. Áp dụng những phương pháp hóa, lý tương ứng để tách các sản phẩm này ra khỏi dung dịch và đem tinh chế thì sẽ thu được sản phẩm bậc 2. Trong nhiều trường hợp không cần thiết phải qua giai đoạn tạo mô sẹo để nuôi cấy tế bào đơn mà trực tiếp sử dụng tế bào nguyên thủy của mẫu cấy để nuôi cấy tế bào đơn. Phương pháp này tiết kiệm được thời gian, công sức và chi phí rất nhiều. Trong một số trường hợp khác, người ta áp dụng phương pháp này để nuôi cấy tế bào trần và thu được những kết quả rất khả quan. Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn đang được ứng dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Pháp, Canada, Mỹ và Hà Lan. 3.2. Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào Trong quá trình nuôi cấy tế bào, người ta nhận thấy có một số sản phẩm được tích lũy trong tế bào với một lượng cao hơn ở trong cây khi điều kiện nuôi cấy hoàn toàn thích hợp. Ví dụ như ginsenoside từ Panax ginseng, acid rosmarinic từ Colleus blumei, shikonin từ Lithospermum erythrorhizon, diosgenin từ 40
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Dioscorea, ubiquinone-10 từ Nicotiana tabacum được tích lũy trong tế bào cao hơn rất nhiều so với cây nguyên vẹn. Tuy nhiên, cũng có những sản phẩm tích lũy trong tế bào với một lượng rất thấp hoặc đôi khi không thể nhận thấy trong những tế bào phản phân hóa như mô sẹo hay huyền phù tế bào. Để có thể thu được sản phẩm với một hàm lượng đủ cao để có thể sản xuất cho mục đích thương mại, người ta đã cố gắng kích thích hoặc khôi phục lại khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy bằng cách sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Sau đây là vài yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp của tế bào thực vật: 3.2.1. Điều kiện môi trường thích hợp Vai trò của một số chất hóa học và các yếu tố vật lý đã được kiểm tra trên nhiều loại tế bào khác nhau. Các yếu tố này bao gồm thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, độ lay chuyển, ánh sáng,… Đó là những yếu tố cơ bản nhất trong nuôi cấy tế bào. Mỗi loại tế bào sẽ chịu những mức độ ảnh hưởng khác nhau đối với các yếu tố nêu trên. Glucose và sucrose là nguồn carbon thích hợp cho các mô thực vật nuôi cấy. Trong một số trường hợp, nồng độ của nguồn carbon ảnh hưởng trên sự tăng trưởng của tế bào và sản lượng các hợp chất thứ cấp được sản xuất ra. Trong số những thành phần môi trường khác, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như auxin và kinetin có những ảnh hưởng đáng kể trên sự tăng trưởng của tế bào và khả năng sản xuất các chất biến dưỡng của tế bào. Nói chung, khi tăng hàm lượng auxin như 2,4-D trong môi trường sẽ kích thích sự phản phân hóa của tế bào và vì vậy sẽ làm giảm bớt sản lượng các chất biến dưỡng thứ cấp.Đó là lý do tại sao auxin thường được bổ sung vào môi trường để cảm ứng sự tạo mô sẹo, và nó sẽ được giữ lại với một hàm lượng rất thấp hoặc loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất các chất biến dưỡng. Nhiệt độ trong khoảng 17 – 25C thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo mô sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp với một nhiệt độ khác nhau. Độ pH môi trường được chỉnh trong khoảng 5 đến 6 trước khi hấp khử trùng. Trong quá trình nuôi cấy, có những trường hợp ánh sáng có tác dụng thúc đẩy sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Các bình nuôi cấy cũng cần có hệ thống sục khí để tăng lượng oxygen cung cấp cho tế bào trong quá trình nuôi cấy. 41
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Mỗi loài thực vật có những điều kiện tối thích cho sự tăng trưởng của tế bào và sự sản xuất ra các hợp chất thứ cấp, vì vậy cần phải xác định rõ điều kiện nuôi cấy thích hợp cho mỗi trường hợp. 3.2.2. Chọn lựa các chủng có khả năng sản xuất cao Các đặc tính sinh lý của mỗi tế bào riêng lẻ không luôn thống nhất với nhau. Ví dụ, các cụm tế bào sản xuất sắc tố thường bao gồm những tế bào có khả năng sản xuất và những tế bào không có khả năng sản xuất. Vào năm 1976, Zenk và cộng sự đã thu được những dòng tế bào Catharanthus roseus có thể tích lũy được một lượng lớn ajmalicine và serpentine. Sau đó, các nhà khoa học khác đã sử dụng phương pháp chọn dòng tế bào với mục đích làm tăng khả năng sản xuất ra các hợp chất cần thiết. Việc chọn dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng lượng sản phẩm thứ cấp và nên áp dụng phương pháp này rộng rãi. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ là tại sao trong cùng một hệ thống nuôi cấy lại có cả những tế bào có khả năng sản xuất cao và có cả những tế bào có khả năng sản xuất thấp. Điều này có thể là do thiếu một hoặc vài loại enzyme chuyên biệt cần cho phản ứng quan trọng nhất để sản xuất các hợp chất thứ cấp ở trong các tế bào không có khả năng sản xuất. 3.2.3. Biến đổi tiền chất và các biến đổi sinh học Việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp hoặc các hợp chất có liên quan đôi khi kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. Phương pháp này rất thuận lợi nếu như giá thành của các chất này không quá cao. Ví dụ, các amino acid được bổ sung vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất tropan alkaloid, indole alkaloid và ephedorin. Ngoài ra, amino acid cũng còn có những tác động kích thích khác. Thật sự, amino acid là tiền chất của một số loại alkaloid nhưng nhìn chung, các bước sinh tổng hợp alkaloid từ amino acid rất phức tạp. Vì vậy, các nhà khoa học nghi ngờ rằng không biết có phải các amino acid này có liên quan chặt chẽ với việc sản xuất các alkaloid hay không. Có lẽ chúng không chỉ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh tổng hợp alkaloid như là tiền chất mà chúng còn tham gia gián tiếp vào các con đường biến dưỡng khác trong tế bào. Thay vì bổ sung một hợp chất đặc biệt như một tiền chất vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, người ta còn có thể sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để biến đổi các cơ chất thích hợp thành sản phẩm mong muốn. Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong công nghệ lên men nhờ vào vi sinh vật và các enzyme của chúng. Các nhà khoa học tin rằng quá trình biến đổi sinh học bao gồm sự bổ 42
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn sung cơ chất vào môi trường nuôi cấy là phương pháp hữu hiệu nhất trong nuôi cấy mô thực vật vì lý do kinh tế. 3.2.4. Xử lý với các chất cảm ứng Khi vi sinh vật xâm nhiễm vào một thực vật nguyên vẹn thường cảm ứng sự tạo ra các hợp chất thứ cấp. Hiện nay, các hệ thống vi sinh vật được hiểu rõ nhất là nhóm nấm gây bệnh đã kính thích sự tạo ra các phân tử điều hòa được xác định như polymer glucan, glycoprotein và các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng trên sự biến dưỡng các hợp chất thứ cấp được nghiên cứu ở mức độ enzyme để xác định được cách tác động của chúng. Mặc dù cơ chế các chất cảm ứng làm tăng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp còn chưa được rõ ràng, nhưng tác động kích thích của chúng rất đáng kể nếu như một chất cảm ứng thích hợp được chọn lựa để kích thích sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất cảm ứng có nguồn gốc vi sinh vật có thể không kinh tế bởi vì những chất cảm ứng có nguồn gốc từ vi sinh vật được tạo ra trong quá trình lên men trong các bình phản ứng khác với loại bình phản ứng sử dụng để nuôi cấy tế bào thực vật. Giá thành của các chất tạo ra từ vi sinh vật không phải lúc nào cũng thấp. Vì vậy, nên sử dụng những hợp chất có giá thành thấp hơn cho mục đích này. 3.2.5. Phương pháp cố định tế bào Các tế bào thực vật bất định được xem như là một nghiên cứu quan trọng và là một sự phát triển trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật bởi vì chúng có những thuận lợi sau đây: - Sức sống của chúng kéo dài trong pha ổn định và trong giai đoạn sản xuất, có thể duy trì sinh khối qua một giai đoạn dài. - Đơn giản hóa quá trình xuôi dòng. - Thúc đẩy (giả định) sự phản phân hóa, nối liền với sự gia tăng các hoạt động biến dưỡng thứ cấp. - Mật độ tế bào cao cho phép giảm kích thước của bình phản ứng, vì vậy làm giảm giá thành và giảm khả năng bị nhiễm khuẩn. - Giảm nhạy cảm với sự tổn thương tế bào. - Trong vài trường hợp, có thể kích thích sự tiết ra các sản phẩm thứ cấp. - Các bình phản ứng có dòng môi trường di chuyển có thể được sử dụng để làm tăng tốc độ trôi. - Giảm độ nhớt của lưu chất đến mức tối thiểu vì trong huyền phù tế bào, độ nhớt gây ra sự pha trộn và thu khí. 43
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn Một hệ thống cố định có thể duy trì sự sống của tế bào qua một khoảng thời gian dài và phóng thích phần lớn sản phẩm ra môi trường ngoại bào ở dạng ổn định, có thể giúp giảm giá thành sản phẩm. Tuy nhiên, trong một hệ thống cố định cũng tồn tại một số vấn đề sau: - Sự cố định thường bị hạn chế khi khả năng sản xuất ra sản phẩm không kèm với sự tăng trưởng của tế bào. - Sinh khối khởi đầu của hệ thống nuôi cấy phải được tăng trưởng trong huyền phù tế bào. - Sản phẩm bắt buộc phải được tiết ra môi trường ngoại bào. - Có những trường hợp sản phẩm sẽ bị thoái biến sau khi được tiết ra khỏi tế bào. - Khi bổ sung gel vào môi trường thì sẽ ngăn cản sự khuếch tán mạnh của tế bào. Chính vì những lý do này mà những hệ thống nuôi cấy tế bào cố định có hiệu quả kinh tế chưa được phát triển trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, người ta cũng phát triển một vài phương pháp cố định tế bào khác nhau như bẫy, hấp thu,… Nói chung, khi tế bào được cố định bằng cách dùng gel hoặc hấp thu bề mặt thì sẽ làm tăng khả năng sản xuất và kéo dài sức sống của tế bào trong hệ thống nuôi cấy. 3.2.6. Sự tiết sản phẩm từ tế bào ra ngoài môi trường Nhiều sản phẩm thứ cấp của thực vật được tích lũy trong tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, có thể làm tăng khả năng sản xuất những chất này bằng cách kích thích cho chúng được tiết ra ngoài môi trường. Sự tích lũy các sản phẩm bên trong tế bào đôi khi lại ngăn cản chính sự sinh tổng hợp ra chúng do các cơ chế điều hòa. Để cho những hệ thống tế bào thực vật cố định có thể hoạt động, điều cần thiết là phải làm cho một lượng lớn sản phẩm tiết ra ngoài môi trường. Đối với tế bào C. roseus, có 2 cách cố định là bẫy với gel trong các hạt polysaccharide và trong các bản polyacrylamide đều có thể kích thích sự tiết alkaloid bởi những cơ chế không xác định. Những loài thực vật khác mặc dù được cố định bằng những phương pháp tương tự những sản phẩm vẫn không tiết được ra ngoài môi trường. Để làm tăng sự tiết sản phẩm ra môi trường, người ta cố gắng làm tăng tính thấm của màng tế bào những kết quả đạt được vẫn rất hạn chế. 3.2.7. Gây đột biến tế bào Các chủng vi sinh vật được gây đột biến gene thường được sử dụng trong công nghệ len men. Các dạng đột biến điều hòa và đột biến khuyết dưỡng được sử dụng rộng rãi để sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm như amino acid, nucleotide, 44
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn kháng sinh,… Tuy nhiên, trong nuôi cấy tế bào thực vật, việc gây đột biến còn hạn chế bởi vì tế bào có bộ nhiễm sắc thể nhị bội do đó cơ hội thu được đột biến đồng thời trên cặp nhiễm sắc thể tương đồng có xác suất rất thấp (