Chẩn đoán hội chứng Wiskott Aldrich bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hội chứng Wiskott-Aldrich (WAS) là một bệnh suy giảm miễn dịch liên kết nhiễm sắc thể giới tính X, đặc trưng bởi giảm tiểu cầu, bệnh chàm và nhiễm trùng tái phát. Bài viết trình bày việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen WAS trên bệnh nhân trẻ em Việt Nam nghi ngờ mắc hội chứng Wiskott Aldrich.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chẩn đoán hội chứng Wiskott Aldrich bằng kỹ thuật giải trình tự gen

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG WISKOTT ALDRICH BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Ngô Mạnh Tiến1, Nguyễn Thị Mai Hương1, Nguyễn Thị Phương Mai1, Ngô Diễm Ngọc1, Nguyễn Thị Vân Anh2, Nguyễn Ngọc Quỳnh Lê2, Lê Minh Hương2, Trần Minh Điển1,2 TÓM TẮT 27 SUMMARY Hội chứng Wiskott-Aldrich (WAS) là một DIAGNOSTIC WISKOTT ALDRICH bệnh suy giảm miễn dịch liên kết nhiễm sắc thể SYNDROME BY SANGER giới tính X, đặc trưng bởi giảm tiểu cầu, bệnh SEQUENCING chàm và nhiễm trùng tái phát. Mục tiêu: Áp The Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS) is an dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến X-linked immunodeficiency condition gen WAS trên bệnh nhân trẻ em Việt Nam nghi characterized by microthrombocytopenia, ngờ mắc hội chứng Wiskott Aldrich. Phương eczema and recurrent infections. Objective: pháp: Nghiên cứu tiến hành trên 5 bệnh nhân Aplication biotechnology for identification of nghi ngờ mắc WAS, phân tích đột biến gen WAS WAS mutations from blood in pediatric Vietnamese patients with WAS. Method: We từ máu ngoại vi. Toàn bộ vùng mã hóa protein have analyzed mutations in DNA extracted from của gen WAS được khuếch đại và giải trình tự blood of 5 patients with WAS. All the coding chuỗi DNA. Kết quả: Bệnh nhân có đột biến gen region of WAS were amplified and sequenced. WAS gồm 1 bệnh nhân có đột biến c.131C>T Results: We found BTK mutations in 4 patients (p.Gln33Ter), 2 bệnh nhân có đột biến c.71C>T including 1 patient with c.131C>T (p.Gln33Ter) (p.Arg13Ter), 1 bệnh nhân có đột biến mutation, 2 patients with c.71C>T (p.Arg13Ter) c.125G>A (p.Glu31Lys) và 1 bệnh nhân có đột mutation, 1 patient with c.125G>A (p.Glu31Lys) biến c.408G>A (p.Gly12Glu). Kết luận: Kỹ mutation, 1 patientt with c.408G>A thuật giải trình tự gen là một phương pháp hiệu (p.Gly125Glu) mutation. Conclusion: The gene quả, chính xác trong chẩn đoán bệnh WAS. sequencing technique is an accurate and effective Từ khóa: Hội chứng Wiskott Aldrich, WAS, method to diagnose the WAS disease. giảm tiểu cầu, bệnh chàm Keywords: Wiskott Aldrich syndrome, WAS, eczema, thrombocytopenia I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Hội chứng Wiskott-Aldrich (WAS) là một Nhi Trung Ương. bệnh suy giảm miễn dịch tiên phát (PID) 2 Khoa Miễn Dịch – Dị Ứng – Khớp, Bệnh viện được đặc trưng bởi giảm tiểu cầu, bệnh chàm Nhi Trung Ương. và nhiễm trùng tái phát. Bệnh nhân cũng có Chịu trách nhiệm chính: Ngô Mạnh Tiến Email: manhtien181@gmail.com nguy cơ mắc bệnh ác tính và bệnh tự miễn. Ngày nhận bài: 29.8.2020 Năm 1937, Bác sĩ Alfred Wiskott đã mô tả Ngày phản biện khoa học: 17.9.2020 một bệnh nhân có lâm sàng gồm giảm tiểu Ngày duyệt bài: 19.11.2020 cầu, bệnh chàm và nhiễm trùng tai tái phát 205
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN và chết do chảy máu đường ruột và nhiễm theo các tiêu chuẩn của Hiệp hội suy giảm trùng huyết. Năm 1954, Aldrich và cộng sự miễn dịch châu Âu [6] [7] như sau: tìm thấy sự di truyền liên kết nhiễm sắc thể Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: giới tính X và sau đó được gọi là Hội chứng - Giới tính: Nam. Wiskott-Aldrich [1]. Tỷ lệ mắc bệnh là - Chàm da. 1/100.000 trẻ sinh ra [2]. - Tiêu phân có chảy máu kéo dài. Gen WAS nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc - Xuất huyết da dạng chấm, ban xuất thể giới tính X (Xp11.22-23), chiều dài huyết cho đến chảy máu đường tiêu hóa. khoảng 9kb, gồm 12 exon chứa 502 acid - Nhiễm trùng do vi khuẩn, virus hoặc amin, mã hóa protein WAS [3]. Protein nhiễm trùng cơ hôi tái phát như: viêm tai, WAS có vai trò trong tế bào máu đầu dòng, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm trùng liên quan đến tái tổ hợp actin cytoskeleton và huyết… sự hình thành synape miễn dịch. Thiếu hụt - Xét nghiệm cận lâm sàng: Giảm số protein WAS gây ra khiếm khuyết hoạt hóa lượng tiểu cầu (
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 ethidium bromide và quan sát bằng máy soi (slicing) của gen WAS. Toàn bộ các kết quả gel UVP. Độ lớn của sản phẩm PCR được giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết quả đặc thể hiện ở hình 1. hiệu với các vùng gen WAS đã được khuếch - Tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng kit đại. tinh sạch QIAamp PCR purification kit (Qiagen- Đức). - Thực hiện phản ứng PCR mồi đơn: Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện Phản ứng PCR mồi đơn với BigDye V3.1 (ABI, Mỹ) theo chu trình nhiệt [950C, 30 giây; 550C, 01 phút; 720C, 02 phút] x 30 chu kỳ. Sản phẩm PCR mồi đơn được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch chuyên dụng BigDye X Terminator (ABI, Mỹ). - Giải trình tự gene WAS: Trình tự DNA được đọc bằng máy Genetic Analyser 3500 (ABI). Trình tự gene được phân tích bằng Hình 3.1 Sản phẩm khuếch đại gen WAS. phần mềm Chromas Pro. Giếng 1: Ladder 100bp plus; giếng 2: Exon - Trình tự gen chuẩn: NG_007877.1. 1 (755bp); giếng 3: Exon 3-7 (1648bp); giếng 4: Exon 8-11 (1544bp); giếng 5: III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Exon 12 (218bp). Giải trình tự gene WAS Phát hiện đột biến gen WAS trên bệnh Gen WAS nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc nhân WAS thể giới tính X (Xp11.22-23), chiếm chiều Các bệnh nhân đều là nam, có đặc điểm dài khoảng 9kb, gồm 12 exon chứa 502 acid lâm sàng phù hợp với kiểu thể cổ điển WAS. amin, mã hóa protein WAS. Kỹ thuật giải Tuổi khởi phát của bệnh nhân từ 1 đến 5 trình tự trên gen WAS tập trung vào các tháng tuổi, triệu chứng ban đầu là tiêu phân exon để phát hiện các đột biến thuộc vùng phân có chảy máu (100%, 5/5 bệnh nhân), mã hóa protein (exon) và vùng cắt nối exon- ngoài ra các bệnh nhân bị nhiễm trùng tái intron (splicing) của gen WAS. Chúng tôi đã phát như viêm tai giữa (80%, 4/5 bệnh nhân), khuếch đại thành công vùng mã hóa protein ban xuất huyết giảm tiểu cầu (80%, 4/5 bệnh (exon) và vùng cắt nối exon-intron (splicing) nhân), chàm khô (40%, 2/5 bệnh nhân), viêm bằng 4 phản ứng PCR, với sản phẩm tương phổi. Xét nghiệm cận lâm sàng của các bệnh ứng là Exon 1 (755bp); Exon 3-7 (1648bp); nhân cho thấy, Số lượng tiểu cầu giảm thấp Exon 8-11 (1544bp); Exon 12 (218bp), giúp (từ 15000 đến 52000) và kích thước tiểu cầu đơn giản quá trình phân tích đột biến gen nhỏ hoặc không xác định. Định lượng kháng (hình 3.1). Các sản phẩm PCR sau khi được thể trong máu ngoại vi cho thấy IgA, IgM, tinh sạch đã được tiến hành giải trình tự IgG ở mức bình thường trong khi đó IgE chuỗi DNA để xác định thay đổi trên vùng tăng cao (4/5 bệnh nhân) như Bảng 3.1 mã hóa protein và vùng cắt nối exon-intron 207
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN Bảng 3.1. Xét nghiệm cận lâm sàng bệnh nhân WAS Định lượng kháng thể Tiều cầu Bệnh Tuổi khởi Tuổi chẩn Kích nhân phát đoán IgA IgM IgG IgE Số lượng thước 1 2th 14 th 1,22 1,54 11,11 677,8 15000 Kxđ 2 3th 13 th 0,48 0,35 7,72 90,5 26000 Kxd 3 1 th 8 th 0,08 0,15 6,34 0,5 29000 7,8 4 2 th 9 th 3,21 0,68 10,86 433 47000 Kxd 5 5th 12 th 0,18 0,01 0,94 91,3 52000 7,8 Bảng 3.2. Kiểu gen các bệnh nhân WAS Đột biến Bệnh nhân Vùng đột biến Dạng đột biến c.ADN Protein 1 c.71C>T p.Arg13Ter Exon 1 Vô nghĩa 2 c.71C>T p.Arg13Ter Exon 1 Vô nghĩa 3 c.125G>A p.Glu31Lys Exon 1 Sai nghĩa 4 c.131C>T p.Gln33Ter Exon 1 Vô nghĩa 5 c.408G>A p.Gly125Glu Exon 4 Sai nghĩa Kỹ thuật giải trình tự gen phát hiện các rối loạn gen WAS liên quan đến hội chứng WAS. Nghiên cứu này phát hiện 5 đột biến của gen WAS (bảng 3.2). Trong đó, 2 bệnh nhân có đột biến điểm làm thay thế axit amin là p.Glu31Lys và p.Gly125Glu, 3 bệnh nhân có đột biến điểm tạo mã kết thúc sớm trên exon 1 là p.Arg13Ter và p.Gln33Ter (hình 3.2). Hình 3.2. Ảnh đột biến phát hiện trên gen WAS Đột biến trên gen WAS có thể gây rối hội chứng Wiskott Aldrich chia làm 3 thể loạn chức năng hoặc ức chế hẳn protein bệnh chính: 1. Thể cổ điển “classic WAS”; WAS. Tùy theo dạng đột biến gen WAS mà 2. Thể liên kết với NST X và giảm tiểu cầu 208
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 “X-linked thrombocytopenia” (XLT); 3. Thể IV. KẾT LUẬN liên kết với NST X và giảm bạch cầu hạt “X- Nghiên cứu phát hiện phát hiện được 5 linked neutropenia” (XLN) [9] [10] [11]. bệnh nhân đều có đột biến trên gen WAS Gần 50% bệnh nhân WAS ở thể cổ điển trong đó 1 bệnh nhân có đột biến “Classic WAS” xảy ra khi chức năng protein p.Glu31Lys; 1 bệnh nhân có đột biến WAS mất đi hoàn toàn, phân nửa còn lại p.Gly125Glu; 1 bệnh nhân có đột biến bệnh nhân ở thể XLT gây ra bởi một đột biến p.Gln33Ter; 2 bệnh nhân có đột biến sai nghĩa dẫn đến biểu hiện protein WAS p.Arg13Ter. không đủ hoặc không đầy đủ. Thể XLN xảy Hội chứng Wiskott Aldrich biểu hiện rất ra khi có đột biến missense xuất hiện tại vị sớm sau sinh và có tiên lượng tử vong rất cao trí Cdc42‐ binding. Nhưng nghiên cứu không nên kỹ thuật giải trình tự gen phát hiện các tiên lượng bệnh nhân được dựa trên phân đột biến gen WAS giúp chẩn đoán sớm và tích biểu hiện protein WAS. chính xác tránh bệnh nhân phải điều trị kéo Cho đến nay, hơn 426 đột biến đã được dài. Đây cũng là cơ sở giúp tầm soát bệnh tìm thấy, trải dài tất cả 12 exon, với các dạng trong các gia đình đã có người mắc hội đột biến sai nghĩa, vô nghĩa, ghép nối, chèn, chứng WAS và chẩn đoán trước sinh cho xóa và thay thế axit amin (Ngân hàng dữ liệu những lần sinh tiếp theo. đột biến gen người, cập nhật 8/2020). Trong TÀI LIỆU THAM KHẢO các đột biến đã được công bố, đột biến điểm 1. Albert M.H., Bittner T.C., Nonoyama S. et là dạng chiếm nhiều nhất và tập trung từ al (2010). X-linked thrombocytopenia (XLT) exon 1 đến 4. Trong nghiên cứu này, 2 bệnh due to WAS mutations: Clinical nhân có đột biến điểm làm thay đổi axit amin characteristics, long-term outcome, and là p.Glu31Lys (Exon 1) và p.Gly125Glu treatment options. Blood, 115(16), 3231- (Exon 4) đã được công bố bởi tác giả Kolurri 3238. 2. Ochs H.D., Filipovich A.H., Veys P. et al (1995) và Wu (2015) [12] [13]. Thường các (2009). Wiskott-Aldrich Syndrome: đột biến thay đổi axit amin xảy ra tại 4 exon Diagnosis, Clinical and Laboratory đầu gen WAS thuộc thể liên kết với NST X Manifestations, and Treatment. Biol Blood và giảm tiểu cầu (XLT) có biểu hiện lâm Marrow Transplant, 15(1), 84-90. sàng nhẹ hơn do chức năng protein WAS vẫn 3. Derry J.M.J., Ochs H.D. and Francke U. còn nhưng không đủ phù hợp với lâm sàng (1994). Isolation of a novel gene mutated in của bệnh nhân. Ngoài ra, 3 bệnh nhân có đột Wiskott-Aldrich syndrome. Cell, 78(4), 635- biến điểm tạo mã kết thúc sớm trên exon 1 là 644. 4. Lutskiy M.I., Rosen F.S. and Remold- p.Arg13Ter và p.Gln33Ter, có lâm sàng phù O’Donnell E. (2005). Genotype-Proteotype hợp với thể cổ điển WAS, có biểu hiện lâm Linkage in the Wiskott-Aldrich Syndrome. J sàng nặng và dễ tử vong nếu không được Immunol, 175(2), 1329-1336. phát hiện và điều trị sớm [14]. 5. Catucci M., Castiello M.C., Pala F. et al (2012). Autoimmunity in Wiskott-Aldrich 209
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN Syndrome: An Unsolved Enigma. Front transplantation: an analysis of 57 patients in Immunol, 3. Japan. Br J Haematol, 135(3), 362-366. 6. Thrasher A.J. and Kinnon C. (2000). The 11. Lee P.P.W., Chen T.-X., Jiang L.-P. et al Wiskott-Aldrich syndrome. Clin Exp (2009). Clinical and Molecular Characteristics Immunol, 120(1), 2-9. of 35 Chinese Children with Wiskott-Aldrich 7. Buchbinder D., Nugent D. and Fillipovich Syndrome. J Clin Immunol, 29(4), 490-500. A. (2014). wiskott-Aldrich syndrome: 12. Kolluri R., Shehabeldin A., Peacocke M. et diagnosis, current management, and emerging al (1995). Identification of WASP mutations treatments. Appl Clin Genet, 7, 55. in patients with Wiskott-Aldrich syndrome 8. Chan K.-W., Lee T.-L., Chung B.H.-Y. et and isolated thrombocytopenia reveals allelic al (2002). Identification of five novel WASP heterogeneity at the WAS locus. Hum Mol mutations in Chinese families with Wiskott- Genet, 4(7), 1119-1126. Aldrich syndrome. Hum Mutat, 20(2), 151- 13. Wu J., Liu D., Tu W. et al (2015). T-cell 152. receptor diversity is selectively skewed in T- 9. Zhu Q., Watanabe C., Liu T. et al (1997). cell populations of patients with Wiskott- Wiskott-Aldrich syndrome/X-linked Aldrich syndrome. J Allergy Clin Immunol, thrombocytopenia: WASP gene mutations, 135(1), 209-216. protein expression, and phenotype. Blood, 14. Zhu Q., Zhang M., Blaese R. et al (1995). 90(7), 2680-2689. The Wiskott-Aldrich syndrome and X-linked 10. Kobayashi R., Ariga T., Nonoyama S. et al congenital thrombocytopenia are caused by (2006). Outcome in patients with Wiskott- mutations of the same gene. Blood, 86(10), Aldrich syndrome following stem cell 3797-3804. 210