Chương VI: CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA

Chia sẻ: Nguyễn Đăng Khoa | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:60

Thêm vào BST

Báo xấu

136
lượt xem 28
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sự phát triển và phân lập DNA polimerase có tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt là Taq cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi, lặp lại nhiều lần Số lượng khyếch đại tăng theo hàm số mũ Một polimerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chương VI: CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA

CHƯƠNG VI CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA
Các khái niệm cơ bản Việc phát minh ra máy chu kỳ nhiệt (thermocycler) và sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu đựng một phổ khá rộng về nhiệt độ như Taq đã giúp cho Kary Mullis đoạt giải Nobel 1993. PCR (polymerase chain reaction) phản ứng chuổi polymerase bao gồm: 1- Biến dây đôi thành dây đơn 2- Phản ứng của primer gắn vào dây chuổi mã trên dây template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới. 3- Kéo dài dây mới nhờ primer (extension)
Các khái niệm cơ bản Sự phát triển và phân lập DNA polimerase có tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt là Taq cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi, lặp lại nhiều lần Số lượng khyếch đại tăng theo hàm số mũ Một polimerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA
Taq (Thermus aquaticus) • Taq là vi khuẩn có tính chịu nhiệt • Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. • Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn
Deoxynucleotide triphosphate • Hàm lượng deoxynucleotide trong khoảng 20 đến 200mM cho kết quả ổn định, trung thực, và chuyên tính. • Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó.
Magnesium chloride Nồng độ Mg2+ có thể ảnh hưởng đến : • Quá trình anneling của primer. • Nhiệt độ để tháo dây thành dây đơn. • Sự chuyên tính của sản phẩm PCR. • Hoạt động của enzym và sự trung thực của kết quả. PCR sẽ cần một hàm lượng Mg từ 0,5 đến 2,5mM ứng với hàm lượng tổng số dNTP đã cho.
Cặp mồi primer RAPD: Chiều dài ngắn 10-16 mer Ti thể, microsatellite dài 20-24 mer Nồng độ cao không những không cần thiết mà tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn đến sự hình thành hiện tượng primer dimers, và hiện tượng priming nhằm
Nhiệt độ annealing Td = 4 (G + C) + 2 (A + T) đối với primer có khoảng 20 oligonucleotide Số base càng ít, nhiệt độ càng thấp, và ngược lại
Phản ứng dung dịch đệm Tính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR Nồng độ của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây đẻ cho dây đơn) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít đi.
Phản ứng dung dịch đệm Lượng dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng anneling giả xảy ra thêm ổn định hơn, tại những vị trí không đúng của dây đơn, cho ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn, nhưng mức độ chuyên tính rất thấp. nồng độ Mg2+ quá thấp (
DNA template Khi khuyếch đại vùng mục tiêu từ dây đơn DNA, số lượng của template được tính toán trên cơ sở mol. Phép tính này giúp chúng ta xác định số lượng DNA cần phải có, số chu kỳ để tổng hợp ra DNA với số lượng mong muốn.
Tỉ lệ giữa primer : template • Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer- dimers sẽ xuất hiện, giống như trường hợp mẫu DNA quá loãng. nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR không nhiều. • Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer để tránh hiện tượng primer-dimers.
Thiết kế primer • Nhiệt độ khác nhau giữa cặp mồi xuôi và ngược không quá 3oC. • Tỉ lệ GC trên 50%. • Chiều dài của mỗi primer là 18 bp và 24 bp. • Cặp mồi không tận cùng GC. • Dựa vào chương trình phần mêm để thiết kế.
Ứng dụng các CNSH trong Thủy sản. Ph¬ng ph¸p Rando m Amplifie d Po lymo rphis m DNA RAPD: DNA ®a h×nh khuyÕc h ®¹i ng Éu nhiªn P h¬ng ph¸p Re s tric tio n Frag me nt Le ng th Po lymo rphis m RFLP: §a h×nh c hiÒu dµi ph©n ®o ¹n c ¾t h¹n c hÕ Ph¬ng ph¸p mic ro s ate llite : §a h×nh vÒ s è ph©n ®o ¹n n uc le o tide ng ¾n (26) lÆp l¹i ë mé t lo c us mic ro s ate llite Ph¬ng ph¸p Amplifie d Frag me nt Le ng th Po lymo rphis m AFLP: §a h×nh c hiÒu dµi ph©n ®o ¹n khuyÕc h ®¹i Ph¬ng ph¸p S ing le Nuc le o tide Po lymo rphis m S NP: §a h ×nh nuc le o tide ®¬n
Microsatellite § a h×nh vÒ s è ph©n ®o ¹n nuc le o tide ng ¾n (26) lÆp l¹i ë mé t lo c us Phương pháp kinh điển - Ly trích DNA - Cắt với enzyme hạn chế - Nối kết và chuyển đổi - Nuôi cấy khuẩn lạc - Hybridise - Phân lập plasmid - Chạy trình tự - Thiết kế primer
ISOLATION, CHARACTERISATION, AND AMPLIFICATION OF MICROSATELLITE MARKERS: PROTOCOL BREAKDOWN STRUCTURE DOT-BLOT: microsatellite presence/density (Facultative) •Extract DNA Cloning vector •Cut DNA with SAU 3A (cut with BAM HI) •Size-select fragments (400-900 pb) low insert size poor Ligate ligation efficiency Transform non-optimal competent colony density cells Test-Spread: Transformed cell density Average insert size (PCR) •Spread ligation mix on Petri dishes •Replate two series of colonies on grid Petri dishes
Serie 2 Serie 1 too few positive Lift colonies onto Nylon membrane Store at 4°C clones Test-membrane: Hybridise and estimate positive clone density Label oligonucleotide probes with Entire membrane set: digoxigenine •Hybridisation •Locate and ID positive clones •Mark colour intensity •Estimate insert sizes of positive clones (PCR) •Store clone collection at -80°C Select positive clones with appropriate colour intensity and insert size •Tests: non-radioactive PCR •Isolate plasmid (Miniprep) + •Tests: radioactive PCR •Sequence inserts •Estimate level of variability •Select PCR primers Use microsatellite markers routinely
Các phương pháp khác Randomly amplified microsatellites (RAM) • Sử dụng 5’anchor primer với trình tự CT, GA, ATG, TG, GATA • PCR • Cloning với TA cloning kit (Invitrogen, USA). • Cấy khuẩn lac • Ly trích plasmid • Chay trình tự • Thiết kế primer
Các phương pháp khác Random hybridizing microsatellites (RAHM) • RAPD PCR • Hybridise • Cloning với TA cloning kit (Invitrogen, USA). • Cấy khuẩn lạc • Ly trích plasmid • Chạy trình tự • Thiết kế primer