Đa hình nucleotide đoạn điều khiển của matrix metalloproteinase 9 (MMP 9) ở một số bệnh nhân ung thư vòm mũi họng

Nguyễn Thị Ngọc Hà<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 123(09): 133 - 140<br /> <br /> ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐOẠN ĐIỀU KHIỂN<br /> CỦA MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9)<br /> Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG<br /> Nguyễn Thị Ngọc Hà*<br /> Trường Đại học Y Dược – ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục đích: Metalloproteinase – 9 (MMP-9) là enzym tiêu protein, đóng vai trò quan trọng trong<br /> xâm lấn và di căn ung thư bởi khả năng phân hủy chất ngoại bào và màng cơ bản. Theo các nghiên<br /> cứu gần đây, đa hình đơn nucleotide (-1562C/T) trong promoter MMP-9 được tìm thấy có ảnh<br /> hưởng đến biểu hiện của MMP-9 và liên quan đến ung thư. Mục đích của nghiên cứu này là tiến<br /> hành phân tích đa hình nucleotid trong promoter của gen MMP-9 ở một số bệnh nhân ung thư vòm<br /> mũi họng (UTVMH) để tìm mối liên quan của chúng với di căn UTVMH. Phương pháp: DNA<br /> tổng số được tách chiết từ các mẫu máu của 6 bệnh nhân UTVMH và 3 mẫu máu người khoẻ<br /> mạnh. Sử dụng cặp mồi MMP-9F và MMP-9R để nhân đoạn promoter MMP-9 có kích thước 442<br /> bp. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và đọc trình tự cả 2 chiều. Kết quả: 2/6 bệnh nhân xuất<br /> hiện điểm đa hình 1562C/T và đều ở giai đoạn muộn của bệnh, ngoài ra còn xuất hiện 2/6 bệnh<br /> nhân có đa hình -1739G/A. Kết luận: Có thể có mối liên quan giữa đa hình đơn nucleotid (1562C/T) trong promoter MMP-9 với di căn ung thư vòm mũi họng người Việt Nam.<br /> Từ khoá: MMP-9 promoter, ung thư vòm mũi họng.<br /> <br /> MỞ ĐẦU*<br /> Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là một<br /> bệnh phổ biến trong các bệnh ung thư ở nước<br /> ta và thường gặp nhất trong các ung thư vùng<br /> đầu mặt, nó có đặc điểm xâm lấn và di căn<br /> cao hơn các ung thư vùng đầu mặt cổ khác.<br /> Để xâm lấn và di căn được, các tế bào ung thư<br /> phải trải qua nhiều bước liên tiếp, trong đó sự<br /> phá vỡ chất nền ngoại bào và màng cơ bản là<br /> bước quyết định cho các tế bào ung thư rời<br /> khỏi tổn thương nguyên phát, xâm lấn các tổ<br /> chức lân cận và đi tới tổ chức xa hơn [1], [2],<br /> [4]. Gần đây, nhiều tài liệu đã đề cập đến vai<br /> trò các matrix metalloprotein (MMPs)- một<br /> họ các enzyme tiêu protein, đóng vai trò quan<br /> trọng trong việc phân hủy chất nền ngoại bào<br /> và màng cơ bản. Trong đó, MMP-9 được xem<br /> như enzyme chủ chốt cho quá trình này, bởi<br /> chúng có khả năng phân hủy mạnh collagen<br /> type IV, một trong những thành phần quan<br /> trọng của chất nền ngoại bào và màng đáy [2],<br /> [4], [6]. Theo một số nghiên cứu mới đây cho<br /> thấy, đa hình đơn nucleotide (-1562C/T) trong<br /> promoter MMP-9 đã làm mất vị trí gắn của<br /> *<br /> <br /> Tel: 0983 026775, Email: hanguyenngoc75@gmail.com<br /> <br /> một protein kìm hãm sự sao mã, kết quả là<br /> làm tăng hoạt động của promoter mang allele<br /> T và liên quan đến xâm lấn, di căn ung thư.<br /> Năm 2011, khi nghiên cứu đoạn promoter<br /> MMP-9 ở một số bệnh nhân UTVMH, chúng<br /> tôi nhận thấy có 3 bệnh nhân xuất hiện đa<br /> hình nucleotid (-1562C/T) trong promoter<br /> MMP-9 đều ở giai đoạn muộn của bệnh [2].<br /> Điều này gợi ý, có thể có mối liên quan giữa<br /> đa hình này với di căn UTVMH. Trong đề tài<br /> này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu về đa hình<br /> đơn nucleotide (-1562C/T) trong promoter<br /> MMP-9 ở một số bệnh nhân UTVMH nhằm<br /> góp phần tìm ra mối liên quan với di căn ung<br /> thư trên người Việt Nam.<br /> Mục tiêu:<br /> - Xác định đa hình nucleotid đoạn điều khiển<br /> gen MMP-9 trên một số bệnh nhân ung thư<br /> vòm mũi họng.<br /> - Nhận xét tính đa hình nucleotid đoạn điều<br /> khiển gen MMP-9 với di căn ung thư vòm<br /> mũi họng.<br /> ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> - Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân<br /> UTVMH thể ung thư biểu mô không biệt<br /> 133<br /> <br /> Nguyễn Thị Ngọc Hà<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> hóa (UCNT), được điều trị tại Khoa U bướu<br /> bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái<br /> Nguyên năm 2013.<br /> - Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu:<br /> + Tiêu chuẩn lâm sàng: Bệnh nhân UTVMH<br /> được xác chẩn bởi kết quả giải phẫu bệnh của<br /> Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên,<br /> được xếp loại TNM và giai đoạn lâm sàng của<br /> liên ban phân loại ung thư Hoa Kỳ (AJCC).<br /> Gồm có 6 bệnh nhân. Tất cả các bệnh nhân<br /> được điều trị tại khoa U bướu, có hồ sơ lưu<br /> trữ đầy đủ.<br /> + Tiêu chuẩn xét nghiệm: Thể ung thư biểu<br /> mô không biệt hóa<br /> - Tiêu chuẩn chọn mẫu đối chứng: Người<br /> khỏe mạnh tuổi từ 20 đến 50 tuổi<br /> - Bệnh phẩm nghiên cứu: Mẫu máu ngoại vi<br /> có chống đông được thu thập trên 06 bệnh<br /> nhân và 03 người chứng<br /> <br /> 123(09): 133 - 140<br /> <br /> Đoạn promoter MMP-9 được nhân lên bằng<br /> kỹ thuật PCR. Hỗn hợp phản ứng bao gồm<br /> 100ng DNA tổng số, 10 pM mỗi loại mồi,<br /> 0,625 đơn vị Taq DNA polymerase, 1 đệm<br /> PCR và 250 M dNTP mỗi loại. PCR được<br /> tiến hành trên máy luân nhiệt với chu trình<br /> nhiệt như sau: 95ºC trong 5 phút, 95ºC trong<br /> 30 giây, 57ºC trong 30 giây, 72ºC trong 45<br /> giây, lặp lại 35 lần từ bước 2, 72ºC trong 19<br /> phút, giữ ở 4ºC. Sản phẩm PCR được giữ ở <br /> 20ºC đến khi sử dụng.<br /> Sản phẩm sau khi khuếch đại được tinh sạch<br /> sử dụng bộ kit “EZNA® Cycle Pure kit” của<br /> hãng Omega. Phản ứng xác định trình tự được<br /> thực hiện trên máy ABI PRISM® 3100<br /> Genetic Analyzer.<br /> + Hồi cứu hồ sơ bệnh án: Tình trạng di căn<br /> hạch, giai đoạn bệnh.<br /> <br /> + Giai đoạn bệnh ( Giai đoạn I, II, II, IV)<br /> <br /> - Phương pháp xử lý số liệu: Các thông số<br /> trình tự nucleotide và chất lượng đỉnh được<br /> thu thập, kiểm định bằng các phần mềm ABI<br /> Data Collection v2.0 và Sequencing Analysis<br /> Software v5.3. Trình tự đoạn promoter<br /> MMP-9 của các mẫu bệnh UTVMH và mẫu<br /> người bình thường người Việt Nam được so<br /> sánh với một số trình tự công bố trên các<br /> Ngân hàng trình tự gen Quốc tế<br /> EMBL(EBI)/ Genbank/DDBJ với mã số<br /> AF538844 (hình 3), thông qua sử dụng các<br /> phần mềm phân tích như SeqScape®<br /> Software v2.6, BioEdit v7.0.9.<br /> <br /> - Kỹ thuật thu thập số liệu:<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> <br /> DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu máu<br /> đã được thu thập, sử dụng bộ kit “EZNA®<br /> Blood DNA Mini kit” của hãng Omega<br /> <br /> Nhân gen MMP-9<br /> thuật PCR<br /> <br /> - Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Đa khoa<br /> Trung ương Thái Nguyên, Viên Công nghệ<br /> sinh học<br /> - Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô<br /> tả cắt ngang, kết hợp hồi cứu lâm sàng.<br /> - Chỉ tiêu nghiên cứu:<br /> + Tính đa hình/đột biến trên promoter của gen<br /> MMP-9<br /> +Tình trạng di căn hạch (N0, N1, N2, N3)<br /> <br /> Cặp mồi sử dụng để nhân đoạn điều khiển<br /> gen MMP-9 kích thước 442 bp, ký hiệu<br /> MMP-9F và MMP-9R, được đặt tổng hợp tại<br /> hãng IDT có trình tự như sau:<br /> MMP-9F 5'– GGC ACA TAG TAG GCC<br /> CTT TAA -3'<br /> MMP-9R 5'– TCA CTC CTT TCT TCC TAG<br /> CCA -3'<br /> 134<br /> <br /> promoter bằng kỹ<br /> <br /> DNA tổng số đã được tách chiết, tinh sạch và<br /> kiểm tra nồng độ bằng quang phổ được dùng<br /> làm khuôn để nhân đoạn promoter MMP-9.<br /> Để phân tích mức độ đa hình trong đoạn<br /> promoter của gen MMP-9 ở một số bệnh nhân<br /> UTVMH người Việt Nam, chúng tôi sử dụng<br /> cặp mồi MMP-9F và MMP-9R để nhân đoạn<br /> promoter dài 442bp có chứa vị trí (1562CT) (Price et al., 2001).<br /> <br /> Nguyễn Thị Ngọc Hà<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR<br /> <br /> 123(09): 133 - 140<br /> <br /> Hình 2: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR<br /> <br /> (M: Thang DNA chuẩn 1 Kb; 1-6: sản phẩm PCR của mẫu bệnh (đoạn promoter gen MMP-9); 7-9: sản<br /> phẩm của mẫu đối chứng)<br /> <br /> Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 1) cho thấy: Khi sử dụng cặp mồi MMP-9F và MMP-9R<br /> đều cho sản phẩm PCR đặc hiệu, rõ nét ở các mẫu nghiên cứu với kích thước khoảng 442bp,<br /> hoàn toàn phù hợp với kích thước đoạn promoter MMP-9 theo tính toán lý thuyết. Như vậy sản<br /> phẩm PCR được khuếch đại với số lượng đủ lớn để dùng cho các bước thí nghiệm tiếp theo.<br /> Tinh sạch sản phẩm PCR: Để chuẩn bị cho việc xác định trình tự đoạn promoter gen MMP-9,<br /> chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sử dụng bộ kit “EZNA® Cycle Pure kit” của hãng Omega. Từ<br /> điện di đồ (Hình 1) có thể thấy các kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết.<br /> Như vậy, sản phẩm PCR đã được tinh sạch đủ lượng sử dụng cho việc xác định trình tự.<br /> Xác định trình tự và phân tích tính đa hình trên promoter của gen MMP-9<br /> Trình tự nucleotide đoạn promoter gen MMP-9 được xác định theo cả hai chiều. Sau khi xử lý số<br /> liệu bằng các phần mềm chuyên dụng, chúng tôi thu được trình tự đoạn promoter của gen MMP-9<br /> có chiều dài 442 bp. (Hình 3). Kết quả cho thấy: có 2/6 mẫu bệnh nhân xuất hiện đa hình 1739G→A đó là mẫu NVC và LTL và 2/6 mẫu bệnh nhân xuất hiện đa hình -1562C→Y, ký<br /> hiệu “Y”, ký hiệu biểu thị dạng không phân biệt giữa nucleotide C và nucleotide T (dạng dị hợp<br /> tử) của hai mẫu TVT và DTT. Các mẫu chứng không thấy xuất hiện đột biến. Chi tiết như mô tả<br /> hình 2,3.<br /> -1742<br /> <br /> -1732<br /> <br /> -1722<br /> <br /> -1712<br /> <br /> -1702<br /> <br /> -1692<br /> <br /> |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....<br /> MMP9-REF<br /> ACATAGTAGGCCCTTTAAATACAGCTTATTGGGCCGGGCGCCATGGCTCATGCCCGTAAT<br /> NVC<br /> ........A...................................................<br /> LTL<br /> ........A...................................................<br /> DTT<br /> ............................................................<br /> TVM<br /> ............................................................<br /> TTH<br /> ............................................................<br /> TVT<br /> ............................................................<br /> BT1<br /> ............................................................<br /> <br /> 135<br /> <br /> Nguyễn Thị Ngọc Hà<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 123(09): 133 - 140<br /> <br /> BT2<br /> ............................................................<br /> BT3<br /> ............................................................<br /> -1682<br /> -1672<br /> -1662<br /> -1652<br /> -1642<br /> -1632<br /> |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....<br /> MMP9-REF<br /> CCTAGCACTTTGGGAGGCCAGGTGGGCAGATCACTTGAGTCAGAAGTTCGAAACCAGCCT<br /> NVC<br /> ............................................................<br /> LTL<br /> ............................................................<br /> DTT<br /> ............................................................<br /> TVM<br /> ............................................................<br /> TTH<br /> ............................................................<br /> TVT<br /> ............................................................<br /> BT1<br /> ............................................................<br /> BT2<br /> ............................................................<br /> BT3<br /> ............................................................<br /> -1622<br /> -1612<br /> -1602<br /> -1592<br /> -1582<br /> -1572<br /> |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....<br /> MMP9-REF<br /> GGTCAACGTAGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAAATTTAGCCAGGCGTGGTG<br /> NVC<br /> ............................................................<br /> LTL<br /> ............................................................<br /> DTT<br /> ............................................................<br /> TVM<br /> ............................................................<br /> TTH<br /> ............................................................<br /> TVT<br /> ............................................................<br /> BT1<br /> ............................................................<br /> BT2<br /> ............................................................<br /> BT3<br /> ............................................................<br /> -1562<br /> -1552<br /> -1542<br /> -1532<br /> -1522<br /> -1512<br /> |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....<br /> MMP9-REF<br /> GCGCACGCCTATAATACCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCGG<br /> NVC<br /> <br /> 136<br /> <br /> Nguyễn Thị Ngọc Hà<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 123(09): 133 - 140<br /> <br /> ............................................................<br /> LTL<br /> ............................................................<br /> DTT<br /> .....Y......................................................<br /> TVM<br /> ............................................................<br /> TTH<br /> ............................................................<br /> TVT<br /> .....Y......................................................<br /> BT1<br /> ............................................................<br /> BT2<br /> ............................................................<br /> BT3<br /> ............................................................<br /> -1502<br /> -1492<br /> -1482<br /> -1472<br /> -1462<br /> -1452<br /> |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....<br /> MMP9-REF<br /> GAGGCAGATGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGAGT<br /> NVC<br /> ............................................................<br /> LTL<br /> ............................................................<br /> DTT<br /> ............................................................<br /> TVM<br /> ............................................................<br /> TTH<br /> ............................................................<br /> TVT<br /> ............................................................<br /> BT1<br /> ............................................................<br /> BT2<br /> ............................................................<br /> BT3<br /> ............................................................<br /> -1382<br /> -1372<br /> -1362<br /> -1352<br /> -1342<br /> -1332<br /> |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....<br /> MMP9-REF<br /> AGGTTTTTCCCAAATAGGGCTTTGAAGAAGGTGAATATAGACCCTGCCCGATGCCGGCTG<br /> NVC<br /> ............................................................<br /> LTL<br /> ............................................................<br /> DTT<br /> ............................................................<br /> TVM<br /> ............................................................<br /> TTH<br /> ............................................................<br /> TVT<br /> <br /> 137<br /> <br />