Vì Thị Xuân Thủy và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
119(05): 101 - 106<br />
<br />
ĐẶC ĐIỂM TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE<br />
CYSTATIN II PHÂN LẬP<br />
TỪ mRNA CỦA HAI MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG SƠN LA VÀ HÀ GIANG<br />
Vì Thị Xuân Thủy1*, Đặng Thị Hoa2,<br />
Nguyễn Vũ Thanh Thanh2, Chu Hoàng Mậu3<br />
1<br />
<br />
Trường Đại học Tây Bắc, 2Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên,<br />
3<br />
Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Cysteine proteinase thực hiện chức năng trƣởng thành protein, làm mới protein để phù hợp với<br />
những thay đổi của môi trƣờng và loại bỏ protein bất thƣờng. Cystatin là một dạng protein ức chế<br />
hoạt động của cysteine proteinase, nó đóng vai trò nhƣ cơ chất để xâm nhập vào trung tâm hoạt<br />
động của cysteine proteinase vì thế ngăn cản việc đi vào của cơ chất protein khác. Do đó, cystatin<br />
có mối liên quan đến khả năng chống vi sinh vật, chống côn trùng, trong đó có mọt gây hại của<br />
thực vật. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, tách dòng và xác định trình<br />
tự nucleotide của gen cystatin II từ mRNA của hai mẫu ngô địa phƣơng Sơn La (SL) và Hà Giang<br />
(HG). Gen cystatin II phân lập đƣợc có kích thƣớc 405 bp, mã hoá 134 amino acid. Có 9 vị trí<br />
38130,<br />
nhƣng không có sự sai khác ở điểm gắn kết của vùng chức năng CY. Gen cystatin II đã phân lập đƣợc<br />
sử dụng để thiết kế vector chuyển gen nhằm cải thiện khả năng kháng mọt của cây ngô.<br />
Từ khóa: Cystatin, cysteine proteinase, gen cystatin II, mọt ngô, Zea mays<br />
<br />
MỞ ĐẦU*<br />
.<br />
<br />
Ở Việt Nam, ngô (Zea mays L.) là cây lƣơng<br />
thực quan trọng thứ hai sau<br />
cysteine proteinase<br />
.<br />
[0<br />
, ngô lai rất dễ bị mọt xâm hại.<br />
Mọt ngô (Sitophilus zeamais<br />
<br />
. Trong bài<br />
<br />
.<br />
Sâu non nở trong hạt thƣờng ă<br />
<br />
[4], [8].<br />
ở động vật, thực vật và vi sinh vật [2].<br />
Ở động vật không xƣơng sống, cysteine<br />
proteinase là enzyme tiêu hóa [2], [9<br />
cysteine proteinase<br />
gen cystatin ch<br />
*<br />
<br />
Tel: 0983 484171, Email: xuanthuytbu@gmail.com<br />
<br />
cystatin II<br />
kế vector chuyển gen mang cấu trúc cystatin<br />
II<br />
.<br />
,<br />
Sử dụng hai mẫu ngô địa phƣơng thu thập ở<br />
tỉnh Sơn La (SL) và tỉnh Hà Giang (HG).<br />
RNA tổng số đƣợc tách chiết bằng Trizol<br />
Reagent KIT; cDNA đƣợc tổng hợp theo quy<br />
trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis<br />
KIT; gen cystatin đƣợc khuếch đại bằng kỹ<br />
thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu kỳ<br />
nhiệt: 940C/4 phút - (940C/45 giây - 580C/30<br />
101<br />
<br />
Vì Thị Xuân Thủy và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
giây - 720C/60 giây)30 chu kỳ - 720C/10 phút.<br />
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di<br />
trên gel agarose 0,8%; tinh sạch sản phẩm<br />
PCR theo GeneJET PCR Purification KIT và<br />
gắn vào vector tách dòng pBT rồi biến nạp<br />
vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng sốc<br />
nhiệt (420C trong 1 phút 30 giây). Vi khuẩn<br />
mang vector tái tổ hợp đƣợc chọn lọc trên<br />
môi trƣờng LB đặc bổ sung X-g<br />
-PCR<br />
với cặp mồi M13. Plasmid tái tổ hợp đƣợc thu<br />
nhận bằng cách tách chiết theo phƣơng pháp<br />
tách dòng phân tử [7<br />
tự động ABI Prism 3130 - USA/Japan. Số<br />
liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm BioEdit,<br />
DNAStar.<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
Nhân bản gen cystatin II từ mRNA<br />
Cặp mồi đặc hiệu ZmCysF/Zm<br />
để khuếch đại đoạn mã hoá của gen cystatin II<br />
tin về trình tự gen cystatin II<br />
<br />
cystatin II ƣớc tính khoảng 400 bp.<br />
ZmCysF:5‟ACCATGCCCAACAAACATCG<br />
AATCG 3‟<br />
ZmCysR:5‟TTAGGCGCTAGCACCCTCTT<br />
CA 3‟<br />
ngô 5 - 7 ngày tuổi, RNA tổng số đƣợc sử<br />
dụng làm khuôn cho phản ứng phiên mã<br />
ngƣợc tạo cDNA với mồi ngẫu nhiên<br />
(Random Hexamer Primer). Phản ứng PCR<br />
nhân bản đoạn mã hóa của gen cystatin II với<br />
cặp mồi đã thiết kế ZmCysF/ZmCysR,<br />
1kb đƣợc thể<br />
<br />
119(05): 101 - 106<br />
<br />
cystatin II<br />
38130 trên<br />
Ngân hàng gen Quốc tế. Nhƣ vậy, chúng tôi<br />
có thể sơ bộ kết luận đã nhân bản đƣợc gen<br />
cystatin II từ RNA của hai mẫu ngô địa<br />
phƣơng nghiên cứu.<br />
<br />
bào khả biến E.coli DH5α và chọn lọc khuẩn<br />
lạc trắng bằng phản ứng colony-PCR với cặp<br />
mồi M13. Những khuẩn lạc trắng dƣơng tính<br />
với colony-PCR có khả năng mang vector tái<br />
tổ hợp pBT_cystatin II. Sau khi tách plasmid<br />
từ sinh khối vi khuẩn, chúng tôi thực hiện<br />
kiểm tra sự có mặt của gen cystatin II bằng<br />
cách sử dụng enzyme giới hạn BamHI để cắt<br />
plasmid tái tổ hợp (Hình 1B).<br />
Theo tính toán lý thuyết, vector pBT có kích<br />
thƣớc 2700 bp, sản phẩm PCR gen đích 400<br />
bp thì plasmid tái tổ hợp có kích thƣớc<br />
khoảng 3100 bp. Kết quả điện di kiểm tra<br />
(Hình 1B) cho thấy, các dòng khuẩn lạc trắng<br />
dƣơng tính với colony-PCR đều mang<br />
plasmid tái tổ hợp (pBT_cystatin II). Các<br />
plasmid tái tổ hợp đƣợc sử dụng để xác định<br />
trình tự nucleotide.<br />
Xác định trình tự cDNA cystain II của hai<br />
mẫu ngô nghiên cứu<br />
Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen<br />
cystatin II<br />
2)<br />
cystatin II<br />
nucleotide của gen cystatin II công bố trên<br />
<br />
1).<br />
<br />
hiện ở hình 1A.<br />
400bp, hàm lƣợ<br />
<br />
102<br />
<br />
protein cystatin<br />
D38130 của GenBank (H<br />
3)<br />
protein cystatin<br />
134 amino<br />
acid, trong đó có 9 amino acid sai khác ở các<br />
vị trí cụ thể đƣợc trình bày ở bảng 2.<br />
<br />
Vì Thị Xuân Thủy và Đtg<br />
<br />
M<br />
<br />
SL<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
HG<br />
<br />
M<br />
<br />
119(05): 101 - 106<br />
<br />
HG<br />
<br />
SL<br />
<br />
ĐC<br />
<br />
~3100 bp<br />
~2700 bp<br />
<br />
500 bp<br />
~400 bp<br />
<br />
500 bp<br />
~400 bp<br />
<br />
250 bp<br />
250 bp<br />
<br />
A<br />
<br />
B<br />
<br />
Hình 1. A: Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen cystatin II của hai mẫu ngô SL và HG (M: DNA<br />
Marker 1kb); B:<br />
BamHI(M: DNA marker 1kb; SL, HG:<br />
plasmid tái tổ hợp pBT_cystatinII cắt bởi BamHI; ĐC: plasmid tái tổ hợp pBT_cystatinII không cắt bởi BamHI)<br />
<br />
Hình 2. Kết quả so sánh trình tự gen cystatin II của các hai mẫu ngô nghiên cứu<br />
và D38130 trên GenBank<br />
<br />
103<br />
<br />
Vì Thị Xuân Thủy và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
119(05): 101 - 106<br />
<br />
Hình 3. Trình tự amino acid suy diễn của cytatin ở hai mẫu nghiên cứu và D38130 trên GenBank<br />
<br />
Bảng 2 cho thấy, trong 9 vị trí sai khác amino<br />
acid của protein cystatin suy diễn của hai mẫu<br />
SL, HG và D38130 thì có các vị trí thứ 24,<br />
40, 48, 49,118 ở hai mẫu SL, HG là giống<br />
nhau chỉ có sự sai khác với D38130.<br />
<br />
cystatin II<br />
.<br />
<br />
5 vị trí amino acid, đó là các<br />
vị trí thứ 44, 48, 49, 118, 119. Sự sai khác nà<br />
<br />
94,0% đến 95,5%.<br />
Bảng 1. Kết quả so sánh trình tự gen cystatin II của<br />
hai mẫu ngô nghiên cứu và D38130 trên GenBank<br />
Vị trí<br />
27<br />
31<br />
66<br />
71<br />
100<br />
119<br />
130<br />
143<br />
146<br />
344<br />
355<br />
362<br />
<br />
D38130<br />
C<br />
G<br />
G<br />
A<br />
G<br />
T<br />
C<br />
A<br />
A<br />
G<br />
T<br />
A<br />
<br />
HG<br />
A<br />
G<br />
C<br />
C<br />
G<br />
C<br />
A<br />
G<br />
G<br />
C<br />
T<br />
A<br />
<br />
SL<br />
C<br />
T<br />
G<br />
C<br />
A<br />
T<br />
C<br />
G<br />
G<br />
C<br />
C<br />
G<br />
<br />
cystatin II<br />
[5<br />
[6<br />
cystatin II<br />
<br />
Bảng 2.<br />
nghiên cứu và D38130 trên GenBank<br />
Vị trí<br />
11<br />
24<br />
34<br />
40<br />
44<br />
48<br />
49<br />
118<br />
119<br />
<br />
D38130<br />
A<br />
N<br />
D<br />
V<br />
Q<br />
E<br />
N<br />
K<br />
F<br />
<br />
HG<br />
A<br />
T<br />
D<br />
A<br />
K<br />
G<br />
S<br />
N<br />
F<br />
<br />
.<br />
<br />
SL<br />
S<br />
T<br />
N<br />
A<br />
Q<br />
G<br />
S<br />
N<br />
L<br />
<br />
proteinase [6<br />
<br />
[2<br />
, gen<br />
104<br />
<br />
Vì Thị Xuân Thủy và Đtg<br />
<br />
Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br />
<br />
, lúa gạo và<br />
đậu xanh.<br />
KẾT LUẬN<br />
Gen cystatin II<br />
ngô địa phƣơng HG, SL có kíc<br />
134 amino<br />
acid. Trình tự nucleotide của gen cystatin II<br />
<br />
kết với<br />
. Trình tự gen<br />
cystatin II<br />
phục vụ<br />
chuyển gen ở cây ngô.<br />
Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành có sử<br />
dụng thiết bị Phòng thí nghiệm trọng điểm về công<br />
nghệ gen –Viện Công nghệ Sinh học và thuộc nội<br />
dung của đề tài Khoa học-Công nghệ cấp ĐHTN,<br />
.<br />
<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
1. Abe M., Arai S. 1991, Some propeties of a<br />
cystein proteinase inhibitor from corn endosperm.<br />
Agricultural and biological chemistry, 55(9):<br />
2417-2418.<br />
2. Grudkowska M., Zagdanska B., (2004).<br />
Multifuncationl role of plant cysteine proteinase.<br />
Acta biochimica Polonica, 51: 609- 624<br />
3. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng<br />
Văn Hinh, (2000), Giáo trình cây ngô, Nxb Nông<br />
nghiệp.<br />
4. Markham R.H., Bosque-Pérez N.A.,<br />
Borgemeister C., Meikle W.G., 1994. Developing<br />
pest management strategies for the maize weevil,<br />
Sitophilus zeamais and the larger grain borer,<br />
Prostephanus truncatus, in the humid and sub-<br />
<br />
119(05): 101 - 106<br />
<br />
humid tropics. FAO Plant Protection Bulletin 42:<br />
97-116.<br />
5. Massonneau A., Condamine P., Wisniewski<br />
J.P., Zivy M., Rogowsky P.M., 2005. Maize<br />
cystatins respond to developmental cues, cold<br />
stress and drought. Biochim Biophys Acta. 1729<br />
(3):186-99.<br />
Meriem B., Urte S., Juan V., Marie-Claire G.,<br />
Dominique M., 2010. Plant cystatins, Biochimie<br />
92: 1657-1666.<br />
6. Moeller D.A., Tiffin P., 2005. Genetic diversity<br />
and the evolutionary history of plant immunity<br />
genes in two species of Zea. Mol Biol Evol., 22<br />
(12): 2480-90.<br />
7. Nikolay S. Outchkourov, Willem Jan De Kogel,<br />
Antje Schuurman-de Bruin, Magnus Abrahamson,<br />
Maarten A. Jongsma, 2004. Specific cysteine<br />
protease inhibitors act as deterrents of western<br />
flower<br />
thrips,<br />
Frankliniella<br />
occidentalis<br />
(Pergande), in transgenic potato. Plant Biotechnol.<br />
J, 2(5): 439–448<br />
8. Rafael Guttiérrez-Campos, Juan Antonio<br />
Torres-Acosta, Luis Jorge Saucedo-Arias and<br />
Miguel Angel Gomez-Lim, 1999. The use of<br />
cysteine proteinase inhibitors to engineer<br />
resistance against potyviruses in transgenic<br />
tobacco plants. Nat. Biotechnol. 17: 1223-1226.<br />
9. Sambrook J., Russell D.W. 2001. Molecular<br />
Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring<br />
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.<br />
10. Senthilkumar R; Cheng C.P; Yeh K.W. 2010.<br />
Genetically pyramiding protease-inhibitor genes<br />
for dual broad-spectrum resistance against insect<br />
and phytopathogens in transgenic tobacco. Plant<br />
Biotechnol J. 8(1):65-75.<br />
11. Throne, J.E. 1994. Life History of Immature<br />
Maize Weevils (Coleoptera: Curculionidae) on<br />
Corn Stored at Constant Temperatures and<br />
Relative Humidities in the Laboratory.<br />
Environmental Entomology, 23 (6): 1459-1471.<br />
12. Turk B., Turk V., Turk D., 1997. Structural<br />
and functional aspects of papain-like cysteine<br />
proteinases and their protein inhibitors, Biol.<br />
Chem. Hopp seyler, 378 (3-4): 141-150<br />
<br />
105<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
