Đánh dấu đồng vị ổn định bằng axit amin trong nghiên cứu protein của vi khuẩn gây bệnh thương hàn Salmonella enterica Typhymurium LT2

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ ỔN ĐỊNH BẰNG AXIT AMIN TRONG<br /> NGHIÊN CỨU PROTEIN CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH THƯƠNG HÀN<br /> SALMONELLA ENTERICA TYPHYMURIUM LT2<br /> TrầnTrung Kiên1, Lin Guo2<br /> Trường Đại học Hùng Vương<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, China<br /> <br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Chúng tôi sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị trao đổi chất bởi axit amin, sau đó dựa trên phân<br /> tích so sánh định lượng proteomic của chủng Salmonella enterica Typhymurium LT2 đột biến gen rstB<br /> với chủng tự nhiên dưới điều kiện không đầy đủ Mg của môi trường nuôi cấy SILAC. Kết quả proteomic<br /> chỉ ra rằng, protein giảm điều hòa trong chủng đột biến gen rstB là gấp hai lần so với protein tăng điều<br /> hòa. Phân tích các con đường trao đổi chất và nhóm chức năng cũng chỉ ra điều này. Mặt khác phân<br /> tích biểu hiện protein của những protein thay đổi thấy rằng một số protein liên quan đến tổng hợp và<br /> vận chuyển sắt là giảm điều hòa đáng kể. Từ những kết quả này, chúng tôi dự đoán rằng chủng đột biến<br /> gen rstB là giảm độc tính.<br /> Từ khóa: Vi khuẩn thương hàn, Salmonella enterica Typhymurium LT2, phổ khối lượng, đánh dấu<br /> đồng vị, proteomic<br /> <br /> <br /> 1. TỔNG QUAN<br /> Vi khuẩn gây bệnh thương hàn có tên khoa học Salmonella enterica Typhimurium là một vi<br /> khuẩn Gram âm, chúng là nguyên nhân gây nên bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột, nhiễm trùng<br /> huyết, chúng có khả năng đáp ứng cao và gây bệnh cho cả người và động vật. Salmonella đi vào<br /> cơ thể qua đường miệng bởi thức ăn, nước uống nhiễm khuẩn và thích ứng với môi trường có độ<br /> pH thấp ở dạ dày.<br /> Proteomic là một thuật ngữ chỉ lĩnh vực nghiên cứu rộng lớn về protein đặc biệt về cấu trúc<br /> và chức năng, nó được phát triển trong khoảng 20 năm trở lại đây. Phương pháp khối phổ (mass<br /> spectrometry- MS), là một kỹ thuật dùng để đo đạc tỷ lệ khối lượng trên điện tích của ion (mass-<br /> to-charge ratio - m/z), dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế để cho ra phổ khối lượng. MS-dựa<br /> trên proteomics đang ngày càng trở thành công cụ mạnh mẽ và cần thiết cho nghiên cứu cơ bản như<br /> nghiên cứu tương tác giữa protein - protein, sửa đổi sau phiên mã, biểu hiện của protein - mối quan<br /> hệ với mARN; cho việc tìm ra nguyên nhân bệnh tật và chuẩn đoán; cho việc phát triển dược phẩm.<br /> Trong một vài phương pháp đánh dấu quá trình trao đổi chất, đánh dấu đồng vị ổn định bằng<br /> axit amin trong nuôi cấy tế bào (Stable Isotope Labeling by Amino acids in cell Culture - SILAC)<br /> nổi lên là một phương pháp đơn giản, chính xác để biểu hiện protein bằng việc đưa vào đồng vị ổn<br /> định tới tất cả các protein tế bào thông qua axit amin, thường là lysine and arginine. Một quần thể<br /> tế bào được phát triển trong môi trường chứa axit amin tự nhiên (SILAC- nhẹ), một quần thể khác<br /> được phát triển trong môi trường chứa axit amin đánh dấu với đồng vị (không phóng xạ) nặng ổn<br /> định (SILAC-nặng). Môi trường chứa arginine đánh dấu với sáu nguyên tử cacbon 13 (13C) thay<br /> cho cacbon 12 (12C). Khi các tế bào phát triển trong môi trường này, chúng hợp nhất axit amin nặng<br /> tới peptide dẫn đến sự thay đổi lượng so sánh với peptide tương ứng nhẹ (6 Da trong trường hợp của<br /> <br /> 118 KHCN 2 (31) - 2014<br />  KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> 13<br /> C6-Arg), nhưng không thay đổi thành phần hóa học khác. Các tế bào sau khi được trộn lẫn sẽ được<br /> định lượng proteomic, mỗi peptide xuất hiện là một cặp trong quang phổ lượng - peptide với lượng<br /> thấp chứa axit amin nhẹ và peptide với lượng cao chứa axit amin nặng, tương ứng với các quần thể<br /> tế bào nuôi cấy được đánh dấu. Căn cứ vào tỷ lệ peptide được xác định bởi MS để thấy được sự thay<br /> đổi proteome, so sánh mức độ protein liên quan giữa các trạng thái tế bào khác nhau.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện định lượng protein, tập trung trên những protein<br /> thay đổi đáng kể của Salmonella enterica Typhimurium LT2 (S.Typhimurium LT2) vi khuẩn thương<br /> hàn LT2 dưới điều kiện kích hoạt hệ thống PhoP/PhoQ (ở nồng độ Mg thấp). Dựa trên kỹ thuật<br /> đánh dấu protein, một nồng độ tối thiểu của Mg là được sử dụng để đánh dấu đồng vị axit amin<br /> trong nuôi cấy tế bào. Tiếp theo chúng tôi sử dụng sắc ký lỏng cao áp - bộ đôi phổ khối lượng (LC-<br /> MS/MS) - dựa trên proteomic để thực hiện phân tích so sánh định lượng protein của chủng đột biến<br /> gen rstB với chủng tự nhiên LT2. Vi khuẩn được nuôi cấy dưới điều kiện nồng độ Mg tối thiểu,<br /> điều kiện này đã được chỉ ra gần giống với môi trường mà vi khuẩn gặp phải trong đại thực bào [4].<br /> Chúng tôi áp dụng thành công với hiệu suất cao kỹ thuật đánh dấu ổn định đồng vị bằng<br /> axit amin và phương pháp khối phổ, dữ liệu chỉ ra một quan sát toàn diện về độ phong phú của<br /> protein của chủng đột biến rstB gen so với chủng tự nhiên. Từ dữ liệu thu được, chúng tôi phân<br /> tích các con đường trao đổi chất, nhóm chức năng, sự tăng giảm của các protein điều hòa. Kết<br /> quả về sự thay đổi của các protein quan tâm được xác nhận bằng real-time PCR và một số biểu<br /> hiện kiểu hình.<br /> 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP<br /> 2.1. Chủng vi khuẩn, môi trường nuôi cấy và điều kiện phát triển.<br /> Vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu này là S.Typhimurium LT2 (vi khuẩn thương hàn chủng<br /> LT2) và chủng đột biến gen rstB. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Luria - Bertani<br /> (LB) (10g/l NaCl, 5g/l Yeast extract, 10g/l Tryptone) và môi trường tối thiểu N (5mM KCl,<br /> 7.5mM (NH4)2SO4, 0.5mM K2SO4, 1mM KH2PO4, 0.1M Tris-base, 38mM glycerol, pH 7.4).<br /> Môi trường tối thiểu N-SILAC được bổ sung với 10 µM MgCl2 and 40g/L lysine, 40g/L arginine<br /> với ligh [13C615N4]-L-arginine và heavy [13C615N2]-<br /> L-lysine. Vi khuẩn được nuôi cấy ở điều kiện 37oC,<br /> với lắc đều trong 9h.<br /> 2.2. Chuẩn bị mẫu protein và phân giải<br /> Peptide<br /> Chuẩn bị mẫu protein: Vi khuẩn sau khi nuôi<br /> cấy 9h trong môi trường nuôi cấy SILAC, được thu<br /> hoạch và li tâm với tốc độ 10000g/phút trong 15 phút<br /> ở 4oC thu cặn, sau đó được làm tan trong dung dịch<br /> chứa 5mM Tris-HCl, 5mM EDTA, pH 7.5. Dịch tế<br /> bào sau đó được phá vỡ bằng sóng siêu âm (altra-<br /> sonication), li tâm loại bỏ những mảnh vỡ tế bào còn<br /> lại, dịch chiết protein thô được đo bởi phương pháp Hình 1: Các bước thực hiện trong<br /> nghiên cứu proteomic của vi khuẩn<br /> Bradford và trộn theo tỷ lệ 1:1 của đồng vị nặng - nhẹ<br /> gây bệnh thương hàn<br /> và bảo quản ở -80oC.<br /> <br /> KHCN 2 (31) - 2014 119<br /> KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> Phân giải peptide: Protein thu được từ nuôi cấy SILAC được khử, alkyl hóa, thuỷ phân bằng<br /> trypsin và loại muối (Hình 1). Sau cùng peptide được phân tách bởi sắc ký trao đổi ion (Strong<br /> Cation Exchange chromatography-SCX). Tiếp theo các phân đoạn peptide được loại muối bởi đầu<br /> micropipet Ziptip C18 và hút chân không đến khô trước khi nhận diện peptide bởi MS<br /> 2.3. Xác định protein và làm giàu dữ liệu<br /> Phổ lượng được thực hiện bằng với cặp đôi thiết bị QSTAR-Eliter với hệ thống nano MDLC.<br /> Dữ liệu thu được từ thiết bị đo được xử lý tiếp với phần mền Mascot Daemon (version 2.3, Matrix<br /> Science, London, U.K.) để lựa chọn các đỉnh phù hợp dựa trên máy chủ MASCOT dựa trên kho dữ<br /> liệu của vi khuẩn S.Typhimurium được tải xuống từ Uniprot Web (http://www.uniprot.org). Và các<br /> thông số phù hợp cho việc phân tích định lượng được thiết lập cho phần mền xử lý.<br /> Sau khi dữ liệu proteomic được tạo ra, công việc tiếp theo là phân loại các nhóm chức năng<br /> của protein bằng việc chuyển dữ liệu thu được đến kho dữ liệu của máy chủ để tự động phân loại<br /> thông qua DAVID BIOINFORMATICS Resources 6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) và các con<br /> đường trao đổi chất thông qua KEGG PATHWAY (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html). Và<br /> cuối cùng những protein quan tâm được phân tích và xác nhận kết quả một lần nữa thông qua real-<br /> time PCR. Toàn bộ quy trình được mô tả qua hình 1.<br /> 2.4. Định lượng real - time PCR (qPCR)<br /> Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi thu được tách chiết RNA, sau đó chuỗi đơn cDNA được tổng<br /> hợp. qPCR được thực hiện với CFX Manager Version 3.0 với supermix SYBR green. dnaK được<br /> sử dụng như gen tiêu chuẩn (internal control), thí nghiệm được lặp lại 3 lần với mỗi mẫu.<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Tổng quan dữ liệu proteomics<br /> Proteomics được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật với mục đích nhận biết biểu hiện<br /> protein của sinh bệnh học dưới những biến đổi của môi trường. Để nghiên cứu sự thay đổi pro-<br /> tein của chủng S.Typhimurium LT2 đột biến<br /> gen rstB so sánh với S.Typhimurium LT2<br /> chủng tự nhiên, mẫu protein được chuẩn bị<br /> bởi phương pháp đánh dấu đồng vị ổn định<br /> bởi axit amin với 9h nuôi cấy trong môi<br /> trường tối thiểu N- SILAC, nồng độ Mg<br /> thấp. Tiếp theo peptide được tách bởi sắc<br /> ký lỏng (SCX) và xác định bởi phổ lượng<br /> MS/MS và cuối cùng định lượng bởi phần<br /> mền Mascot Daemon. Thí nghiệm SILAC<br /> và định lượng proteomics được thực hiện<br /> hai lần. Kết quả định lượng xác định tổng<br /> số 911 protein, chiếm khoảng 20% tổng số<br /> Hình 2: Kết quả định lượng MS với các tỷ lệ<br /> protein đã được dự đoán trong Salmonella. protein được chỉ ra. Trục tung tương ứng<br /> Phân tích tỷ lệ protein giữa chủng đột biến số lượng protein, trục hoành tương ứng với<br /> gen rstB với chủng tự nhiên (∆RstB/WT) khoảng thay đổi của dữ liệu định lượng.<br /> <br /> <br /> 120 KHCN 2 (31) - 2014<br />  KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> thấy rằng 55,92% protein là không thay đổi với tỷ lệ từ 0,769 đến 1,3; 13,93% là tăng điều hòa<br /> (up-regulated) với tỷ lệ trên 1,3; 30,15% là giảm điều hòa (down-regulated) với tỷ lệ nhỏ hơn 0,769<br /> (hình 2).<br /> Như vậy có thể thấy rằng protein giảm điều hòa là cao hơn khoảng hai lần so với protein<br /> tăng điều hòa. Hầu hết những protein tăng điều hòa là những protein liên quan đến quá trình trao<br /> đổi chất, nó có thể cần thiết cho sự đền bù khi phải trải qua điều kiện môi trường không thuận lợi.<br /> Protein giảm điều hòa bao gồm nhiều protein liên quan đến độc tính của vi khuẩn, tích lũy và vận<br /> chuyển kim loại như Mg, Fe, P…<br /> 3.2. Phân tích các con đường trao đổi chất và nhóm chức năng từ dữ liệu proteomics<br /> Để xác định ảnh hưởng của đột biến gen rstB ở vi khuẩn thương hàn LT2 dưới điều kiện<br /> nuôi cấy với nồng độ Mg thấp ở pha nuôi cấy muộn (9h) (late log phase) trên biểu hiện protein<br /> thông qua các con đường trao đổi chất và nhóm chức năng, chúng tôi thực hiện “làm giàu” dữ<br /> liệu thông qua phân tích Gene Ontology (GO). Kết quả chỉ ra rằng với hơn 900 protein được<br /> phân chia vào 55 con đường trao đổi chất. Trong đó duy nhất 1 con đường trao đổi chất là tăng<br /> điều hòa đó là trao đổi selenoamino acid, 5 con đường trao đổi chất là giảm điều hòa đó là<br /> phosphoryl hóa oxy hóa, trao đổi nitơ, trao đổi Thiamine (Vitamin B1), quá trình tổng hợp, vận<br /> chuyển và điều hòa sắt nội bào.<br /> Cũng thông qua việc phân tích dữ liệu này, các protein được phân chia vào 106, 18 và 36<br /> nhóm chức năng cho protein tổng số, protein tăng điều hòa và protein giảm điều hòa, tương ứng.<br /> Cũng giống như phân tích tỷ lệ protein ở trên, phân tích các nhóm chức năng có thể thấy rằng<br /> số protein giảm điều hòa (down-regulated) được phân chia vào 36 nhóm chức năng, gấp đôi số<br /> nhóm chức năng của các protein tăng điều hòa (up-regulated) (18 nhóm). Dựa trên thông tin và<br /> phân loại dữ liệu này, chúng tôi dự đoán rằng chủng đột biến là giảm độc tố trong điều kiện thí<br /> nghiệm.<br /> 3.3. Protein điều hòa tổng hợp, vận chuyển và cân bằng sắt giảm dưới điều kiện không đầy<br /> đủ Mg của môi trường nuôi cấy SILAC<br /> Protein vận chuyển sắt (siderophore) được biết với vai trò quan trọng trong biểu hiện của<br /> độc lực vi khuẩn và hình thành màng sinh học (biofilm). Protein vận chuyển sắt- siderophore kiểm<br /> soát các gen khác nhau để tích lũy và vận chuyển sắt, sắt là cần thiết cho sự phát triển, bảo vệ hoạt<br /> động của tế bào. Kết quả LC-MS/MS chỉ ra bốn protein entrobactin gồm EntA, EntB, EntE, EntF<br /> là giảm điều hòa và các protein cho cân bằng sắt nội môi như IroB, FepA, FepB, FhuA, FhuE, Fes,<br /> NuoB, NuoC, NuoF, NuoG, IscS, IscR cũng giảm điều hòa (Bảng 1).<br /> Để kiểm tra có hay không điều hòa tổng hợp của protein vận chuyển sắt-siderophore và các<br /> protein cho cân bằng sắt nội môi là ảnh hưởng bởi việc xóa gen rstB, chúng tôi thực hiện thiết lập<br /> plasmid pUHE21-2lacIq mang gen rstB và chuyển vào chủng đột biến gen rstB, RstB protein là<br /> được biểu hiện (del rstB.pRstB) với IPTG 0.4mM. Sau đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm kiểm<br /> tra với real-time PCR, kết quả thấy rằng chủng đột biến mang plasmid chứa phần bù của chúng<br /> (pRstB plasmid) là trở lại vai trò của RstB protein. Trong chủng đột biến rstB, vai trò của RstB bị<br /> loại bỏ, do đó các protein liên quan đến tổng hợp của nhóm protein vận chuyển sắt - siderophore<br /> và protein cân bằng sắt nội môi là giảm điều hòa. Chủng đột biến mang plasmid pRstB, vai trò của<br /> RstB protein được thể hiện, dẫn đến làm tăng mức độ sao chép của những gen này tương tự trong<br /> chủng tự nhiên LT2 (Bảng 1). Kết quả này chỉ ra rằng RstB là kích hoạt với những protein điều hòa<br /> tổng hợp vận chuyển sắt - siderophore và protein cân bằng sắt nội môi.<br /> <br /> KHCN 2 (31) - 2014 121<br /> KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> Bảng 1. Một số protein liên quan đến điều hòa tổng hợp siderophore và sắt nội bào được chỉ<br /> ra bởi phổ lượng MS và kết quả xác nhận bằng thí nghiệm qPCR.<br /> MS qPCR<br /> Tên Tỷ lệ ∆RstB (số lần qRstB (số lần Mẫu đối<br /> Protein (Nhẹ/Nặng) biểu hiện) biểu hiện) chứng<br /> EntA 0,53 0,79 ± 0,02 1,28 ± 0,05 1,0 ± 0,03<br /> Liên quan đến tổng hợp<br /> của siderophore và sắt EntB 0,84 0,77 ± 0,04 1,41 ± 0,06 1,0 ± 0,03<br /> nội bào<br /> EntE 0,49 0,82 ± 0,02 1,5 ± 0,08 1,0 ± 0,03<br /> EntF 0,92 0,72 ± 0,03 1,42 ± 0,06 1,0 ± 0,03<br /> Fur 0,62 0,58 ± 0,02 0,84 ± 0,06 1,0 ± 0,03<br /> Fes 0,71 0,71 ± 0,04 1,06 ± 0,05 1 ± 0,06<br /> IroB 0,65 0,95 ± 0,04 1,28 ± 0,06 1 ± 0,06<br /> FepA 0,55 0,91 ± 0,03 1,83 ± 0,11 1 ± 0,04<br /> FepB 1,22 0,72 ± 0,02 1,08 ± 0,09 1,0 ± 0,05<br /> FhuA 0,8 0,73 ± 0,04 1,06 ± 0,05 1,0 ± 0,03<br /> FhuE 0,26 0,70 ± 0,01 1,01 ± 0,07 1,0 ± 0,02<br /> NuoC 0,46 0,88 ± 0,04 1,31 ± 0,09 1,0 ± 0,02<br /> NuoF 1,17 0,74 ± 0,02 1,33 ± 0,1 1,0 ± 0,07<br /> NuoG 0,48 0,79 ± 0,03 1,39 ± ,01 1,0 ± 0,03<br /> NuoB 0,93 0,72 ± 0,03 1,0 ± 0,07 1,0 ± 0,07<br /> IscR 0,45 0,47 ± 0,01 0,82 ± 0,06 1,0 ± 0,04<br /> IscS 0,6 0,63 ± 0,02 1,48 ± 0,1 1,0 ± 0,04<br /> Nhẹ là mẫu đột biến cần kiểm tra được đánh dấu đồng vị với SILAC nhẹ, nặng là mẫu đối chứng (chủng tự<br /> nhiên) được đánh dấu với SILAC nặng. ∆RstB là chủng đột biến gen rstB, qRstB là chủng đột biến gen chứa plasmid<br /> mang gen rstB. Giá trị ±SEM sai số chuẩn của số lần lặp lại thí nghiệm.<br /> <br /> Fur a protein kiểm soát nồng độ sắt trong tế bào, khi nồng độ sắt ngoài môi trường cao Fur<br /> ức chế với những protein liên kết với sắt nội môi để giảm sự hấp thụ và vận chuyển sắt. Kết quả<br /> MS/MS của chúng tôi chỉ ra rằng Fur là giảm điều hòa và kết quả real-time PCR cũng chỉ ra rằng<br /> chủng ∆rstB.pRstB hoàn lại không đầy đủ. Điều này có nghĩa là RstB kiểm soát không hoàn toàn<br /> với Fur protein.<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị trong quá trình trao<br /> đổi chất bằng axit amin, sau đó thực hiện so sánh định lượng proteomic bởi phổ lượng LC-MS/MS<br /> của chủng S.Typhimurium LT2 đột biến gen rstB và chủng S.Typhimurium LT2 tự nhiên phát triển<br /> dưới điều kiện thiếu Mg ở pha nuôi cấy muộn (9h nuôi cấy) thông qua nuôi cấy SILAC. Dữ liệu<br /> proteomic thu được từ phổ lượng thông qua việc phân tích các con đường trao đổi chất, nhóm chức<br /> năng có thể dự đoán được độc tính của vi khuẩn. Mặt khác thông qua việc lựa chọn những protein<br /> thay đổi (tăng điều hòa, giảm điều hòa) để đánh giá biểu hiện protein. Trong những nghiên cứu tiếp<br /> theo chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu biểu hiện protein thông qua những thay đổi của protein khác<br /> và ảnh hưởng của chúng đến sinh bệnh học vi khuẩn.<br /> <br /> 122 KHCN 2 (31) - 2014<br />  KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> Tài liệu tham khảo<br /> 1. Boumediene Soufi, et al. (2010). “Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture<br /> (SILAC) Applied to Quantitative Proteomics of Bacillus subtilis.” J Proteome Res 9(No. 7); 3638-3646.<br /> 2. Hammer, N. D. and E. P. Skaar (2011). “Molecular mechanisms of Staphylococcus aureus<br /> iron acquisition.” Annu Rev Microbiol 65: 129-147.<br /> 3. Haraga, A., et al. (2008). “Salmonellae interplay with host cells.” Nat Rev Microbiol<br /> 6(1): 53-66.<br /> 4. Hebrard, M., et al. (2011). “The challenge of relating gene expression to the virulence of<br /> Salmonella enterica serovar Typhimurium.” Curr Opin Biotechnol 22(2): 200-210.<br /> 5. Huang da, W., et al. (2009). “Bioinformatics enrichment tools: paths toward the<br /> comprehensive functional analysis of large gene lists.” Nucleic Acids Res 37(1): 1-13.<br /> 6. Mann, M. (2006). “Functional and quantitative proteomics using SILAC.” Nat Rev Mol<br /> Cell Biol Vol 7: 952 - 958.<br /> 7. Munday, D. C., et al. (2012). “Using SILAC and quantitative proteomics to investigate the<br /> interactions between viral and host proteomes.” Proteomics 12(4-5): 666-672.<br /> 8. Ong, S. E. and M. Mann (2006). “Protocol: A practical recipe for stable isotope labeling<br /> by amino acids in cell culture (SILAC).” Nat Protocol 1(6): 2650-2660.<br /> 9. Oudenhove, L. and B. Devreese (2013). “A review on recent developments in mass<br /> spectrometry instrumentation and quantitative tools advancing bacterial proteomics.” Applied<br /> Microbiology and Biotechnology 97(11): 4749-4762.<br /> 10. Saha, R., et al. (2013). “Microbial siderophores: a mini review.” J Basic Microbiol 53(4):<br /> 303-317.<br /> 11. Steen, H. and M. Mann (2004). “The ABC’s (and XYZ’s) of peptide sequencing.” Nat<br /> Rev Mol Cell Biol 5(9): 699-711.<br /> 12. Troxell, B., et al. (2011). “The Fur regulon in anaerobically grown Salmonella enterica<br /> sv. Typhimurium: identification of new Fur targets.” BMC Microbiol 11: 236.<br /> 13. Yu, J. L. and L. Guo (2011). “Quantitative proteomic analysis of Salmonella enterica<br /> serovar Typhimurium under PhoP/PhoQ activation conditions.” J. Proteome Res 10(7): 2992-3002.<br /> <br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> STABLE ISOTOPE LABELING BY AMINO ACID IN CELL CULTURE FOR<br /> PROTEOMIC RESEACH OF SALMONELLA ENTERICA TYPHYMURIUM LT2<br /> Tran Trung Kien1, Lin Guo2<br /> 1<br /> Hung Vuong University, 2College of Life Science, Wuhan University, Wuhan, China<br /> We use a SILAC (stable isotope labeling by amino acid in cell culture) - base a proteomic quantitative<br /> comparative analysis by LC-MS/MS of Salmonella enterica Typhymurium LT2 wild-type strain versus<br /> rstB mutant strain under the magnesium limitation of the SILAC culture medium. Proteomics result<br /> indicates that proteins down-regulated were twofold higher than up-regulated in the mutant strain.<br /> Metabolic pathways and functional group analysis also showed the same result. On the other hand,<br /> protein expression analysis of proteins alters shown that proteins relative to the synthesis and transport<br /> of iron were down-regulated. The from these findings predicts that mutant strain were virulence decrease.<br /> Keywords: Salmonella enterica Typhymurium LT2, SILAC, proteomic, LC-MS/MS, protein expression.<br /> <br /> <br /> KHCN 2 (31) - 2014 123<br />