Đánh giá khả năng chịu đựng dịch sinh học của một số dạng bào chế probiotic

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ HẢ NĂNG CHỊU ĐỰNG DỊCH SINH HỌC<br /> CỦA MỘT SỐ DẠNG BÀO CHẾ PROBIOTIC<br /> Nguyễn Tú Anh*; Nguyễn Nam Duy*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá khả năng chịu đựng dịch dạ dày và dịch mật của một số dạng bào chế<br /> probiotic. Đối tượng và phương pháp: vi khuẩn (VK) probiotic thử nghiệm gồm Lactobacillus<br /> acidophilus dạng bột đông khô, cốm đông khô, bột đông khô có đóng gói nitơ, vi nang, bao kép;<br /> Enterococcus faecalis vi nang; Enterococcus faecium bao kép; Bacillus hỗn dịch. Xác định số<br /> lượng VK sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày và dịch mật sau từng khoảng thời gian nhất định. Xác<br /> định số lượng probiotic sau mỗi thử nghiệm bằng phương pháp đếm sống trải trên đĩa thạch.<br /> Kết quả và kết luận: lượng VK Lactobacillus acidophilus ở dạng bột giảm đáng kể sau 3 giờ tiếp<br /> xúc với dịch dạ dày (giảm 85% so với ban đầu) và dịch mật (tiếp tục giảm 88% so với lượng VK<br /> sau 3 giờ tiếp xúc dịch dạ dày). Trong khi đó, ở dạng hạt và dạng đóng gói có nitơ, L. acidophilus<br /> có độ bền tốt hơn trong dịch sinh học (lần lượt giảm 25% và 29%). VK bao vi nang và bao kép<br /> được bảo vệ tốt khi tiếp xúc dịch dạ dày, nhưng lại không hiệu quả đối với dịch mật (trong dịch<br /> dạ dày, Enterococcus giảm ~ 30%, L. acidophilus giảm > 60%). Bacillus cho thấy khả năng chịu<br /> đựng tốt, giảm ~ 20% trong dịch dạ dày và gần như không thay đổi trong dịch mật.<br /> * Từ khóa: Probiotic; Dạng bột; Đóng gói có nitơ; Vi nang; Bao kép; Dịch sinh học; Vi khuẩn<br /> sống sót.<br /> <br /> Evaluation of Endurance to Biological Fluids of some Probiotic’s<br /> Products<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate endurance to gastric juice and bile fluid of some probiotic’s products.<br /> Subjects and methods: Some probiotic’s preparations were tested including Lactobacillus<br /> acidophilus in the freeze-drying powder, granular, nitrogen-packed, micro-capsuled and duocoated forms; Enterococcus faecalis in micro-capsuled form; Enterococcus faecium in duocoated form; Bacillus in suspension. After certain intervals, the number of survival bacteria is<br /> enumerated by plating method. Results and conclusion: Population of Lactobacillus acidophilus<br /> in the freeze-drying powder form decreases significantly after 3 hours exposed to gastric juice<br /> (decrease 85%) and bile (decrease 88% of survival bacteria after 3 hours in gastric juice).<br /> Meanwhile, L. acidophilus in the granular and nitrogen-packed preparation has better endurance to<br /> biological fluids (decrease 25% and 29%). Bacteria in micro-capsuled and duo-coated are<br /> well-protected when exposing to gastric juice but not to bile (in gastric fluid, Enterococcus<br /> decreases ~ 30%, L. acidophilus decreases > 60%). Bacillus shows a well tolerance, decrease ~ 20%<br /> in gastric fluid and almost not change in bile.<br /> * Key words: Probiotic; Powder; Nitrogen-packed; Granular; Biological fluid; Survival bacteria.<br /> * Đại học Y - Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tú Anh (nguyentuanhvn@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/01/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 02/03/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 10/03/2016<br /> <br /> 35<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hiện nay, probiotic được dùng nhiều<br /> dưới dạng dược phẩm, đặc biệt là chế<br /> phẩm đường uống. Vì vậy, một yêu cầu<br /> bắt buộc đặt ra là các VK probiotic phải<br /> có khả năng sống sót khi đi qua dạ dày<br /> ruột, đến nơi tác động và bám dính lên<br /> thành ruột để phát huy tác dụng sinh học<br /> [3]. Hai điều kiện môi trường khắc nghiệt<br /> của cơ thể mà VK phải vượt qua đó là<br /> dịch dạ dày và dịch mật [4, 5]. Ngoài yếu<br /> tố pH thấp, dịch dạ dày còn chứa nhiều<br /> enzym tiêu hóa có thể gây tổn hại vi sinh<br /> vật. Trong khi đó, dịch mật với nồng độ<br /> muối mật càng cao, khả năng ức chế phát<br /> triển của vi sinh vật càng nhiều [6]. Thực<br /> tế cho thấy khi ở dạng nuôi cấy ban đầu,<br /> số lượng probiotic đều bị giảm đáng kể<br /> khi tiếp xúc với dịch dạ dày và dịch mật.<br /> Do đó, một trong những biện pháp hiệu<br /> quả để khắc phục hiện tượng này là bảo<br /> vệ probiotic bằng các dạng bào chế khác<br /> nhau như dạng bột, cốm, đóng gói nitơ, vi<br /> nang, bao kép, hỗn dịch… [1, 2, 7].<br /> Với mục đích đánh giá khả năng bảo<br /> vệ VK probiotic của các dạng bào chế<br /> khác nhau khi đi qua hàng rào dạ dày ruột<br /> của hệ tiêu hóa, nghiên cứu này nhằm:<br /> Đánh giá khả năng chịu đựng dịch sinh<br /> học của một số dạng bào chế probiotic.<br /> Dựa trên kết quả thu được, có thể đề xuất<br /> dạng bào chế phù hợp với một số vi sinh<br /> vật probiotic.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> * VK probiotic thử nghiệm:<br /> Lactobacillus acidophilus dạng bột đông<br /> khô, cốm đông khô, bột đông khô có đóng<br /> gói nitơ, vi nang, bao kép; Enterococcus<br /> <br /> 36<br /> <br /> faecalis vi nang; Enterococcus faecium<br /> bao kép; Bacillus hỗn dịch.<br /> * Môi trường đếm VK:<br /> Đếm Lactobacillus trên môi trường<br /> MRS (Merck), Bacillus trên TSA (Merck),<br /> Enterococcus trên natri azide - TTC.<br /> * Xác định số lượng VK sống ban đầu:<br /> Cân 0,5 g chế phẩm (dạng hỗn dịch,<br /> hút 0,5 ml chế phẩm). Bổ sung nước<br /> muối 0,85% vừa đủ 5 ml, tiếp tục pha<br /> loãng thành dãy nồng độ cấp số 10 đến<br /> nồng độ 10-5. Tại mỗi độ pha loãng, hút<br /> 100 µl dịch trải trên đĩa petri chứa môi<br /> trường thích hợp. Mỗi độ pha loãng lặp lại<br /> 3 lần.<br /> * Dịch sinh học:<br /> Chuẩn bị môi trường dịch vị nhân tạo<br /> gồm pepsin (HiMedia) 3,2 g/l, NaCl 2 g/l,<br /> HCl vừa đủ điều chỉnh pH 3 và dịch mật<br /> nhân tạo 0,5% pH 6,8 gồm KH2PO4 6,81 g/l,<br /> NaOH 896 mg/l, muối mật (HiMedia).<br /> * Xác định số lượng VK sau khi tiếp xúc<br /> với dịch dạ dày:<br /> Cân 0,5 g chế phẩm cho vào 5 ml dịch<br /> vị, lắc với tốc độ 80 vòng/phút. Sau thời<br /> gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ, lần lượt hút<br /> 100 µl dịch và pha loãng thành dãy nồng<br /> độ cấp số 10 đến độ pha loãng 10-5. Tại mỗi<br /> độ pha loãng, hút 100 µl dịch để trải trên<br /> đĩa petri chứa môi trường thích hợp. Mỗi độ<br /> pha loãng lặp lại 3 lần [6, 8, 9].<br /> * Xác định số lượng VK sau khi tiếp xúc<br /> với dịch mật:<br /> Sau 3 giờ tiếp xúc với dịch vị, ly tâm<br /> VK 10 phút với tốc độ 9.600 vòng/phút.<br /> Loại bỏ phần dịch nổi, thêm dịch mật vừa<br /> đủ 5 ml, lắc với tốc độ 50 vòng/phút. Sau<br /> thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ, xác định<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> số lượng VK tương tự như thử nghiệm<br /> với dịch dạ dày [6, 8, 9].<br /> Chọn các đĩa petri có 30 - 300 khóm,<br /> số đơn vị tạo khuẩn lạc CFU (Colony<br /> Forming Unit)/1 ml dịch được xác định<br /> theo công thức:<br /> <br /> N<br /> <br /> C<br /> <br />  C: tổng số khóm đếm được trên tất<br /> cả các đĩa tại một nồng độ pha loãng.<br /> n: số đĩa có thể đếm được số khóm<br /> tại nồng độ pha loãng.<br /> d: hệ số pha loãng.<br /> V: thể tích dịch được trải (ml).<br /> <br /> n.d .V<br /> <br /> N: số đơn vị tạo khuẩn lạc/1 ml dịch<br /> (CFU/ml).<br /> <br /> Xử lý kết quả bằng phân tích ANOVA,<br /> đánh giá sự khác biệt giữa dân số VK<br /> trong các thử nghiệm.<br /> <br /> ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> .<br /> <br /> hả ă g chịu đự g dịch si h học của dạ g bào chế đô g hô.<br /> <br /> Bảng 1: Dân số L. acidophilus trong bột đông khô sau thời gian tiếp xúc với dịch<br /> sinh học.<br /> Dân số VK (CFU/ml)<br /> Thời gian<br /> <br /> Lần 1<br /> <br /> Lần 2<br /> <br /> 7<br /> <br /> 6,8.10<br /> <br /> Lần 3<br /> <br /> 7<br /> <br /> 6,5.10<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 7<br /> <br /> 6,6.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> Ban đầu (0 giờ)<br /> <br /> 6,5.10<br /> <br /> Tiếp xúc dịch dạ dày<br /> Sau 1 giờ<br /> Sau 2 giờ<br /> Sau 3 giờ<br /> <br /> 9,0.10<br /> 6<br /> 3,7.10<br /> 5<br /> 7,9.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 9,7.10<br /> 6<br /> 3,9.10<br /> 5<br /> 8,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 9,8.10<br /> 6<br /> 3,8.10<br /> 5<br /> 8,3.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 9,5.10<br /> 6<br /> 3,8.10<br /> 5<br /> 8,2.10<br /> <br /> Tiếp xúc với dịch mật<br /> Sau 1 giờ<br /> Sau 2 giờ<br /> Sau 3 giờ<br /> <br /> 2,4.10<br /> 5<br /> 1,5.10<br /> 4<br /> 9,0.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 2.5.10<br /> 5<br /> 1,6.10<br /> 4<br /> 9,8.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 2,5.10<br /> 5<br /> 1,5.10<br /> 4<br /> 9,7.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 2,5.10<br /> 5<br /> 1,5.10<br /> 4<br /> 9,5.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5<br /> <br /> Bảng 2: Dân số L. acidophilus dạng đóng gói nitơ sau thời gian tiếp xúc với dịch<br /> sinh học.<br /> Thời gia<br /> <br /> Dâ số V<br /> Lần 1<br /> <br /> Lần 2<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1,7.10<br /> <br /> (CFU/ml)<br /> Lần 3<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1,4.10<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1,5.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> Ban đầu (0 giờ)<br /> <br /> 1,4.10<br /> <br /> Tiếp xúc dịch dạ dày<br /> Sau 1 giờ<br /> Sau 2 giờ<br /> Sau 3 giờ<br /> <br /> 4,6.10<br /> 6<br /> 3,7.10<br /> 6<br /> 3,1.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,1.10<br /> 6<br /> 3,5.10<br /> 6<br /> 3,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,0.10<br /> 6<br /> 3,9.10<br /> 6<br /> 3,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,9.10<br /> 6<br /> 3,7.10<br /> 6<br /> 3,3.10<br /> <br /> Tiếp xúc với dịch mật<br /> Sau 1 giờ<br /> Sau 2 giờ<br /> Sau 3 giờ<br /> <br /> 2,2.10<br /> 6<br /> 1,8.10<br /> 6<br /> 1,3.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,3.10<br /> 6<br /> 1,8.10<br /> 6<br /> 1,6.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,0.10<br /> 6<br /> 1,7.10<br /> 6<br /> 1,8.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,2.10<br /> 6<br /> 1,8.10<br /> 6<br /> 1,6.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 37<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> Bảng 3: Dân số L. acidophilus dạng cốm sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học.<br /> Dâ số V<br /> <br /> (CFU/ml)<br /> <br /> Thời gia<br /> Lần 1<br /> Ban đầu (0 giờ)<br /> <br /> Lần 2<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,8.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,8.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,0.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,1.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,4.10<br /> <br /> 5,2.10<br /> <br /> Lần 3<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6,1.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,5.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,1.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,7.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,4.10<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,7.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,3.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,1.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4,5.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,3.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,2.10<br /> <br /> Tiếp xúc dịch dạ dày<br /> Sau 1 giờ<br /> <br /> 4,0.10<br /> <br /> Sau 2 giờ<br /> <br /> 3,4.10<br /> <br /> Sau 3 giờ<br /> <br /> 4,8.10<br /> <br /> 6<br /> 6<br /> 6<br /> <br /> Tiếp xúc với dịch mật<br /> Sau 1 giờ<br /> <br /> 3,4.10<br /> <br /> Sau 2 giờ<br /> <br /> 2,3.10<br /> <br /> Sau 3 giờ<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,2.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,3.10<br /> <br /> 3,1.10<br /> <br /> 6<br /> 6<br /> 6<br /> <br /> So với ban đầu, L. acidophilus ở các<br /> <br /> Trong thử nghiệm với dịch mật, sau<br /> <br /> dạng bột đông khô bị giảm nhanh chóng<br /> <br /> 3 giờ tiếp xúc, bột L. acidophilus bị giảm<br /> <br /> ngay sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày<br /> <br /> 88% so với lượng VK sau 3 giờ tiếp xúc<br /> <br /> 1 giờ, trong đó tỷ lệ chết cao nhất là<br /> <br /> dịch dạ dày. Trong khi đó, tỷ lệ này ở<br /> <br /> L. acidophilus dạng bột (85%) và thấp nhất<br /> <br /> dạng bột đóng gói nitơ là 51% và thấp<br /> <br /> là dạng cốm (25%). Sau 3 giờ, dân số<br /> <br /> nhất ở dạng cốm với 29% (hình 1, bảng 1,<br /> <br /> L. acidophilus dạng bột giảm từ 6,6.107<br /> <br /> 2, 3). Hiện tượng này có thể do VK dạng<br /> <br /> CFU/ml xuống chỉ còn 8,2.105 CFU/ml<br /> (bảng 1), dạng bột khô nhưng được đóng<br /> gói có nitơ giảm từ 1,5.107 CFU/ml xuống<br /> còn 3,3.106 CFU/ml (bảng 2). Trong khi đó,<br /> lượng VK dạng cốm chỉ giảm từ 5,7.10 6<br /> CFU/ml xuống 4,5.10 6 CFU/ml (bảng 3).<br /> Theo phân tích ANOVA, tất cả các so sánh<br /> <br /> đông khô chưa được bảo vệ trong suốt<br /> quá trình sản xuất và bảo quản. VK phải<br /> tiếp xúc trực tiếp với một số yếu tố bất lợi<br /> như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm hay các<br /> lực cơ học nên tế bào VK bị tổn thương.<br /> Vì vậy, khi thay đổi môi trường sống đột<br /> ngột - môi trường dịch dạ dày, khả năng<br /> thích ứng với môi trường sống mới của<br /> <br /> đều có F > Fcrit, nghĩa là khác biệt có ý<br /> <br /> VK bị giảm đi đáng kể. Bên cạnh đó,<br /> <br /> nghĩa thống kê giữa dân số VK trong các<br /> <br /> kỹ thuật đông khô có ảnh hưởng rất nhiều<br /> <br /> thử nghiệm. Sau 2 giờ, cốm L. acidophilus có<br /> <br /> đến sản phẩm đông khô như quá trình<br /> <br /> tăng sinh nên đến cuối giờ thứ ba, so với<br /> <br /> làm đông VK nhanh hay chậm, chọn VK ở<br /> <br /> lượng ban đầu thì lượng VK chỉ giảm 21%<br /> <br /> giai đoạn phát triển nào để tiến hành đông<br /> <br /> (bảng 3, hình 1).<br /> <br /> khô cũng đóng vai trò quan trọng.<br /> <br /> 38<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016<br /> <br /> BĐ<br /> <br /> 1h<br /> <br /> 2h<br /> <br /> 3h<br /> <br /> 1h’<br /> <br /> 2h’<br /> <br /> 3h’<br /> <br /> BĐ: ban đầu<br /> 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ: thời gian tiếp xúc dịch dạ dày<br /> 1 giờ’, 2 giờ’, 3 giờ’: thời gian tiếp xúc dịch mật<br /> <br /> Hình 1: Dân số L. acidophilus ở các dạng bột đông khô sau<br /> thời gian tiếp xúc với dịch sinh học.<br /> 2.<br /> <br /> hả ă g chịu đự g dịch si h học của dạ g vi a g và bao ép.<br /> <br /> Bảng 4: Dân số E. faecalis và L. acidophilus dạng vi nang sau thời gian tiếp xúc với<br /> dịch sinh học.<br /> Dân số VK (CFU/ml)<br /> Thời<br /> gian<br /> <br /> L.acidophilus<br /> Lần 1<br /> <br /> Ban đầu<br /> <br /> Lần 2<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,0.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,7.10<br /> <br /> 4,8.10<br /> <br /> Lần 3<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,1.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,9.10<br /> <br /> E. faecalis<br /> Trung bình<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,0.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 2,4.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,8.10<br /> <br /> Lần 1<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,8.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,0.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 3,0.10<br /> <br /> Lần 2<br /> <br /> 7<br /> <br /> 4,2.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 3,1.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,8.10<br /> <br /> Lần 3<br /> <br /> 7<br /> <br /> 4,0.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 3,1.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,8.10<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 7<br /> <br /> 4,0.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 7<br /> <br /> 3,1.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,8.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,7.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,1.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1,6.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,1.10<br /> <br /> DD<br /> 1 giờ<br /> <br /> 2,3.10<br /> <br /> 2 giờ<br /> <br /> 1,8.10<br /> <br /> 3 giờ<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,6.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 8,9.10<br /> <br /> 1,8.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,9.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 8,8.10<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1,8.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 8,7.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,7.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,9.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,8.10<br /> <br /> 2,6.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,2.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 2,2.10<br /> <br /> 7<br /> 7<br /> 7<br /> <br /> Mật<br /> 1 giờ<br /> <br /> 8,4.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 3,2.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,8.10<br /> <br /> 2 giờ<br /> <br /> 3,2.10<br /> <br /> 3 giờ<br /> <br /> 1,6.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5<br /> <br /> 3,3.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,8.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 3,2.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,8.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1,5.10<br /> <br /> 5<br /> <br /> 1,1.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1,7.10<br /> <br /> 1,6.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1,2.10<br /> <br /> 7<br /> <br /> 9,9.10<br /> <br /> 7<br /> 7<br /> 7<br /> <br /> DD: tiếp xúc với dịch dạ dày<br /> Mật: tiếp xúc với dịch mật<br /> <br /> 39<br /> <br />