ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

178
lượt xem 41
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là hai trong số các loại cây trồng công nghiệp khá quan trọng. Chúng không những là mặt hàng tiêu dùng phục vụ cho đời sống con người mà còn là nguồn thu ngân sách đáng kể của nhiều quốc gia trên thế giới. Do lợi ích kinh tế đó, nên chúng đã được trồng tại nhiều nơi trên thế giới và không ngừng được mở rộng diện tích. Tại Việt Nam, việc trồng thuốc lá và đậu phộng cũng đem lại những giá trị nhất định, về phương...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2002-2006 Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006
LỜI CẢM TẠ Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng dục để con có được ngày hôm nay. Các em đã, đang và sẽ cùng chị chia sẻ những vui buồn trong cuộc sống. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo nhiều thuận lợi học tập cho em trong suốt bốn năm đại học. Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị tại Trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Vô cùng biết ơn PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em để em có thể hoàn tất khóa luận tốt nghiệp. Trân trọng cám ơn TS. Bùi Minh Trí cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trường đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị Dương đã sẵn lòng giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Cảm ơn các bạn cùng lớp Công Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận. TP. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006 Văn Ngọc Dung iii
TÓM TẮT VĂN NGỌC DUNG. Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 09/ 2006. “ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR”. Hội đồng hướng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN. Đề tài được thực hiện tại các huyện Tân Biên, huyện Bến Cầu, huyện Dương Minh Châu của tỉnh Tây Ninh và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 03/ 2006 đến tháng 08/ 2006. Nội dung tiến hành: Tìm hiểu mức độ nhiễm TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh. Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh tại địa bàn điều tra. Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với TMV, CMV và TSWV. Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA. Kết quả thu được: Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập mẫu ở tỉnh Tây Ninh. Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%). Trong đó, huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%). Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của TMV với kích thước 1000 bp. Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác. iv
MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .............................................................................................................iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt...................................................................................... x Danh sách các hình ............................................................................................... xi Danh sách các bảng .............................................................................................. xii Danh sách các biểu đồ .........................................................................................xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2 Mục đích – Yêu cầu ......................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá ................................................................................ 3 2.1.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 3 2.1.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 3 2.1.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 3 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 4 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 4 2.1.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 4 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 4 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 4 2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng ............................................................................ 7 2.2.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 7 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 7 v
2.2.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 7 2.2.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 8 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 8 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 8 2.2.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 8 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 8 2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 9 2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra ..................................................... 11 2.3.1 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật ............................................ 11 2.3.1.1 Đặc điểm chung .................................................................... 11 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật ......................................... 11 2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá ................... 12 2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng ............... 13 2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus ...................................................... 14 2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV ............................................. 15 2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV ................................................................... 15 2.4.3 Phân loại TSWV ................................................................................. 15 2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV ....................................................................... 16 2.4.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 16 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh.................................................................... 17 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV ........................................... 17 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV ................................................................. 20 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus ............................................................. 20 2.5.1 Nguồn gốc của TMV .......................................................................... 20 2.5.2 Cấu trúc của virus TMV ..................................................................... 21 2.5.3 Phân loại TMV ................................................................................... 21 2.5.4 Dãy ký chủ của TMV ......................................................................... 21 2.5.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 21 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh.................................................................... 22 2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV ............................................. 22 2.5.8 Khống chế bệnh do TMV ................................................................... 24 vi
2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus .......................................................... 24 2.6.1 Nguồn gốc của CMV .......................................................................... 24 2.6.2 Cấu trúc của virus CMV ..................................................................... 24 2.6.3 Phân loại CMV ................................................................................... 24 2.6.4 Dãy ký chủ của CMV ......................................................................... 25 2.6.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 25 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh.................................................................... 26 2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV ............................................. 27 2.6.8 Khống chế bệnh do CMV ................................................................... 27 2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra ............................................... 29 2.7.1 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ............................ 29 2.7.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị ........................................... 29 2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng..................................... 29 2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) .......................................... 30 2.8.1 Nguyên lý ELISA ............................................................................... 30 2.8.2 Phân loại ELISA ................................................................................. 30 2.8.2.1 ELISA trực tiếp .................................................................... 30 2.8.2.2 ELISA gián tiếp .................................................................... 30 2.8.2.3 Sandwich ELISA .................................................................. 31 2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng ELISA ................................... 31 2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA ......................... 31 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................................ 31 2.9.1 Nguyên tắc .......................................................................................... 31 2.9.2 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR .................................................... 33 2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) ............. 34 2.10.1 Nguyên tắc ........................................................................................ 34 2.10.2 Phương pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................. 34 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác ........................................................................... 35 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo ............................................................................. 35 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR ................................................................ 35 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) ................... 35 vii
2.12 Những nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra ........................................................................................................... 36 2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 36 2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam ....................................................... 36 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 37 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 37 3.2 Phương pháp lấy mẫu..................................................................................... 37 3.3 Dụng cụ .......................................................................................................... 37 3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA ....... 38 3.4.1 Hóa chất .............................................................................................. 38 3.4.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 38 3.4.2.1 Ly trích mẫu ......................................................................... 38 3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA.................................................. 38 3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR ............................................ 40 3.5.1 Hóa chất .............................................................................................. 40 3.5.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 41 3.5.2.1 Ly trích RNA ........................................................................ 41 3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR ................................................. 42 3.5.2.3 Đổ gel điện di ....................................................................... 43 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 45 4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA ................................................................... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu........................................................................................ 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ...... 47 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ....... 48 4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập được........................................ 50 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá ............. 51 4.2 Kết quả RT – PCR ......................................................................................... 55 viii
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 60 7. PHỤ LỤC .......................................................................................................... 63 ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pairs cDNA : complementary DNA CMV : Cucumber Mosaic Virus Da : Dalton DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay DEPC : Diethyl pyrodicarbonate DNA : Deoxyribonucleic acic DNase : Deoxyribonuclease dNTP : Deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay Ig : Immunoglobulin mRNA : Messenger ribonucleic acid OD : Optical density p – NPP : p – nitrolphenol phosphate PBS – T : Phosphate buffer saline with Tween – 20 PCR : Polymerase Chain Reaction PVP : Polyvinylpyrolydol RT – PCR : Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction ssRNA : Single strand RNA Ta : Annealing temperature TAE : Tris Acetate Ethylendiaminetetraacid acetic Taq : Thermus aquaticus Tm : Melting temperature TMV : Tobacco Mosaic Virus TSWV : Tomato Spotted Wilt Virus UV : Ultra violet x
DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. ......................................................................... 3 Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L...................... 6 Hình 2.3 Arachis hypogaea L. ......................................................................... 7 Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. ................ 10 Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV ....................................................................... 15 Hình 2.6 Bọ trĩ trưởng thành dài 1 mm ........................................................... 17 Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật .............................. 19 Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV ......................................................................... 21 Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật ............................................ 23 Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV ......................................................................... 25 Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật ................................ 28 Hình 4.12 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu ................ 53 Hình 4.13 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên ............... 54 Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên ........................................................................................... 56 Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu ............................................................................................ 57 xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng ...................................... 45 Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với TMV, CMV và TSWV trên số mẫu thuốc lá .... 46 Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá ............................................ 47 Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá ............................................ 48 Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ................................................... 50 Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát được trên lá ......... 51 xii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dương tính, âm tính với CMV, TMV, TSWV.. 46 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ....................... 47 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ...................... 48 Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ........................................................... 50 Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng trên lá ............................. 51 xiii
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là hai trong số các loại cây trồng công nghiệp khá quan trọng. Chúng không những là mặt hàng tiêu dùng phục vụ cho đời sống con người mà còn là nguồn thu ngân sách đáng kể của nhiều quốc gia trên thế giới. Do lợi ích kinh tế đó, nên chúng đã được trồng tại nhiều nơi trên thế giới và không ngừng được mở rộng diện tích. Tại Việt Nam, việc trồng thuốc lá và đậu phộng cũng đem lại những giá trị nhất định, về phương diện sử dụng lẫn phương diện thương mại, đóng góp một phần không nhỏ vào tổng thu nhập quốc gia. Tuy nhiên, các loại bệnh cây cũng theo đó mà không ngừng phát triển, tấn công cây trồng, và đã gây ra không ít tổn hại cho việc trồng trọt và sử dụng, nhất là bệnh do virus gây nên. Hiện nay, với khoa học tiên tiến, sinh học hiện đại đã phát hiện được trên 650 loài virus gây bệnh cho thực vật. Tỉnh Tây Ninh có diện tích trồng thuốc lá và đậu phộng khá lớn, sản lượng thu hoạch hàng năm khá cao và mang lại nhiều lợi nhuận. Nhưng trong những năm gần đây, việc trồng trọt hai loại cây này đã gặp nhiều tổn thất vì bệnh do virus gây ra. Trong đó, Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) là ba loại virus mà tác hại của nó vô cùng nghiêm trọng, dẫn tới giảm năng suất và chất lượng nguyên liệu cây trồng. Một khi bệnh đã phát triển thành dịch thì rất khó khống chế và có khi phải tiêu hủy tất cả diện tích đã trồng trọt. Việc làm này sẽ gây nhiều khó khăn và đem lại tổn thất lớn cho người trực tiếp canh tác cũng như cho kinh tế đất nước. Chính vì lý do đó mà chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật ELISA và chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”, nhằm đưa ra phương pháp phát hiện bệnh sớm nhất, từ đó có biện pháp ngăn chặn kịp thời, với mong muốn giảm bớt được thiệt hại do các virus này gây
2 ra, góp phần ổn định được nguồn thu nhập từ thuốc lá và đậu phộng cho tỉnh Tây Ninh nói riêng và cả nước nói chung. 1.2 Mục đích Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chẩn đoán bệnh Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) bằng kỹ thuật DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Phát hiện Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction). 1.2.2 Yêu cầu Lấy mẫu thuốc lá có triệu chứng nhiễm CMV, TMV, TSWV và đậu phộng có triệu chứng nhiễm TSWV ngoài đồng ruộng, tại các huyện trên địa bàn tỉnh Tây Ninh. Nắm vững nguyên tắc và các bước tiến hành của kỹ thuật DAS – ELISA và RT – PCR, sau đó mới tiến hành chẩn đoán.
3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá 2.1.1 Vị trí phân loại Ngành : Angiospermae Lớp : Dicotyledones Họ : Solanaceae Tên khoa học : Nicotiana tabacum L. Tên tiếng Anh : Tobacco Tên tiếng Việt : Thuốc lá Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố Cây thuốc lá hoang dại đã có cách đây khoảng bốn ngàn năm, trùng với nền văn minh của người da đỏ vùng Trung và Nam Mỹ. Hàng ngàn năm trước Công nguyên, người da đỏ đã trồng thuốc lá trên những vùng đất mênh mông ở Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico ở Bắc Mỹ, quần đảo Antille và một số nơi khác. Họ dùng thuốc lá với mục đích nghi lễ và chữa bệnh. Năm 1492, trong chuyến thám hiểm tìm ra châu Mỹ, Christophe Columbus đã phát hiện thấy người bản xứ ở quần đảo Antille hút một loại lá cuốn tròn gọi là Tabaccos. Không lâu sau đó, thuốc lá đã được phổ biến và gieo trồng khắp thế giới. Vào những năm 1530 – 1600, cây thuốc lá được các giáo sĩ người Pháp đưa vào Việt Nam. 2.1.3 Đặc điểm di truyền Bộ nhiễm sắc thể 2n = 48. Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 3,9 × 10-12 gram/ bộ nhiễm sắc thể. Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 3,73 × 109 bp. 2.1.4 Đặc điểm hình thái. Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm: Rễ cái, rễ nhánh, rễ hấp thụ và rễ bất định. Rễ thường ăn sâu xuống đất từ 1,5 – 2 m. Thuốc lá là cây cỏ nhất niên, cây trưởng thành thường cao 1 – 2 m, chỉ phân nhánh ở ngọn. Trên thân cây có nhiều lóng, được phân cách bởi những đốt.
4 Lá cây thuốc lá rất to, đơn nguyên, hình bầu dục, đầu hơi nhọn, mọc cách, mềm, có lông dính ở hai mặt. Số lá trên thân chính trung bình từ 20 – 35 lá. Hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, màu trắng hồng, hồng tươi, dài 1 – 2 cm. Quả nang, hai ngăn. Mỗi cây có 100 – 150 quả trên một chùm hoa, có những cây (tùy giống) có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa. Hạt thuốc lá rất nhỏ, rất cứng, bề mặt vỏ hạt sù sì, nhiều nếp nhăn. 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu Thuốc lá là cây ưa sáng trực tiếp. Cây có thể thích nghi với một phổ khí hậu rộng. Nhiệt độ lý tưởng cho cây thuốc lá: 25oC – 28oC. Độ ẩm không khí thích hợp cho cây thuốc lá: 70% 80%. Độ ẩm đất thích hợp: Giai đoạn đầu sinh trưởng: 60% 65%. Giai đoạn sinh trưởng mạnh: 80%. Giai đoạn già chín của lá: 60%. 2.1.5.2 Yếu tố đất đai Cây thích hợp với đất nhẹ (đất pha cát hoặc đất cát), tơi xốp, thông thoáng tốt, thoát nước dễ. Độ pH tốt nhất cho đất trồng thuốc lá ở thời kỳ đầu là pH = 6, hơi kiềm ở thời kỳ sau là pH từ 7,5 đến 7,9. Lượng phân bón cơ bản là: N: 40 – 80kg/ ha, P: 30 – 90kg/ ha và K: 50 – 110kg/ ha. 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật Cây dại, cây ký chủ, là thành phần gây hại đến sinh trưởng cây thuốc lá. Động vật gây hại (trực tiếp, gián tiếp) cho cây thuốc lá ở nước ta có rất nhiều. Tại miền Bắc Việt Nam, theo kết quả điều tra cho thấy có 40 loài sâu bệnh xuất hiện và gây hại ở các vùng trồng thuốc lá. Trong đó có 9 loại bệnh do virus, 5 do vi khuẩn, 12 loại bệnh nấm và 16 loại sâu. 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng
5 Lợi nhuận đối với người trồng thuốc lá rất cao. Sản phẩm chính của cây thuốc lá là sản xuất ra các loại thuốc hút, nhai, ngửi. Các bộ phận trên cây thuốc lá có tỷ lệ: Lá: 30%, thân: 40%, hạt: 20% và rễ: 10%. Như thế, đối với các nước có nền công nghiệp chưa phát triển, thì việc sử dụng năng suất sinh học còn rất thấp vì ngoài lá ra không tận dụng được các bộ phận còn lại để sản xuất các sản phẩm khác. Thành phần độc hại trong thuốc lá có nhiều, quá trình nhiệt phân, ngưng tụ trong khi đốt, cháy (hút) đã tạo ra một số chất, ảnh hưởng sâu sắc đến hóa tính của lá thuốc. Vì thế, để hạn chế độc hại của thuốc lá đòi hỏi nhà sản xuất thuốc lá phải nỗ lực tìm ra các biện pháp để giảm bớt các thành phần này. Người ta tận dụng các loại phế thải thân, lá thuốc lá để sản xuất ra sunfat nicotin, có tác dụng tốt trong phòng trừ sâu bệnh trên đồng ruộng. Từ thân và lá thuốc lá, giáo sư R. L. Wain (Anh) đã chiết xuất được sclareol và 13 epi sclareol có tác dụng phòng trừ được bệnh rỉ sắt trong cây họ đậu. Sản xuất nước hoa từ hoa thuốc lá, acid nicotinic, acid citric lấy từ cây thuốc lá nhiều hơn từ 2 – 3 lần trong cam chanh để sử dụng vào công nghiệp thực phẩm. Chiết xuất được trong hạt thuốc lá 35% 40% dầu sử dụng trong công nghiệp. Thân cây thuốc lá còn được chế biến thành thức ăn gia súc có giá trị dinh dưỡng cao, thu được 3 – 3,5 tấn/ ha hoặc thu được 12% 15% protein cao cấp trong cây thuốc lá để làm thực phẩm. Ngoài ra, các phế thải của thuốc lá trong quá trình chế biến như vụn, bụi được tận dụng chế biến làm phân hữu cơ khá tốt. Về mặt nghiên cứu, cây thuốc lá được coi là đối tượng thử nghiệm các nghiên cứu sinh học. Nicotiana spp. được dùng làm mô hình nghiên cứu in vitro về sự tái sinh ở thực vật từ năm 1957. Trong những nghiên cứu cổ điển của Skoog và Miller thì Nicotiana tabacum là đối tượng được chú ý sớm nhất. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô, về sinh học phân tử đã đạt được nhiều thành công ở cây thuốc lá. Hy vọng trong tương lai, cây thuốc lá sẽ còn có nhiều công dụng khác để phục vụ cho nhu cầu xã hội.
6 (A) (B) (D) (C) (E) (F) Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. (A): Vườn cây thuốc lá (B): Đặc điểm hình thái (C), (D), (E), (F): Sự đa dạng về chủng loại và màu sắc (http://www.search.com/reference/tobacco/)