Đề tài "“ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HIỆN OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1”

Chia sẻ: Pham Linh Dan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:75

Thêm vào BST

Báo xấu

117
lượt xem 41
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo luận văn - đề án 'đề tài "“ nghiên cứu sản xuất kháng thể thỏ kháng ovalbumin dùng phát hiện ovalbumin trong vacxin cúm a/h5n1”', luận văn - báo cáo phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài "“ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HIỆN OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1”

tài "“ NGHIÊN C U S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HI N OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1”
L I C M ƠN T lòng bi t ơn sâu s c c a mình, em xin dành trang u tiên c a khóa lu n bày t lòng c m ơn chân thành n: Ban Giám hi u trư ng i h c Nha Trang, Phòng ào t o, Ban ch nhi m khoa Ch Bi n cùng toàn th quý th y cô ã gi ng d y t n tình và giúp em trong quá trình h c t p t i trư ng. PGS.TS. Lê Văn Hi p - Vi n trư ng Vi n V c xin và Sinh ph m Y t Nha Trang, ngư i th y ã luôn quan tâm hư ng d n, t o i u ki n thu n l i cho em trong quá trình th c t p t i Vi n. CN. Nguy n Th Minh Hi n - trư ng phòng, TS. Nguy n Th Lan Phương - phó phòng Ki m nh, CN. Tr n Ng c Nhơn, TS. Minh Sĩ ã tr c ti p hư ng d n, ch b o nhi t tình, chu áo và luôn t o m i i u ki n thu n l i nh t giúp em hoàn thành lu n văn này. Qua ây em xin bày t lòng bi t ơn sâu s c n toàn th các cô, các anh ch phòng Ki m nh, phòng Nghiên c u và phát tri n ã nhi t tình giúp , góp ý và ng viên em trong th i gian th c t p t i phòng. Em xin chân thành c m ơn Ban Giám c Vi n V c xin Nha Trang ã t o i u ki n thu n l i cho em th c t p t i Vi n. Xin bày t lòng bi t ơn n gia ình, t t c b n bè, anh ch và các em ã quan tâm, giúp , chia s , ng viên em trong su t th i gian qua. Nha Trang, tháng 11 năm 2007 Sinh viên ào Th Thanh Vân.
CH VI T T T TRONG KHÓA LU N  APS : Amonium persulfat CV : H s bi n thiên D : Dư c i n D VN : Dư c i n Vi t Nam ELISA : Enzyme - linked immuno sorbent assay (Th nghi m mi n d ch g n men) FCA : Tá ch t Freund Complete FIA : Tá ch t Freund Incomplete HA : Haemagglutin IgG : Immuno globulin G IU : International Unit ( ơn v qu c t ) KN : Kháng nguyên KT : Kháng th LOD : Limit of detection (Gi i h n phát hi n) LOQ : Limit of quantification (Gi i h n nh lư ng) NA : Neuraminidase OD : Optical density (M t quang) PBS : Photphat buffer saline (Dung d ch m c a mu i Photphat) SD : Standard Deviation ( l ch chu n) SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulphate – Poly acrylamide gel Electrophoresis ( i n di gel Poly acrylamide có Sodium dodecyl sulphate) Streptavidine – PO : Streptavidine – Peroxydase RIA : Radial immuno assay (Th nghi m mi n d ch phóng x ) RNA : Ribonucleic Acide (Axit Ribonucleic) TMB : 3,3’,5,5’ – TetraMethyl Benzidine TEMED : N,N,N’,N’- TetraMethylethylendiamin WHO : World Health Organization (T ch c Y t th gi i -TCYTTG)
M CL C  TRANG BÌA PH L I C M ƠN DANH M C CH VI T T T M CL C DANH M C CÁC B NG DANH M C CÁC HÌNH L I NÓI U ................................................................................................................ 1 1.1. TÌNH HÌNH B NH CÚM A/H5N1 ............................................................. 4 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U S N XU T VACXIN CÚM A/H5N1 HI N NAY ......................................................................................................... 5 1.3. GI I THI U VACXIN CÚM A/H5N1 S N XU T TRÊN TR NG GÀ CÓ PHÔI ............................................................................................................ 6 1.3.1. Nguyên li u s n xu t .............................................................................. 6 1.3.2. Ch ng s n xu t ....................................................................................... 6 1.3.3. Quy trình s n xu t và ki m nh vacxin cúm A/H5N1 trên tr ng gà có phôi ............................................................................................................. 7 1.3.4. Tiêu chu n ch t lư ng c a vacxin cúm A/H5N1 .................................... 7 1.4. OVALBUMIN .............................................................................................. 8 1.4.1. c tính ................................................................................................. 8 1.4.2. C u t o .................................................................................................. 9 1.4.3. Tính sinh mi n d ch ............................................................................... 9 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HI N OVALBUMIN VÀ KHUY N CÁO V CÁCH PHÁT TRI N VÀ TH M NH PHƯƠNG PHÁP .............. 10 1.5.1. Các phương pháp phát hi n ovalbumin ................................................ 10 1.5.1.1. Phương pháp Ouchterlony (khuy ch tán mi n d ch kép) ................. 11 1.5.1.2. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu ............................................ 11 1.5.1.3. Phương pháp mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay- RIA) ....... 12 1.5.1.4. Phương pháp ELISA – K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzyme (Enzyme – Linked immunosorbent Assay) ......................... 12 1.5.2. Các khuy n cáo v cách phát tri n và th m nh phương pháp ............. 14 1.6 S N XU T KHÁNG TH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CH .......... 15
1.6.1. Tá ch t ................................................................................................. 15 1.6.2. Quy trình gây mi n d ch cơ b n t o kháng th a dòng ........................ 16 1.6.3. Tinh ch kháng th IgG ....................................................................... 17 1.6.3.1. K t t a IgG t huy t thanh ho c d ch sinh v t khác b ng (NH4)2SO4............................................................................................ 18 1.6.3.2. Tinh ch IgG nh s c kí trao i ion .................................................. 18 1.6.3.3. Tinh ch IgG nh c t ái l c protein A- ho c protein G-sepharose 4B ......................................................................................................... 19 1.6.4. Ki m tra n ng và s ch c a huy t thanh sau tinh ch ................... 20 2.1. TH I GIAN VÀ A I M NGHIÊN C U ............................................. 22 2.2. V T LI U .................................................................................................. 22 2.2.1. Sinh ph m............................................................................................. 22 2.2.2. Súc v t thí nghi m ................................................................................ 22 2.2.3. Hoá ch t và dung d ch chu n ................................................................ 22 2.2.4. Thi t b ................................................................................................. 23 2.2.5. D ng c ................................................................................................ 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................ 24 2.3.1. Mi n d ch th thu huy t thanh kháng ovalbumin .................................. 24 2.3.2. Xác nh hi u giá kháng th th kháng ovalbumin b ng phương pháp khuy ch tán mi n d ch kép (Ouchterlony) ...................................................... 26 2.3.2.1. Nguyên t c............................................................................................ 26 2.3.2.2. Ti n hành .............................................................................................. 26 2.3.3. Tinh ch kháng th kháng ovalbumin b ng c t HiTrap protein G HP.... 27 2.3.3.1. Tinh ch ............................................................................................... 27 2.3.3.2. Phương pháp i n di SDS-PAGE ki m tra s ch c a huy t thanh sau tinh ch ................................................................................ 28 2.3.4. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu................................................. 30 2.3.5. Xây d ng phương pháp ELISA nh lư ng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1. ................................................................................................. 31 2.3.5.1. Nguyên lý ............................................................................................. 31 2.3.5.2. Các bư c ti n hành .............................................................................. 31 2.3.6. Th m nh phương pháp ....................................................................... 33 2.3.6.1. Xây d ng ư ng chu n và nh y c a ph n ng............................. 33 2.3.6.2. Xác nh chính xác c a phương pháp ........................................... 33
CHƯƠNG III: K T QU VÀ BÀN LU N.............................................................. 36 3.1. ÁNH GIÁ QUY TRÌNH MI N D CH VÀ S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN ........................................................................... 37 3.2. TINH CH KHÁNG TH TH (IgG) KHÁNG OVALBUMIN ................ 40 3.3. XÂY D NG H ELISA NH LƯ NG OVALBUMIN. ......................... 43 3.3.1. Ch n h m khóa phi n ...................................................................... 43 3.3.2. Xác nh n ng kháng th phù h p cho ph phi n ............................. 44 3.4. TH M NH PHƯƠNG PHÁP ................................................................. 46 3.4.1. Xây d ng ư ng chu n ......................................................................... 46 3.4.2. K t qu xác nh nh y c a ph n ng ................................................ 47 3.4.3. K t qu xác nh chính xác và úng c a phương pháp ............... 49 3.4.4. So sánh v i phương pháp i n di mi n d ch i lưu .............................. 55 3.5. NG D NG H ELISA NH LƯ NG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 ..................................................................... 56 4.1. K T LU N ................................................................................................ 59 4.1.1. S n xu t kháng th th kháng ovabumin ............................................... 59 4.1.2. ã s d ng c t HiTrap protein G HP tinh ch thành công kháng th (IgG) kháng ovalbumin t huy t thanh th thô ............................................... 59 4.1.3. Xây d ng và th m nh ư c h ELISA gián ti p nh lư ng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1 ............................................................ 59 4.2. KI N NGH ................................................................................................ 60 TÀI LI U THAM KH O .............................................................................................. 1 PH L C
DANH M C CÁC B NG  B ng 3.1. K t qu áp ng kháng th c a th sau mũi tiêm th nh t. .................... 37 B ng 3.2. K t qu hi u giá kháng th sau các mũi tiêm ......................................... 38 B ng 3.3. K t qu kháng th sau khi tinh ch ........................................................ 41 B ng 3.4. nh y c a ph n ng (LOD và LOQ) .................................................. 48 B ng 3.5. M t quang n n c a 6 l n th nghi m ................................................ 51 B ng 3.6. l p l i c a ph n ng ........................................................................ 52 B ng 3.7. chính xác và úng c a ph n ng................................................. 54 B ng 3.8. K t qu ELISA nh lư ng các m u ovalbumin .................................... 56
DANH M C CÁC HÌNH  Hình 2.1. Sơ mi n d ch ..................................................................................... 25 Hình 2.2. Sơ l y máu ........................................................................................ 25 Hình 2.3. K thu t ELISA gián ti p nh lư ng kháng nguyên ovalbumin............. 35 Hình 3.1. Tiêu b n nhu m Coomassie phương pháp Ouchterlony phát hi n kháng th kháng ovalbumin ................................................................................... 39 Hình 3.2 th bi u di n các phân o n thu ư c khi tinh ch huy t thanh kháng ovalbumin. .................................................................................................. 40 Hình 3.3. Tiêu b n nhu m Coomassie b n i n di SDS-PAGE (10% SDS) các m u huy t thanh. ................................................................................................... 42 Hình 3.4. th bi u di n s phù h p gi a các m khóa phi n trong ph n ng ELISA nh lư ng ovalbumin. ............................................................................... 43 Hình 3.5. th bi u di n s phù h p gi a các n ng kháng th th kháng ovalbumin trong ph n ng ELISA nh lư ng ovalbumin...................................... 44 Hình 3.6. th ư ng chu n ............................................................................... 46 Hình 3.7. Tiêu b n nhu m Coomassie phương pháp i n di i l ưu nh lư ng ovalbumin ............................................................................................................. 55
-1- L I NÓI U B nh cúm A/H5N1 ư c xem là b nh truy n nhi m c bi t nguy hi m v i s lây lan nhanh và t l t vong r t cao. M i ch xu t hi n t cu i năm 2003 t i m t s nư c châu Á, n nay d ch cúm A/H5N1 ã lan r ng ra nhi u qu c gia trên th gi i v i 229 ngư i nhi m b nh, trong ó 131 ngư i t vong chi m t l 58% [6]. Các trư ng h p nhi m virus cúm ư c phát hi n m c dù ch x y ra do lây nhi m gi a ngư i v i các loài gia c m. Th nhưng, các chuyên gia trên th gi i ã kh ng nh, vi c virus cúm A lây nhi m t ngư i sang ngư i ch còn là v n th i gian. Trư c nguy cơ bùng phát c a i d ch, các nư c, các t ch c trên th gi i ã ph i vào cu c nhanh chóng tìm ra phương th c phòng b nh hi u qu . Vacxin luôn ư c coi là phương th c h u hi u nh t trong vi c phòng ch ng, gi m t l m c b nh và t l ch t do các i d ch gây ra. Công ngh s n xu t vacxin cúm “thông thư ng” ã có t 60 năm trư c các nư c châu Âu và B c M nhưng s lư ng ít và m c giá cao [3] nên không th áp n g cho th gi i khi có i d ch x y ra, c bi t v i các nư c nghèo, nư c ang phát tri n l i càng khó khăn hơn. T ch c Y t th gi i (TCYTTG) ã khuy n cáo các nư c nên t nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 có th ch ng trong công tác phòng ch ng d ch, b o v s c kho c ng ng [3]. Cùng v i vi c t o ra các ch ng s n xu t vacxin cúm A/H5N1 thích h p b ng k thu t di truy n ngư c, các trung tâm nghiên c u b nh cúm qu c t cũng ưa ra nh ng hư ng s n xu t vacxin cúm khác nhau (s n xu t trên tr ng gà có phôi, t bào ng v t…). Trên cơ s ó, tuỳ thu c vào i u ki n c a t ng qu c gia mà l a ch n con ư ng s n xu t cho phù h p nhưng ph i m b o tính an toàn và hi u qu cao. T i Vi t Nam, vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ã nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 cho ngư i b ng phương pháp nuôi c y trên tr ng gà có phôi. Vi n ã s n xu t th 9 lo t vacxin thành công. Trư c khi ưa vào s d ng, vacxin cúm ph i t ư c các tiêu chu n an toàn, mi n d ch c n thi t theo quy nh
-2- c a B Y t Vi t Nam và TCYTTG. M t trong s các tiêu chu n ó là hàm lư ng ovalbumin, protein trong lòng tr ng tr ng, là thành ph n có kh năng gây d ng r t cao. Theo tiêu chu n c a TCYTTG, lư ng ovalbumin trong m i li u vacxin cúm A/H5N1 s n xu t t tr ng gà có phôi không ư c vư t quá 1 µg [10]. Chính vì th , vi c tìm ra m t phương pháp xác nh hàm lư ng ovalbumin v i nh y và chính xác cao là m t i u tiên quy t. Có nhi u phương pháp khác nhau nh lư ng ovalbumin như: ELISA, i n di mi n d ch…Tuy nhiên, các nghiên c u trư c ó cho th y, phương pháp ELISA là phương pháp cho c hi u và chính xác r t cao, có kh năng phát hi n ovalbumin mc nanogam (ng) [10-13]. Các b kít ELISA dùng xác nh hàm lư ng ovalbumin r t t ti n và không phù h p khi ti n hành các ki m nh trong quá trình s n xu t. Chính vì v y, v i i u ki n trang thi t b hi n có, chúng tôi ti n hành nghiên c u tài “ NGHIÊN C U S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HI N OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1” . M c tiêu tài: 1. S n xu t kh ng th th kháng ovalbumin. 2. Tinh ch kháng th (IgG) kháng ovalbumin. 3. ng d ng kháng th kháng ovalbumin tinh ch nh lư ng ovalbumin trong các m u vacxin cúm A/H5N1 b ng phương pháp ELISA và phương pháp i n di mi n d ch i lưu. .
-3- CHƯƠNG 1: T NG QUAN TÀI LI U
-4- 1.1. TÌNH HÌNH B NH CÚM A/H5N1 [3], [6] Cúm gà hay cúm gia c m do virus cúm typ A gây nên. Chúng thư ng gây b nh trên các loài gia c m và có th lây nhi m sang m t s loài ng v t có vú. Cúm gia c m lây lan r t nhanh và khó ki m soát. Chúng thư ng lây nhi m nhanh các loài lông vũ và gây ch t trên di n r ng. Năm 1996, virus cúm A/H5N1 l n u tiên ư c phân l p ng ng t i t nh Giang ông, Trung Qu c. Sau ó ti p t c lan r ng ra nhi u nư c châu Á và m t s nư c châu Âu. T năm 2003, d ch cúm gia c m H5N1 bùng phát m nh t i Thái Lan, Vi t Nam, Hàn Qu c, Nh t B n sau ó lan kh p châu Á. Thái Lan và Vi t Nam là hai qu c gia b nh hư ng n ng n nh t. Không ch gây b nh trên gia c m, virus cúm A/H5N1 còn là m i e d a cho s c kh e con ngư i. Theo th ng kê c a TCYTTG, tính n ngày 04/07/2006 ã có 229 ngư i b nhi m cúm A/H5N1 10 qu c gia trong ó có 131 ngư i t vong chi m t l 58% [6]. Vi t Nam v n là nư c có s ngư i nhi m cúm A/H5N1 r t cao. Tính n tháng 6/2007, t i 32 t nh thành trong c nư c có 98 ngư i b m c b nh, trong ó có 42 ngư i b ch t [3]. T năm 2003 n nay, tình hình lây nhi m virus cúm A/H5N1 di n bi n r t ph c t p. Không ch gây b nh trên gia c m, nó còn gây nhi m sang m t s ng v t khác như h (Thái Lan), mèo (Thái Lan, Indonesia, Iraq, c), l n (Indonesia, Vi t Nam), ch n (bi n Baltic, c). S ngư i nhi m do H5N1 cũng gia tăng không ng ng c v s lư ng l n ph m vi nh hư ng. M c dù các trư ng h p nhi m virus cúm A/H5N1 trên ngư i trong su t nh ng mùa d ch v a qua cho th y, s nhi m virus ch x y ra khi có s ti p xúc khá ch t ch gi a ngư i v i các loài gia c m b nh. Tuy nhiên, vi n c nh xu t hi n nh ng ch ng virus cúm có kh năng lây t ngư i sang ngư i là m t i u có th tiên li u ư c. TCYTTG ã ưa ra c nh báo r ng i d ch cúm ang n g n và nhi u kh năng là do m t bi n ch ng c a virus cúm gia c m H5N1. Vì v y, công tác phòng ch ng d ch ang di n ra nhi u nư c trên th gi i. Hi n nay, gi i pháp ư c nhi u nư c trên th gi i ang th c hi n là s n xu t vacxin phòng cúm cho ngư i.
-5- 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U S N XU T VACXIN CÚM A/H5N1 HI N NAY [1], [3], [6] Trư c nguy cơ i d ch cúm ang n g n, công tác phòng ch ng d ch ang di n ra r t kh n trương nhi u nư c trên th gi i. phòng ch ng i d ch thì vi c s d ng vacxin là phương th c h u hi u nh t b o v c ng ng, làm gi m t l m c b nh và t l ch t. Tình hình th gi i: TCYTTG và t ch c Nông lương th gi i khuy n cáo t t c các nư c, c bi t là các nư c ang phát tri n ph i t nghiên c u và s n xu t vacxin cúm A/H5N1 ch ng ngu n vacxin ph c v cho nhu c u b o v s c kh e c ng ng khi i d ch x y ra. TCYTTG ã ưa ra ba lo i vacxin cúm sau cho các nư c l a ch n s n xu t: Vacxin b t ho t trên tr ng gà có phôi và nuôi c y t bào; vacxin s ng trên tr ng gà có phôi và nuôi c y t bào; vacxin s ng d ng phun mù, hít qua mũi [3]. Hi n nay, trên th gi i m c dù ã có r t nhi u nư c nghiên c u và s n xu t vacxin cúm A/H5N1 nhưng chưa có nư c nào ư c c p gi y phép lưu hành. Nhi u hãng s n xu t vacxin l n như hãng Sanofi Pasteur (M , Pháp), hai hãng Nobilon, Sovay Pharmaceutials c a Hà Lan vv... ang nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 b ng phương pháp nuôi c y trên tr ng gà có phôi ho c nuôi c y trên các dòng t bào (như t bào Vero, MDCK .v.v...). Tình hình Vi t Nam: Vi t Nam là nư c có khí h u nhi t i gió mùa nên r t d cho d ch cúm bùng phát và lây lan ra di n r ng. Ngoài ra, àn gia c m v i s lư ng l n cũng là m t y ut nh hư ng r t l n n vi c bùng n d ch cúm. Trư c nguy cơ i d ch cúm ang n g n, v n cân nh c và l a ch n m t dây chuy n s n xu t vacxin cúm sao cho phù h p v i tình hình th c t t nư c mà v n m b o ch t lư ng ang là m i quan tâm hàng u c a nư c ta hi n nay. V n càng tr nên g p rút hơn khi d ch cúm m i ngày m t ti n g n hơn. Trư c tình hình ó, căn c vào ưu như c
-6- i m c a t ng phương pháp mà hi n nay Vi t Nam ã có nhi u ơn v s n xu t vacxin cúm H5N1 như: Năm 2004, vi n V sinh d ch t Trung ương nghiên c u s n xu t vacxin cúm A/H5N1 dùng cho ngư i b ng phương pháp nuôi c y trên t bào th n kh . Ngày 18/03/2006, vi n Pasteur Tp.HCM ph i h p v i vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang và vi n Công ngh sinh h c Hà N i ã b o v thành công tài c p nhà nư c mang tên “Nghiên c u quy trình s n xu t vacxin cúm A/H5N1 dùng cho ngư i b ng k thu t nuôi c y trên tr ng gà có phôi và trên t bào Vero” ng Khoa h c, B khoa h c công ngh [6]. t iH i Ti p theo ó, năm 2007, Vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ã xây d ng quy trình s n xu t vacxin cúm t tiêu chu n GMP v i s h tr ca TCYTTG, quy mô s n xu t là 1 tri u li u/năm. 1.3. GI I THI U VACXIN CÚM A/H5N1 S N XU T TRÊN TR NG GÀ CÓ PHÔI [3], [4] 1.3.1. Nguyên li u s n xu t Nguyên li u s n xu t vacxin cúm theo phương pháp này là tr ng gà s ch có phôi 10 n 11 ngày tu i. Tr ng ư c cung c p t nh ng cơ s s n xu t tr ng s ch t tiêu chu n trong và ngoài nư c. 1.3.2. Ch ng s n xu t Hi n nay, Vi n V c xin và sinh ph m y t Nha Trang ang s d ng ch ng s n xu t NIBRG-14 (Vi n NIBSC-Anh), ư c tái t h p t hai ch ng virus cúm A/VietNam/1194/2004 (H5N1) và A/PR/8/34 (H1N1), trong ó gen mã hóa H5 và N1 l y t ch ng A/VietNam/1194/2004. Vùng quy t nh tính c trên gen H5 g m 4 axit amin mang tính ki m b c t b , 6 gen còn l i l y t ch ng A/PR/8/34. Ch ng NIBRG-14 có kháng nguyên b m t (H5 và N1) g n gũi v i ch ng virus cúm A/H5N1 ã phân l p ư c Vi t Nam và ư c TCYTTG cho phép s d ng làm vacxin [3].
-7- 1.3.3. Quy trình s n xu t và ki m nh vacxin cúm A/H5N1 trên tr ng gà có phôi Tr ng gà s ch có phôi 10÷11 ngày tu i ư c c y ch ng virus cúm. Sau khi vào trong tr ng, virus cúm s nhân lên v i s lư ng l n. n khi s lư ng, ti n hành ti n hành thu g t d ch ni u nang. D ch ni u nang ư c tinh ch sau ó ư c hoàn nguyên và b t ho t b ng formandehyde. S n ph m ư c em i h p ph tá ch t và pha bán thành ph m. Sau ó, s n ph m ư c óng l t o thành vacxin thành ph m. Song song v i quy trình s n xu t, quy trình ki m nh cũng di n ra theo sơ (ph l c 1). 1.3.4. Tiêu chu n ch t lư ng c a vacxin cúm A/H5N1 [10] M i lô vacxin cúm A/H5N1 trong quá trình s n xu t cũng như khi thành ph m, trư c khi ưa vào s d ng u ph i tr i qua quá trình ki m n h r t ch t ch . Các tiêu chí ki m tra u d a trên các tiêu chu n hi n hành c a B Y t Vi t Nam và các quy nh c a TCYTTG cho vacxin cúm u ng cho ngư i. i v i vacxin cúm s n xu t trên tr ng gà có phôi, có m t ch tiêu ki m tra c trưng mà i v i các vacxin s n xu t trên t bào không có ó là ki m tra hàm lư ng ovalbumin. ây là m t ch tiêu r t quan tr ng trong s hàng lo t các ch tiêu ki m nh vacxin cúm s n xu t trên tr ng gà có phôi. Ovalbumin là protein có trong lòng tr ng tr ng, trong quá trình s n xu t vacxin cúm trên tr ng gà, thành ph n này có th còn t n t i trong vacxin cúm thành ph m. Ovalbumin là ch t gây d ng cho cơ th ngư i và ng v t nên vi c ki m tra hàm lư ng ovalbumin c a các lô vacxin cúm thành ph m là m t yêu c u b t bu c. Theo TCYTTG (WHO/TRS 927/2005) thì hàm lư ng ovalbumin ph i ≤ 1 µ g/1 li u ơn cho ngư i [10], (ph l c 2).
-8- 1.4. OVALBUMIN 1.4.1. c tính [17], [18], [19] Ovalbumin là m t protein chính ư c tìm th y trong lòng tr ng tr ng (chi m 60÷65% protein t ng s ), có tr ng lư ng phân t là 45kDa [17]. Trong i n di ovalbumin có i m ng i n (pHi) t i pH= 4,6 [19]. Hi n nay ã có m t s nghiên c u v ovalbumin trong m t s lĩnh v c khác nhau như: − Nh ng nghiên c u chung v c u trúc và c tính − Nh ng nghiên c u v c u trúc serpin và ch c năng − Proteomic − Nh ng nghiên c u trong lĩnh v c mi n d ch h c Tuy nhiên, ây m i ch là nh ng nghiên c u ban u, ch c năng c a ovalbumin v n chưa ư c bi t n m c dù nó ư c d oán là m t protein có nhi u ti m năng. M t trong nh ng ng d ng c a ovalbumin hi n nay là dùng trong i n di trên gel, nó ư c dùng như m t phân t chu n làm m c ánh d u. Bên c nh ó, ovalbumin cũng ư c dùng trong ch a b nh. Trong trư ng h p b nghi ng ng c kim lo i n ng (ví d như s t) ovalbumin có th ch a tr ư c vì ovalbumin có kh năng b y các ion này trong liên k t sulfuhydrin c a nó. i u này ã ngăn c n s thu hút kim lo i xâm nh p vào trong h tiêu hóa (d dày và ru t) và ngăn c n s nhi m c [17]. Tuy nhiên, trong lĩnh v c mi n d ch h c thì ovalbumin là ch t gây d ng i v i ngư i và ng v t. Do ó, ây là thành ph n b t bu c ph i ki m tra i v i các s n ph m b nghi ng là có ch a ovalbumin như các dư c ph m: thu c, vacxin…, các s n ph m th c ph m có ngu n g c t : tr ng, s a… Ovabumin có th n nh trong th i gian 1 năm khi b o qu n nhi t t 2÷8OC [19].
-9- 1.4.2. C u t o [17], [18], [19] Ovalbumin trong lòng tr ng tr ng ư c c u t o b i 385 amino acid. Nó là m t glycoprotein v i 4 v trí g n glucoza. Là m t protein ti t ra t t bào m c dù nó thi u 1 u nitơ (-N) trong trình t c a nó. C u trúc c a ovalbumin thu c v d ng c u trúc serpin c a protein, m c dù không gi ng ph n l n các serpin khác - ovalbumin không có kh năng c ch b t kì m t enzym th y phân protein nào. i u này ư c làm rõ khi so sánh c u trúc c a nó v i các serpin. 1.4.3. Tính sinh mi n d ch [2], [5], [8] Ovalbumin là m t ch t sinh mi n d ch m nh vì nó có các y u t c a m t ch t sinh mi n d ch. ó là: Tính l : Thông thư ng m t ch t ư c g i là kháng nguyên trư c h t ph i là m t ch t l i v i cơ th vì bình thư ng cơ th không áp ng b o v v i m t ch t c a b n thân. Ovalbumin là m t protein có trong lòng tr ng tr ng, do ó i v i các cơ th ng v t nó là m t protein l (ch t l ). Khi protein này ư c ưa vào cơ th ng v t (gây mi n d ch) nó s kích thích cơ th ng v t s n xu t ra kháng th . l n: Tr ng lư ng phân t Các kháng nguyên thông thư ng có tr ng lư ng phân t trên 6.000 dalton. V i tr ng lư ng phân t 45.000 dalton, ovalbumin i u ki n tr thành m t kháng nguyên m nh. C u trúc ph c t p: B t kì m t ch t sinh mi n d ch nào cũng ph i có c u trúc phân t tương i ph c t p. Các ch t có c u trúc càng ph c t p thì tính sinh mi n d ch càng cao, ovalbumin cũng th a mãn tính ch t này b i vì ovalbumin có b n ch t là protein. C u trúc c a nó ph c t p do nó ư c c u t o t các acid amin s p x p theo các t h p khác nhau.
- 10 - Như v y, v i các c i m trên, ovalbumin là m t kháng nguyên m nh hay nó có tính sinh mi n d ch m nh. Do nó là thành ph n gây d ng i v i cơ th nên m b o an toàn i v i ngư i và ông v t, thì các s n ph m là thu c, vacxin có ngu n g c t tr ng, s a b t bu c ph i ki m tra thành ph n này. 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HI N OVALBUMIN VÀ KHUY N CÁO V CÁCH PHÁT TRI N VÀ TH M NH PHƯƠNG PHÁP [5], [8], [14], [15], [16] 1.5.1. Các phương pháp phát hi n ovalbumin [5], [8], [14] So v i các tiêu chu n các ch t và thành ph n khác thì ki m tra hàm lư ng ovalbumin tương i khó. V i hàm lư ng phát hi n th p ≤ 1 µ g/1 li u ơn cho ngư i, òi h i ph i có m t phương pháp phát hi n phù h p. T b n ch t c a ovalbumin là m t kháng nguyên, không th th y b ng m t thư ng nên ch có th phát hi n ư c khi g n v i kháng th c hi u. Do s liên k t gi a kháng nguyên và kháng th luôn mang tính c hi u cao nên phát hi n s có m t và nh lư ng kháng nguyên hay kháng th cho chính xác cao. Có nhi u phương pháp khác nhau dùng xác nh m i tương tác gi a kháng nguyên và kháng th như: – Ph n ng k t t a (Precipitation test) – Ph n ng ngưng k t (Agglutination test) – Ph n ng k t h p b th – M i n d ch i n d i – K thu t huỳnh quang mi n d ch (Immunofluorescent technique) – Thí nghi m mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay-RIA) – ELISA- K thu t ch t h p ph g n enzyme (Enzyme-Linked immunosorbent Assay). Các k thu t này u d a vào s tương tác gi a kháng nguyên và kháng th xác nh s có m t và nh lư ng kháng nguyên ho c kháng th trong m u nghiên c u. Trong ph m vi tài này, 4 phương pháp sau s ư c miêu t chi ti t hơn.
- 11 - 1.5.1.1. Phương pháp Ouchterlony (khuy ch tán mi n d ch kép) [5] Nguyên lý: K thu t là s ngưng k t c hi u gi a kháng nguyên và kháng th x y ra khi chúng di chuy n trên gel agarose khi cho kháng nguyên và kháng th pha loãng thích h p ( n ng x y ra ph n ng ngưng k t). N u kháng th và kháng nguyên ngưng k t c hi u s cho cung k t t a màu tr ng và ngư c l i, s không có cung k t t a n u kháng nguyên và kháng th không ngưng k t c hi u. Ưu i m : ây là k thu t ơn gi n nh t, d th c hi n, ít t n kém do không ph i s d ng nhi u máy móc, hoá ch t. Như c i m: Th i gian hoàn thành m t th nghi m kéo dài t 3 n 4 ngày; s phát hi n kháng nguyên ho c kháng th ch mang tính nh tính, không nh lư ng chính xác ư c hàm lư ng; hàm lư ng kháng nguyên t i a có th phát hi n ư c r t l n (t 20÷30µg/ml) nên không th xác nh ư c nh ng m u có hàm lư ng kháng nguyên nh hơn. V i nh ng ưu và như c i m như trên, k thu t này ư c ng d ng phát hi n kháng th ho c kháng nguyên trong nghiên c u chu n oán b nh, trong nh ng trư ng h p xu t hi n kháng nguyên l . 1.5.1.2. Phương pháp i n di mi n d ch i lưu [5], [15] Nguyên lý: K thu t này tương t như k thu t khuy ch tán Ouchterlony nhưng thay cho khuy ch tán t nhiên ngư i ta ã dùng m t l c i n di hư ng d n cho kháng nguyên và kháng th g p nhau nhanh hơn trên gel agarose. Trong phương pháp này, kháng th IgG và IgM s di chuy n v phía c c âm, dư i tác d ng c a dòng i n kháng nguyên và kháng th g p nhau trên gel. Ưu i m: Th i gian cho k t qu nhanh ch sau 1 gi . Như c i m: Cũng gi ng phương pháp Ouchterlony, phương pháp này ch mang tính nh tính; t n chi phí nhi u hơn vì ph i s d ng thêm máy móc, hoá ch t.
- 12 - 1.5.1.3. Phương pháp mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay- RIA) [8] Nguyên lý: Phương pháp d a trên s c nh tranh gi a kháng nguyên ánh gi u ng v phóng x v i kháng nguyên không ánh d u ng v phóng x g n vào kháng th c hi u. lô i ch ng l y m t lư ng nh t nh kháng nguyên tinh khi t ánh d u phóng x . Kháng nguyên này cùng lo i v i m u th nghi m. Tr n kháng nguyên ánh d u trên v i lư ng kháng nguyên tương ương kháng th c h i u, r i . R a kháng nguyên ánh d u t do (không g n v i kháng th ). o phóng x c a ph c h kháng nguyên - kháng th (A). lô ki m nghi m, ngoài kháng nguyên ánh d u và kháng th như trên còn tr n thêm kháng nguyên c n th không ánh d u g n vào kháng th . R a kháng nguyên ánh d u t do. o phóng x c a ph c h kháng nguyên - kháng th (B). D a vào t l phóng x o ư c A/B xác nh n ng kháng nguyên trong m u th so v i ư ng cong chu n. Ưu i m: Phương pháp này cho k t qu nhanh và có chính xác cao. Như c i m: Phương pháp này r t t n kém, s d ng ch t phóng x nên không an toàn v i ngư i th c hi n. 1.5.1.4. Phương pháp ELISA – K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzyme (Enzyme – Linked immunosorbent Assay) [5], [7], [8] Enzyme – linked immunosorbent Assay (ELISA) là m t kĩ thu t sinh hoá ư c s d ng chính trong lĩnh v c mi n d ch h c tìm ra m t kháng nguyên ho c m t kháng th trong m u v i chính xác cao. ELISA ư c dùng như m t công c h u hi u chu n oán trong y h c và tìm các tác nhân gây b nh [5]. Vì ELISA có th xác nh ư c lư ng kháng nguyên và kháng th trong m u nên nó là m t công c h u ích xác nh n ng c a kháng th có trong huy t thanh [7]. Nó còn ư c dùng tìm kháng nguyên [8]. Trong công nghi p th c ph m, ELISA ư c ng d ng tìm các ch t gây d ng có trong m t s lo i th c ph m như: s a, l c, qu óc chó, qu h nh và tr ng.