zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Báo cáo khoa học

Đề tài : XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ NƯỚC NHIỄM KHUẨN

Chia sẻ: Sunshine_2 Sunshine_2 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Báo xấu

88
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh dịch hạch là một loại bệnh truyền nhiễm cấp tính. Vi khuẩn d ch hạch có thể chọn làm tác nhân khủng bố sinh học. Chẩn đoán nhanh vi khuẩn này từ đất nước là cần thiết. Vi khuẩn dịch hạch chứa 3 loại Plasmid đặc hiệu tạo nên các yếu tố độc lực gây bệnh. Mục tiêu: (1) Xác định độ nhạy và chính xác của phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn dịch hạch. (2) Thực hiện phản ứng PCR với nguồn khuôn là ADN tổng số, ADN của plasmid pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha loãng khác...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài : XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ NƯỚC NHIỄM KHUẨN

TCNCYH 38 (5) - 2005 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ NƯỚC NHIỄM KHUẨN Lê Thanh Hoà1, Nguyễn Thị Bích Nga1, Nguyễn Thị Ngọc Dao1, Đỗ Ngọc Khuê 2 1 Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) 2 Phân Viện Công nghệ mới và Bảo vệ Môi trường (Trung tâm KHKT - CNQS), Bộ Quốc Phòng Bệnh dịch hạch là một loại bệnh truyền nhiễm cấp tính. Vi khuẩn dịch hạch có thể chọn làm tác nhân khủng bố sinh học. Chẩn đoán nhanh vi khuẩn này từ đất nước là cần thiết. Vi khuẩn dịch hạch chứa 3 loại Plasmid đặc hiệu tạo nên các yếu tố độc lực gây bệnh. Mục tiêu: (1) Xác định độ nhạy và chính xác của phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn dịch hạch. (2) Thực hiện phản ứng PCR với nguồn khuôn là ADN tổng số, ADN của plasmid pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha loãng khác nhau (3) Giả nghiệm vi khuẩn trong mẫu đất - nước và thực hiện chẩn đoán nhanh bằng PCR. Đối tượng và phương pháp: Vi khuẩn dịch hạch đã vô hoạt. ADN tổng số bao gồm ADN của vi khuẩn dịch hạch được tách bằng DNeasy Kit, dùng cặp mồi PLAF - PLAR (bám trên gen pla) để nhân đoạn gen pla có độ dài 480bp. Sau khi xác định độ nhạy của phản ứng PCR, để thực hiện mục tiêu xây dựng Kit chẩn đoán nhanh Y. Pestis, vi khuẩn được hoà trong mẫu đất và nước theo phương pháp giả nghiệm để kiểm nghiệm phản ứng PCR nhằm xây dựng kit phát hiện phân tử. Kết quả: Với ADN tổng số pha loãng, phản ứng PCR thực hiện thành công ở hàm lượng 0,6ng, tương đương với 1 vi khuẩn Y. Pestis. Với vi khuẩn nguyên vẹn (không cần tách ADN tổng số), với lượng vi khuẩn pha loãng ở nồng độ từ 101 đến 102 (khoảng 100 - 10 vi khuẩn) vẫn cho PCR đặc hiệu. Với phương pháp giả nghiệm hoà vi khuẩn vào trong mẫu đất, nước, PCR đặc hiệu vẫn thực hiện thành công ở độ pha loãng khoảng 1 ng ADN và 4 vi khuẩn làm khuôn. Kết luận: Như vậy, bước đầu Kit chẩn đoán phân tử vi khuẩn dịch hạch đã thử nghiệm thành công từ các loại mẫu, kể cả từ đất, nước sử dụng chỉ thị gen pla của Plasmid pPCP1. Từ khoá: dịch hạch, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, giả nghiệm. I. ĐẶT VẤN ĐỀ coi là tin tưởng nhất [2,7]. Y. pestis phân lập ở Việt Nam đã được chính thức giám định, sử dụng Vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) gây bệnh gen pla, giải trình và phân tích trình tự của gen nguy hiểm cho người và động vật, phân bố khắp này và đăng ký Ngân hàng Gen số AY305870 [2]. thế giới kể cả Việt Nam. Vùng Tây Nguyên và Plasmid độc lực pPCP1 của vi khuẩn dịch hạch Việt Duyên Hải miền Trung Việt Nam, cho đến nay, vẫn Nam có mức độ bảo tồn tuyệt đối về thành phần có nhiều trường hợp bị dịch hạch, do vậy, loại vi nucleotit của hệ gen, ít nhất là qua so sánh 480 khuẩn nguy hiểm này vẫn là mối đe doạ sức khoẻ nucleotit của phân đoạn gen pla, với các chủng cộng đồng [3,4]. Dịch hạch do bọ chét và loài gặm KIM5; CO92 [8,9] và một số chủng của Ấn Độ, thể nhấm làm môi giới truyền lây gây bệnh, và tồn tại hiện tính gây bệnh thống nhất toàn cầu của loài vi lưu cữu trong đất và nước, tạo nên nguồn lây sang khuẩn này [2]. Mục tiêu: người. Có 3 loại plasmid mà vi khuẩn này sở hữu 1. Xác định độ nhạy và chính xác của bao gồm, plasmid CD1 (chung với Y. phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn dịch hạch. pseudotuberculosis và Y. enterocolitica); plasmid MT1 và pPCP1 (là 2 loại riêng của Y. Pestis) [1]. 2. Thực hiện phản ứng PCR với nguồn Chẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch không có gì khuôn là ADN tổng số, ADN của plasmid khác là dựa vào phản ứng PCR, sử dụng các gen pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha độc lực của các loại plasmid này làm chỉ thị di loãng khác nhau. truyền phân tử, trong đó gen pla của pPCP1 được 1
TCNCYH 38 (5) - 2005 3. Giả nghiệm vi khuẩn trong mẫu đất - trong 10 phút. Với mồi xuôi là PLAF nước và thực hiện chẩn đoán nhanh bằng (5'ATCTTACTTTCCGTGAGAAG3') và mồi ngược là PCR. PLAR (5’ CTTGGATGTTGAGCTTCCTA 3'), phản ứng PCR cho sản phẩm là đoạn ADN có độ dài 480bp II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU M 1 2 3 Vi khuẩn dịch hạch Việt Nam Vi khuẩn dịch hạch Việt Nam ở dạng môi trường nuôi cấy và đã bị vô hoạt qua nhiệt ở 1000C, do Bộ môn Vi sinh vật, Trường Đại học Y 2.3kb 2.0bp Hà Nội cung cấp. Môi trường vi khuẩn vô hoạt này được bảo quản ở –200C, cho đến khi sử dụng. 0.56kb 480bp Tách chiết ADN tổng số và ADN của plasmid pPCP1 ADN tổng số, là toàn bộ ADN có mặt trong tế bào vi khuẩn bao gồm của vi khuẩn và của plasmid, được tách chiết bằng bộ hoá chất là DNeasy kit của Hãng Qiagen. Lấy 200µl môi nằm trong cấu trúc của gen pla [6]. Sản phẩm PCR trường vi khuẩn đã vô hoạt, ly tâm thu cặn tế bào. của Y. pestis Việt Nam được dòng hoá vào plasmid Dung giải, tinh sạch và ly chiết ADN bằng các dung vectơ có tên gọi là pCR2.1 (Invitrogen Inc.), sau dịch của bộ kit theo hướng dẫn, cuối cùng thu ADN khi tinh sạch bằng bộ hoá chất QiaQuick tổng số và bảo quản ở –200C, cho đến khi sử Purification Kit (Qiagen Inc.). Plasmid tái tổ hợp dụng. ADN của plasmid pPCP1, được thu nhận được chọn lọc theo qui trình (xem [10]). ADN của bằng một phương pháp khác, là sử dụng bộ hoá plasmid tái tổ hợp được tách chiết bằng Kit của chất QiaPrep Spin Mini Kit của Hãng Qiagen. Về Qiagen (QiaPrep Spin Mini Kit). Độ dài của đoạn nguyên tắc, hàm lượng ADN thu được chỉ chứa gen pla có trong plasmid tái tổ hợp được kiểm tra ADN của plasmid pPCP1; và như vậy sẽ làm khuôn trên thạch 0,8%, sau khi xử lý bằng enzym giới chắc chắn cho phản ứng nhân đoạn gen pla trong hạn EcoRI. hệ gen của plasmid này. ADN thu được bằng các Bố trí thí nghiệm: phương pháp trên được kiểm tra trên thạch Khảo sát độ nhạy của PCR với độ pha loãng agarose 0,8%, tính toán hàm lượng cần thiết cho cao nhất có thể thực hiện được: ADN tổng số sau phản ứng PCR, và bảo quản ở –200C cho đến khi khi tách chiết và kiểm tra hàm lượng, được pha ở sử dụng. nồng độ gốc 100ng/µl. Từ nồng độ này, ADN tổng Một cách khác cung cấp khuôn cho phản ứng số được pha loãng theo cơ số 2, gấp đôi liên tục, PCR là sử dụng nguyên vẹn vi khuẩn, do trong quá tức là: 100ng/µl; 50ng/µl; 25ng/µl; 12,5ng/µl; trình phản ứng tế bào bị bung ra giải phóng ADN 6,25ng/µl; 3,125ng/µl.... Với các độ pha loãng (kể cả ADN của plasmid) làm khuôn thực hiện khác nhau như thế này, 1µl của mỗi một nồng độ phản ứng [2]. Để thực hiện chẩn đoán nhanh, được sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi PLAF chúng tôi hoà loãng vi khuẩn trong các mẫu đất và - PLAR, thực hiện theo qui trình ở mục 3. nước trước đó đã kiểm tra không có vi khuẩn dịch Giả nghiệm pha loãng vi khuẩn vô hoạt trong hạch bằng phương pháp nuôi cấy và PCR, giả mẫu đất - nước và thực hiện phản ứng PCR: Vi nghiệm như là mẫu thu được từ hiện trường. Sau khuẩn được pha ở nồng độ gốc 1000 vi khuẩn/µl đó, mẫu giả nghiệm được sử dụng tách chiết ADN trong mẫu hỗn hợp đất-nước lấy từ tự nhiên, sau tổng số và thực hiện phản ứng PCR. đó được pha loãng liên tục theo cơ số 2. Với các Thực hiện phản ứng PCR: độ pha loãng khác nhau như thế này, 1 µl của mỗi Phản ứng PCR được thực hiện 1 chu kỳ trong 5 một nồng độ được sử dụng cho phản ứng PCR với phút ở 950C; 35 chu kỳ (950C: 1 phút; 510C: 1 cặp mồi PLAF - PLAR, thực hiện theo qui trình mô phút; 720C: 2 phút) và 1 chu kỳ cuối cùng ở 720C tả ở trên. 2
TCNCYH 38 (5) - 2005 III. KẾT QUẢ vi khuẩn; số 3: Từ vi khuẩn nguyên tế bào (không tách chiết ADN). Kết quả khảo nghiệm độ nhạy phản ứng PCR Độ nhạy của phản ứng PCR với độ pha loãng với các nguồn ADN làm khuôn khác nhau. cao nhất, đã được thực hiện thành công, với độ Từ 3 loại khuôn là ADN tổng số đã được tách pha loãng cao nhất của các loại khuôn, sau khi chiết, ADN của plasmid pPCP1 và vi khuẩn nguyên tính toán, như sau: vẹn tế bào, với cặp mồi đặc hiệu PLAF - PLAR, - Với khuôn là ADN tổng số: Phản ứng thực phản ứng PCR thực hiện thành công, nhân một hiện được ở nồng độ là 0,6ng, tương đương với 1 đoạn gen pla của plasmid pPCP1 có độ dài 480 bp vi khuẩn Y. Pestis. (hình 1). Sau khi dòng hoá và giải trình trình tự thu nhận chuỗi nucleotit, chuỗi này được đưa vào - Với khuôn là ADN của plasmid pPCP1: Phản truy cập Ngân hàng Gen, sử dụng chương trình ứng thực hiện được ở nồng độ là 0,2ng; BLAST ở địa chỉ: - Với khuôn là vi khuẩn nguyên vẹn (không cần (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) kết quả truy tách ADN tổng số): Phản ứng thực hiện được ở cập giới thiệu ở hình 2. nồng độ với lượng vi khuẩn là khoảng 5 - 10 vi Hình 1. Kết quả phản ứng PCR thu nhận sản khuẩn. phẩm đoạn gen pla từ vi khuẩn dịch hạch - Tiến hành pha loãng các loại khuôn và thực phân lập ở Việt Nam hiện phản ứng PCR và nhận thấy, PCR đặc hiệu Ghi chú: M: Chỉ thị ADN, ở đây dùng ADN của vẫn thực hiện thành công ở độ pha loảng rất cao, thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym giới hạn tương đương với hàm lượng khuôn ADN tổng số là HindIII. Sản phẩm PCR có độ dài 480 bp, sử dụng 0,1ng - 0,6ng/phản ứng. cặp mồi PLAF - PLAR, với các cách xử lý ADN làm khuôn khác nhau: số 1: Từ ADN tổng số của vi khuẩn; số 2: Từ ADN plasmid pPCP1 tách chiết từ Số đăng ký Ngân hàng Gen Tên loài có kết quả tương đồng Hệ số Giá trị 3
TCNCYH 38 (5) - 2005 gi|48629|emb|X15136.1|YPPLA Y.pestis plasmid pKYP1 pla gene... 952 0.0 gi|5763810|emb|AL109969.1|YPPCP1 Yersinia pestis plasmid pPCP1 952 0.0 gi|2996216|gb|AF053945.1|AF053945 Yersinia pestis plasmid p... 952 0.0 gi|155524|gb|M27820.1|YEPTPA Yersinia pestis plasminogen ac... 936 0.0 gi|23194196|gb|AF528089.1| Yersinia pestis isolate assc Pla... 872 0.0 gi|23194194|gb|AF528088.1| Yersinia pestis isolate pusc Pla... 872 0.0 gi|23194192|gb|AF528087.1| Yersinia pestis isolate suau Pla... 872 0.0 gi|23194190|gb|AF528086.1| Yersinia pestis isolate sull Pla... 872 0.0 gi|23194188|gb|AF528085.1| Yersinia pestis isolate nabc Pla... 872 0.0 gi|23194186|gb|AF528084.1| Yersinia pestis isolate nasp Pla... 872 0.0 gi|23194184|gb|AF528083.1| Yersinia pestis isolate ansp Pla... 872 0.0 gi|23194182|gb|AF528082.1| Yersinia pestis isolate anbc Pla... 872 0.0 Hình 2. Kết quả truy cập Ngân hàng Gen sử dụng chuỗi nucleotit của gen pla thu nhận từ vi khuẩn dịch hạch Việt Nam đã được xác định với hệ số đồng nhất 100% với gen pla của plasmid pPCP1 của vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) thế giới. Ghi chú: Phần mềm sử dụng là chương trình BLAST của NCBI (Dãy số và ký tự bên trái là số đăng ký; ở giữa là tên loài; hai dãy cuối cho biết mức độ chính xác của kết quả phân tích sinh - tin học trong chương trình BLAST. Kết quả phản ứng PCR với nguồn khuôn là vi khuẩn dịch hạch giả nghiệm pha loãng trong mẫu đất - nước. M 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Hình 3. Kết quả phản ứng PCR thu nhận sản phẩm đoạn gen pla từ khuôn là ADN tổng số đã pha loãng Ghi chú: M: Chỉ thị ADN, ở đây dùng ADN của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym giới hạn HindIII. Sản phẩm PCR có độ dài 480bp, sử dụng cặp mồi PLAF - PLAR. Đường chạy 1 - 9: sản phẩm PCR, 4
TCNCYH 38 (5) - 2005 với khuôn pha loảng gấp đôi từ số 1 (1000 vi khoảng 4 vi khuẩn làm khuôn, phản ứng PCR chẩn khuẩn); đến đường số 9 (khoảng 4 vi khuẩn) vẫn đoán sự có mặt của chúng vẫn cho kết quả dương có sản phẩm PCR dương tính (mũi tên chỉ dẫn) tính. Với kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng PCR đã Chúng tôi cho rằng, việc chẩn đoán một loại vi đạt được, chúng tôi thấy có thể xây dựng phương sinh vật gây bệnh có sở hữu plasmid độc lực như pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch có vi khuẩn dịch hạch với pPCP1, phương pháp tốt nguồn lây trong thiên nhiên. Vì an toàn sinh học, nhất và chính xác nhất vẫn là phát hiện gen “độc mẫu vi khuẩn nghiên cứu chúng tôi đang có đã bị lực” của chúng nằm trên loại plasmid đó. Phương vô hoạt, hơn nữa không thể phân lập trong tự pháp của chúng tôi phù hợp với định hướng chẩn nhiên và duy trì loại vi khuẩn này ở phòng thí đoán trực tiếp bằng PCR trên các gen “độc lực” nghiệm của chúng tôi, do vậy, chúng tôi đề xuất của các plasmid cộng sinh ở vi khuẩn gây bệnh, đã xây dựng chẩn đoán nhanh bằng phương pháp giả được thực hiện trong những năm gần đây trên thế nghiệm. Thực chất của phương pháp này là pha vi giới [5,11]. khuẩn dịch hạch vô hoạt vào trong hỗn hợp đất - V. KẾT LUẬN nước lấy từ thiên nhiên, với nồng độ gốc có số lượng ban đầu là 1000 vi khuẩn/µl; sau đó pha Với nguồn làm khuôn là ADN hỗn hợp (ADN loãng tiếp theo cơ số 2 liên tục: 1) 1000 vi tổng số); ADN của plasmid tách riêng hay nguyên khuẩn/µl; 2) 500 vi khuẩn/µl; 3) 250 vi khuẩn/µl; vẹn tế bào vi khuẩn không cần tách chiết, phản 4) 125 vi khuẩn/µl; 5) 62,5 vi khuẩn/µl; 6) 31,25 vi ứng PCR vẫn cho kết quả hết sức đặc hiệu, tạo cơ khuẩn/µl; 7) 15,625 vi khuẩn/µl; 8) 7,8125 vi sở xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh và khuẩn/µl; 9) 3,90625 vi khuẩn/µl; 10) 1,953125 vi chính xác. khuẩn/µl. Phản ứng PCR đặc hiệu, cho phép thu nhận Với khuôn là 1µl ở mỗi nồng độ pha loãng, được đoạn gen pla có độ dài 480 cặp nucleotit có chúng tôi tiến hành phản ứng PCR đặc hiệu trên nguồn gốc từ plasmid pPCP1 của vi khuẩn dịch gen pla, với cặp mồi PLAF - PLAR. Hình ảnh sản hạch phân lập tại Việt Nam. phẩm PCR thực hiện thành công ở các nồng độ Giả nghiệm hỗn hợp vi khuẩn với đất - nước, pha loãng được trình bày ở hình 3. Sản phẩm của phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính ở độ phản ứng PCR nhìn thấy rất rõ ở các đường chạy pha loãng cao, chứa số lượng vi khuẩn khoảng 4 vi số 1 - 7; và vẫn phát hiện được ở đường chạy số khuẩn làm khuôn trong 1 phản ứng. 9, với nồng độ pha loãng 9 lần theo cơ số 2 từ Từ kết quả giả nghiệm chúng tôi khẳng định 1000 vi khuẩn ban đầu; tương đương với 4 vi phương pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch khuẩn làm khuôn (đường chạy số 9, hình 3). từ đất - nước và môi trường nhiễm khuẩn thực IV. BÀN LUẬN hiện nhanh, chính xác, phát hiện trực tiếp vi khuẩn ở số lượng rất thấp (4 - 10 vi khuẩn) mà không Do thành phần cặp mồi PLAF - PLAR được thiết cần thiết nuôi cấy và tách chiết ADN. kế dựa trên chuỗi gen pla, gen đặc hiệu riêng của plasmid pPCP1, mà plasmid này lại thuộc sở hữu TÀI LIỆU THAM KHẢO duy nhất của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis, 1. Đào Xuân Vinh (1989). Đặc điểm sinh cho nên tính đặc hiệu của cặp mồi này là rất cao. học của các chủng vi khuẩn dịch hạch phân lập ở Điều này được chứng minh bằng kết quả của Tây Nguyên, Luận án PTS. Y học, Trường Đại học chúng tôi là phản ứng PCR với cặp mồi PLAF - Y Hà Nội. PLAR là hết sức đặc hiệu và rất nhạy, được thực 2. Đào Xuân Vinh, Chu M.C. và cs. (2002). hiện thành công ngay cả khi với lượng ADN (các "Bước đầu nghiên cứu DNA của một số chủng Y. loại) có hàm lượng rất thấp, 0,1 - 0,6ng hay pestis phân lập tại Tây Nguyên bằng enzym cắt khoảng 1 - 10 vi khuẩn nguyên vẹn làm khuôn. đoạn (Restriction)". Tạp chí Y học thực hành, số Mặc dù được pha loãng vào trong đất và nước 10 (432 + 433), tr. 29 - 31. và thực hiện phản ứng PCR, trong môi trường đất 3. Lê Thanh Hoà (2003a). “Các loại plasmid - nước giả nghiệm có vi khuẩn dịch hạch như thế của vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) và ứng này, ở nồng độ pha loãng với số lượng chỉ cần 5
TCNCYH 38 (5) - 2005 dụng chẩn đoán phân tử tại Việt Nam”, tr 69 - 78. plasmids of Yersinia pestis. J. Bacteriol. 180 (19): Sách: "Từ khoa học sinh học phân tử đến cuộc 5192 - 5202. sống và chăm sóc sức khoẻ". Báo cáo khoa học 8. Parkhill, J., Wren, B. W., Thompson, Hội nghị Sinh học phân tử và Hoá sinh toàn quốc. N.R. và cộng sự. (2001). Genome sequence of Hà Nội, 22 - 24/10/2003. Nhà xuất bản Nông Yersinia pestis, the causative agent of plague. nghiệp, Hà Nội, Việt Nam, 384 trang. Nature 413, 523 - 527. 4. Lê Thanh Hoà (2003b). Giám định phân 9. Perry, R. D., Straley, S. C., Fetherston, tử vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Yersinia pestis J. D., Rose, D. J., Gregor, J. and Blattner, F. (Lehmann and Neumann 1896) phân lập tại Việt R. (1998). DNA sequencing and analysis of the Nam sử dụng gen pla của plasmid pPCP1. Tạp chí low - Ca2 + - response plasmid pCD1 of Yersinia Y học Việt Nam, 283(4): 1 - 11. pestis KIM5. Infect Immun. 66 (10): 4611 - 4623. 5. Chu, M.C. (2000). Laboratory Manual of 10. Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Plague Diagnostic Test CDC, 3rd edition, WHO, pp. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3rd ed.) 67 - 89. Cold Springs Harbor Press, Cold Springs Harbor 6. Engelthaler, D. M., Hinnebusch, B. J., N.Y Rittner, C. M., Gage, K. L. (2000). Quantitative 11. Tsukano, H., Itoh, K., Suzuki, S., competitive PCR as a technique for exploring Flea - Watanabe, H. (1996). Detection and Yersina pestis dynamics. Am J Trop Med Hyg. identification of Yersinia pestis by polymerase 62(5): 552 - 560. chain reaction (PCR) using multiplex primers. 7. Hu, P., Elliott, J., McCready, P., Microbiol. Immunol. 40(10): 773 - 775. Skowronski, E., Garnes, J., Kobayashi, A. Brubaker, R.R, and Garcia, E. (1998). Structural organization of virulence - associated Summary MOLECULAR APPROACH FOR RAPID DIAGNOSTIC KIT TO DETECT YERSINIA PESTIS FROM INFECTED SOIL - WATER SAMPLE Yersinia pestis is the cause for the acute infection and may be chosen for biological terrorism. Rapid diagnosis of this agent from infected soil - water is essential. Y. pestis habours 3 specific plasmids providing virulent factors to the bacterium. Objectives: (1) Testing the sensitivity and accurateness of PCR for Y. pestis. (2) Carrying out PCR using total genomic DNA serially diluted as a template. (3) Undertaking PCR on artificical experimentation by diluting Y. pestis in soil water as samples to test PCR – based fast diagnostic approach. Methods: Yersinia pestis (inactivated) was used. Genomic DNA was extracted by DNeasy kit (Qiagen Inc). Using primer - pairs PLAF - PLAR (binding on pla gene of plasmid pPCP1) a specific product of PCR was 480 bp. After determination of the PCR sensitivity, a molecular - based diagnostic kit was developed. Sensitivity and specificity of this kit was tested by PCR using diluted genomic DNA and bacterium itself; and mix of these templates in water and soil as samples. Results: With the diluted genomic DNA, it was successful to obtain specific PCR with 0,6ng template, which is equal to a single bacterium. Additionally, successful PCR amplification was obtained using the whole bacterium (without extraction of genomic DNA) and diluted quantity ranging from 101 to 102. Based on these results, the bacterium was artificially diluted with sample of soil - water as a natural isolate for PCR amplification. As a result, specific PCR product was obtained by 1 ng genomic and 4 bacteria per template. Conclusions: Evidently, approach for PCR - based diagnostic kit was successfully carried out from any template including soil - water samples with high fidelity, using the pla gene genetic marker of pPCP1 of Y. pestis. Keywords: plague, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, artificial experimentation. 6

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học

320 tài liệu

1246 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.