298
107. ĐỊNH LƢỢNG LEPTIN
Leptin là một hocmon có trọng lượng phân tử 16 kDa gồm 167 axit amin, đóng
vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh năng lượng ăn vào và năng lượng tiêu thụ,
bao gồm cả sự thèm ăn/đói và quá trình trao đổi chất. Nó là một trong những hocmon
có nguồn gốc từ mỡ quan trọng nhất. Gen Ob(Lep) trong đó Ob là obese, và Lep là
leptin nằm trên nhiễm sắc thể số 7 của người. Leptin tác động lên các thụ thể trong
vùng dưới đồi của não để ức chế sự thèm ăn. Sự vắng mặt của leptin (hoặc thụ thể của
nó) dẫn đến không kiểm soát được lượng thức ăn và dẫn đến béo phì.
I. NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELIS để định lượng leptin trong huyết thanh và huyết tương
người.
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể theo phương pháp sandwich:
các giếng được phủ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho leptin. Mẫu người bệnh có
chứa leptin sẽ được ủ trong các giếng cùng với antiserum (kháng thể liên hợp biotin
đơn dòng). Một phức hợp sandwich hình thành. Sau khi ủ và rửa đi những phần
không kết hợp, enzym liên hợp được thêm vào, tiếp là cơ chất và cuối cùng là thêm
dung dịch ngừng phản ứng. Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ leptin trong mẫu,
được đo ở bước sóng 450 nm.
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Máy phân tích ELIS (có thể Evolis Twin Plus)
- Thuốc thử được cung cấp của hãng DRG, Đức (EI -2395)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng) + Enzym liên hợp
+ Chuẩn: 6 lọ (dạng đông khô) + Cơ chất
+ Control cao và thấp (dạng đông khô) + Dung dịch rửa
+ Dung dịch đệm + Dung dịch ngừng phản ứng
+ Antiserum
- Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác + Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần + Nước cất
299
3. Ngƣời bệnh
Người bệnh không cần nhịn đói hay đòi hỏi yêu cầu gì đặc biệt
4. Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi thông tin đầy
đủ của người bệnh.
III. Các bƣớc tiến hành
1. Lấy bệnh phẩm
- Sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương
+ Huyết thanh: Thu thập máu, để co cục máu hoàn toàn, ly tâm ở nhiệt độ phòng.
Những người bệnh dùng thuốc chống đông cần để thời gian co cục máu lâu hơn.
+ Huyết tương: Ly tâm ngay sau khi thu thập máu vào ống có chất chống đông.
- Bảo quản: Mẫu nên được tách tube và bảo quản ở 2 - 8o C trong 24 giờ, lâu hơn ở
- 20o C, mẫu sau khi rã đông nên được lắc đều trước khi dùng.
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
2.1.1. Dung dịch rửa:
Hòa 30 ml dung dịch rửa với 1170 ml nước cất để được dung dịch 1200 ml.
Sau khi pha, ổn định 2 tuần ở nhiệt độ phòng.
2.1.2. Chuẩn:
- Nồng độ chuẩn từ S0 - S5 lần lượt là: 0 ng/mL; 2 ng/mL; 5 ng/mL; 25 ng/mL; 50
ng/mL; 100 ng/mL
- Cho 0,5 ml nước cất vào lọ chuẩn (dạng đông khô), để tối thiểu 10 phút, lắc đều
trước khi sử dụng.
- Ổn định ít nhất 6 tuần khi bảo quản ở 2 - 8o C, lâu hơn ở - 20o C
2.1.3. Control: Lot: 2395
- Control mức thấp : 1,62 - 4,28 ng/mL và Control mức cao: 51,52 - 76,20 ng/mL
- Cho 0,5 ml nước cất vào lọ Control (dạng đông khô), để tối thiểu 10 phút, lắc đều
trước khi sử dụng.
- Ổn định ít nhất 6 tuần khi bảo quản ở 2 - 8o C, lâu hơn ở - 20o C
2.2. Tiến hành
300
- Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
- Tổng thời gian hoàn thành xét nghiệm này khoảng 210 phút.
- Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu.
Các bước tiến hành như sau:
+ Hút 15 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
+ Hút 100 μl dung dịch đệm tiếp vào các giếng. Trộn đều trong 10 giây.
+ Ủ 120 phút trong nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl ntiserum vào mỗi giếng
+ Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
+ Hút 100 μl enzym liên hợp vào mỗi giếng
+ Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl cơ chất vào mỗi giếng.
+ Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng
+ Tiến hành đo trong vòng 10 phút
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Giá trị tham khảo:
Nam: 2,05 - 5,63 ng/mL Nữ: 3,63 - 11,09 ng/mL
- Ý nghĩa lâm sàng:
+ Mức độ leptin giảm sau khi nhịn ăn ngắn hạn (24 -72 giờ), béo phì, mất ngủ, tập
thể dục…
+ Mức độ leptin tăng khi bị căng thẳng cảm xúc…
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
- Lấy sai ống lấy lại
- Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
- Không dùng mẫu có chứa Natri azide
301
- Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu
hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút).
- Mẫu có kết quả vượt quá 100 ng/mL thì phải hòa loãng mẫu với dung dịch S0.
- Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
- Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.