Luận án Tiến sĩ Y học: Khảo sát các đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẶNG HUỲNH ANH THƯ

KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN

UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ BẰNG

PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2023

Năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CAM ĐOAN

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Tôi Nguyễn Thị Lan Anh, nghiên cứu sinh Học viện Quân Y, chuyên ĐẶNG HUỲNH ANH THƯ

ngành Nội hô hấp, xin cam đoan:

1. Đây luận án do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của

GS.TS Đồng Khắc Hưng và GS.TS Mai Trọng Khoa.

KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN

2. Công trình nghiên cứu này không trùng lặp với bất nghiên cứu nào

khác đã được công bố tại Việt Nam. UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ BẰNG

3. Tôi xin cam đoan các số liệu được sử dụng trong luận án này là trung

PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI

thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi

NGÀNH: HÓA SINH Y HỌC

nghiên cứu.

MÃ SỐ: 62720112

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 28 tháng 3 năm 2017

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Tác giả luận án LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Nguyễn Thị Lan Anh

2. TS. NGUYỄN HOÀI NGHĨA

1. PGS.TS.BS. LÊ XUÂN TRƯỜNG

TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2023

MỤC LỤC

Trang

Danh mục chữ viết tắt i

Danh mục đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt ii

Danh mục các bảng iii

Danh mục các hình iv

Danh mục các biểu đồ, sơ đồ v

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4

1.1. Tổng quan về ung thư phổi không tế bào nhỏ ................................... 4

1.2. Vai trò của đột biến gen trong ung thư phổi không tế bào nhỏ ....... 11

1.3. Các phương pháp xác định đột biến gen ............................................. 19

1.4. Một số nghiên cứu về đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế

bào nhỏ ............................................................................................. 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 36

2.1. Thiết kế nghiên cứu ......................................................................... 36

2.2. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 36

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................... 36

2.4. Cỡ mẫu nghiên cứu ......................................................................... 36

2.5. Xác định các biến số nghiên cứu ..................................................... 38

2.6. Phương pháp, công cụ đo lường, thu thập số liệu ........................... 39

2.7. Quy trình nghiên cứu ...................................................................... 59

2.8. Phương pháp phân tích dữ liệu ........................................................ 61

2.9. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................... 61

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................... 63

3.1. Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN 64

3.2. Xác định tỉ lệ các đột biến gen (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS,

NRAS) bằng phương pháp NGS mô u và mối liên quan giữa các đột

biến gen với một số đặc điểm lâm sàng cảu bệnh nhân ................... 66

3.3. So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến gen EGFR giữa

NGS mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2 ..................................... 76

3.4. So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa NGS

sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2 ........... 79

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................. 84

4.1. Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân UTPKTBN 84

4.2. Xác định tỉ lệ các đột biến gen (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS,

NRAS) bằng phương pháp NGS mô u và mối liên quan giữa các đột

biến gen với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ................... 86

4.3. So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến gen EGFR giữa

NGS mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2 ..................................... 99

4.4. So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa NGS

sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2 ......... 103

KẾT LUẬN .................................................................................................. 111

KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LỜI CAM ĐOAN

Đây là một nhánh của công trình nghiên cứu “Xây dựng quy

trình phát hiện đột biến gen từ mẫu sinh thiết lỏng bằng công

nghệ giải trình tự gen thế hệ mới với ứng dụng trong chẩn đoán

và điều trị ung thư” thuộc sở khoa học công nghệ TP. Hồ Chí

Minh theo quyết định số 1276/QĐ-SKHCN ngày 25/12/2017.

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày

trong luận án là trung thực và khách quan.

Tác giả luận án

Đặng Huỳnh Anh Thư

[Type here] i [Type here]

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Nguyên chữ Viết tắt

: Anaplastic Lymphoma Kinase ALK

: American Thoracic Society ATS

: American Joint Committee On Cancer AJCC

: Bệnh nhân BN

: Cell Free DNA cfDNA

: Circulating Tumor DNA ctDNA

: Deoxyribonucleic acid DNA

: Epidermal Growth Factor Receptor EGFR

: Echinoderm Microtubule-Associated Protein-Like 4 EML4

: Formalin fixed, paraffin embedded FFPE

: International Association for the Study of Lung Cancer IASLC

: Liquid Biopsy Lung LBL

: Limits of Detection LOD

: Mutant Allele Fraction MAF

NCCN : National Comprehensive Cancer Network

: Next-Generation Sequencing NGS

: Polymerase Chain Reaction PCR

: Tumor Biopsy Lung TBL

: Tyrosine Kinase Inhibitor TKI

: T: tumor; N: lymph node; M: Metastasis TNM

: Ung thư biểu mô UTBM

: Ung thư phổi UTP

UTPKTBN : Ung thư phổi không tế bào nhỏ

ii

DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT

Tiếng Việt Tiếng Anh

American Thoracic Society : Hội lồng ngực Hoa Kỳ

American Joint Committee On : Ủy ban hợp tác của Hoa Kỳ về Ung

Cancer thư

Epidermal Growth Factor : Thụ thể yếu tố phát triển biểu bì

Receptor

Formalin fixed paraffin embedded : Mô cố định bằng paraffin

International Association for the : Hiệp hội quốc tế nghiên cứu về ung

Study of Lung Cancer thư phổi

Limits of Detection : Giới hạn phát hiện

Mutant Allele Fraction : Tần suất alen đột biến

National Comprehensive Cancer : Mạng lưới Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

Network

Next-Generation Sequencing : Giải trình tự gen thế hệ mới

Polymerase Chain Reaction : Phản ứng khuếch đại chuỗi

Tyrosine Kinase Inhibitor : Chất ức chế Tyrosine Kinase

[Type here] iii [Type here]

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang Bảng

1.1. 1.2.

1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 310 3.11 3.12

3.13

3.14 3.15

Phân nhóm giai đoạn UTPKTBN theo AJCC VII ........................ 9 Tóm tắt các thuốc nhắm trúng đích và đích trên tế bào ung thư phổi .............................................................................................. 10 Các phương pháp phát hiện đột biến gen trong UTPKTBN ........ 25 Các biến số sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 38 Các dòng tế bào mang đột biến được khảo sát trong nghiên cứu 52 Thông tin chứng dương Tru-Q1 ................................................... 52 Đặc điểm về giới tính ................................................................... 64 Đặc điểm về tiền sử hút thuốc lá .................................................. 65 Tỉ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen EGFR ....................... 68 Tỉ lệ các loại đột biến gen EGFR ................................................ 68 Tỉ lệ các loại đột biến gen KRAS ................................................ 70 Tỉ lệ các loại đột biến đồng thời của gen EGFR và KRAS ......... 71 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và giới tính ...................... 72 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và tuổi ........................ 73 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và hút thuốc lá ............ 74 Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và phân loại mô học .. 75 So sánh sinh thiết mô NGS và ddPCR ......................................... 76 Kết quả NGS và ddPCR của 30 mẫu sinh thiết mô trong phát hiện đột biến L858R, T790M, del19 ................................................... 77 So sánh sinh thiết mô NGS và Cobas trong phát hiện đột biến EGFR ........................................................................................... 78 So sánh sinh thiết lỏng NGS và ddPCR ...................................... 79 Kết quả NGS và ddPCR của 34 mẫu sinh thiết lỏng trong phát hiện đột biến L858R, T790M, del19 ........................................... 80

3.16

3.17 4.1 4.2

4.3

4.4

So sánh sinh thiết lỏng NGS và EGFR Cobas V2 trong phát hiện đột biến EGFR ............................................................................. 81 So sánh sinh thiết lỏng NGS và sinh thiết mô NGS .................... 82 Tỉ lệ các đột biến gen trong một số nghiên cứu ........................... 89 Phân tích các trường hợp không tương đồng giữa NGS mô u và EGFR Cobas V2 ......................................................................... 102 Phân tích các trường hợp không tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và EGFR Cobas V2 ............................................................ 107 Phân tích các trường hợp không tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và NGS mô u ...................................................................... 109

[Type here] iv [Type here]

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình Trang Hình

Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR ....... 12 1.1.

Sơ đồ các biến thể dung hợp ALK ở UTPKTBN ........................ 15 1.2.

Con đường truyền tín hiệu của đột biến ROS1 ............................. 16 1.3.

Các biến thể dung hợp gen ROS1 ở UTPKTBN ........................ 17 1.4.

Giải trình tự gen thế hệ mới bằng tổng hợp (Illumina) .............. 27 1.5.

Hệ thống máy giải trình tự Nextseq 550 (Ilumina/Mỹ) .............. 40 2.1.

v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

Nhóm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu ....................................... 64 3.1.

Phân loại giai đoạn bệnh ........................................................... 65 3.2.

Phân bố bệnh nhân theo phân loại mô học khối u ..................... 66 3.3.

Tỉ lệ các đột biến gen trong UTPKTBN .................................... 67 3.4.

Tỉ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen KRAS ....................... 69 3.5.

Tỉ lệ các loại đột biến của gen BRAF ........................................ 71 3.6.

Tên sơ đồ Trang Sơ đồ

Quy trình nghiên cứu ................................................................. 60 2.1.

Quy trình thực hiện xét nghiệm đột biến gen ............................ 63 3.1.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi (UTP) là ung thư phổ biến về tỉ lệ mắc và là nguyên nhân

hàng đầu gây tử vong liên quan đến ung thư. Việt Nam có tỉ lệ mắc UTP cao

hơn tỉ lệ mắc trung bình trên toàn thế giới (14,5% so với 11% tổng số ca mới)

mặc dù có cùng mức tỉ lệ tử vong theo dữ liệu Globocan năm 2020

[101]. Ngoài ra, ở Việt Nam, UTP là ung thư nguy hiểm nhất ở nam giới và

đứng hàng thứ hai các nguyên nhân gây tử vong do ung thư ở phụ nữ [75].

UTP chia làm 2 nhóm: ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi không tế bào

nhỏ, trong đó 80-85% là ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN). Đa số

UTP được phát hiện ở giai đoạn muộn, mặc dù có nhiều tiến bộ trong điều trị

nhưng tỉ lệ sống còn 5 năm chỉ khoảng 10 - 15%, vì vậy tiên lượng ở các bệnh

nhân UTP còn xấu [20]. Với giai đoạn muộn, điều trị chủ yếu dùng các

phương pháp điều trị toàn thân như hóa chất, điều trị đích. Tuy nhiên, việc

ứng dụng liệu pháp điều trị đích phụ thuộc vào khả năng nhận dạng phân tử

mục tiêu trên tế bào ung thư, đó là các gen liên quan đến sự phát triển khối u.

Kể từ năm 2018, Hiệp hội Ung thư Lâm sàng Hoa Kỳ (ASCO) đã

khuyến cáo xét nghiệm các đột biến gen EGFR, ALK , ROS1 và BRAF, KRAS

trong thực hành lâm sàng cho bệnh nhân UTPKTBN vì sự hiện diện các gen

này dự đoán được tính nhạy của các nhóm thuốc ức chế tyrosine

kinase [47]. Đột biến cho các gen KRAS, NRAS cũng đã được khuyến cáo do

có giá trị tiên lượng khả năng tái phát và đáp ứng điều trị [107].

Để xác định đột biến trên các gen mục tiêu của điều trị đích, mô u cần sinh

thiết bằng các phương pháp xâm lấn. Tuy nhiên, việc sử dụng mô u có những

hạn chế do sự không đồng nhất và thay đổi theo thời gian của khối u. Ngoài

ra, vài khối u nằm ở vị trí không thể sinh thiết mô. Sinh thiết lỏng có thể giúp

cải thiện những vấn đề trên. Sinh thiết lỏng phản ánh đặc tính di truyền của

toàn bộ khối u cả nguyên phát và di căn tốt hơn so với sinh thiết mô.

2

Giải trình tự gen Sanger thường được dùng để phát hiện các đột biến

gen tuy nhiên chi phí cao, tốn thời gian và độ nhạy thấp để phát hiện các alen

đột biến ở tần số thấp. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next- Generation

Sequencing - NGS) xác định được đồng thời đột biến của nhiều gen mục tiêu

không chỉ trên mẫu sinh thiết mô mà còn thực hiện được trên mẫu sinh thiết

lỏng với độ phủ cao và chi phí hợp lý khi cần khảo sát cùng lúc nhiều gen

[103].

Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu thực hiện khảo sát đột

biến gen EGFR và KRAS, chưa có công trình nghiên cứu đột biến các gen

ALK, ROS1, BRAF, NRAS trên BN UTPKTBN cả trên mô u và sinh thiết

lỏng. Đồng thời cũng chưa có nghiên cứu đánh giá khả năng áp dụng kỹ thuật

NGS trong phát hiện các đột biến gen ở BN UTPKTBN.

Do đó thực tế lâm sàng vẫn còn tồn tại các câu hỏi nghiên cứu như sau:

1. Phân bố các đột biến gen EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF

trong quần thể bệnh nhân UTPKTBN ở Việt Nam như thế nào và mối liên

quan giữa các đột biến gen này với đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ra sao?

2. Áp dụng NGS trên mô u và sinh thiết lỏng tại Việt Nam có chính xác

không trong phát hiện đột biến gen?

3. Có thể phát hiện các gen đột biến (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS,

BRAF) từ sinh thiết lỏng bằng NGS tại Việt Nam không?

Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu “Khảo sát đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới” để cung cấp thêm thông

tin về tỉ lệ cũng như mối liên quan của các gen mục tiêu với đặc điểm lâm

sàng của BN UTPKTBN và khả năng ứng dụng NGS trong phát hiện đột biến

gen ở sinh thiết mô và sinh thiết lỏng tại Việt Nam.

3

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát:

Khảo sát các đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới.

Mục tiêu chuyên biệt:

1. Xác định tỉ lệ đột biến của 6 gen (EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS,

BRAF) bằng giải trình tự gen thế hệ mới từ mô u và mối liên quan

giữa các đột biến gen này với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh

nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.

2. So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến EGFR giữa giải

trình tự gen thế hệ mới từ mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2.

3. So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa giải

trình tự gen thế hệ mới sinh thiết lỏng với giải trình tự gen thế hệ

mới mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2.

4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

Hiện tại, ung thư phổi là một trong những bệnh ung thư đứng đầu trên

thế giới và tại Việt Nam, cả về số ca bệnh mới mắc và số trường hợp tử vong.

UTPKTBN chiếm đến 85% các trường hợp UTP [20].

1.1.1. Yếu tố nguy cơ

1.1.1.1. Hút thuốc lá

Hút thuốc lá là yếu tố nguy cơ chính của UTP. Nicotine trong khói

thuốc thúc đẩy khối u bằng cách ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào, sự hình

thành mạch và ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào [1]. Ngừng

hút thuốc lá sẽ làm giảm các tổn thương tiền ung thư và giảm nguy cơ phát

triển thành UTP. Những người hút thuốc lá thụ động có nguy cơ UTP lên tới

20-30% nếu họ tiếp xúc với khói thuốc thường xuyên tại nơi làm việc hoặc ở

nhà [106].

1.1.1.2. Tiếp xúc với các tác nhân sinh khối u từ môi trường

Yếu tố nguy cơ do nghề nghiệp phổ biến nhất của UTP là phơi nhiễm a-

mi- ăng. Bên cạnh đó, nhiễm phóng xạ radon có liên quan đến 10% các trường

hợp UTP, trong khi ô nhiễm không khí đóng vai trò chính trong khoảng 1-2%

trường hợp [89]. Ngoài ra, việc người bệnh đã có tiền căn bệnh phổi trước đó

như bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, xơ phổi nguyên phát hoặc lao phổi cũng làm

tăng tỷ lệ phát sinh UTP. Nguyên nhân có thể do những tổn thương gây độc tế

bào tái diễn trong thời gian dài sẽ phá vỡ sự cân bằng di truyền trong tế bào.

1.1.1.3. Tính nhạy cảm di truyền

Các nghiên cứu gần đây tập trung vào cơ chế bệnh sinh cấp độ phân tử

và thu được nhiều kết quả mới và từ đó đề ra các chiến lược mới trong sàng

lọc và chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh nhân UTPKTBN. Trong UTP

5

các bất thường về gen thường gặp là tình trạng khuếch đại các gen gây ung

thư và bất hoạt của các gen ức chế khối u trong bệnh sinh UTPKTBN. Các bất

thường này gây kích thích tế bào u phát triển và trốn thoát sự kiểm soát chết

tế bào theo chương trình [89].

1.1.1.4. Tuổi

UTP chủ yếu xảy ra ở người lớn tuổi. Người được chẩn đoán mắc bệnh

UTP thường từ 65 tuổi trở lên, trong khi một số ít người được chẩn đoán dưới

45 tuổi. Độ tuổi trung bình tại thời điểm chẩn đoán là khoảng 70 tuổi. Điều

này cũng có thể lý giải bởi cùng với tuổi thọ của mình, con người cũng gia

tăng tích lũy các đột biến và tiếp xúc nhiều hơn các yếu tố độc hại từ môi

trường vào cơ thể bao gồm cả việc hút thuốc lá [1].

1.1.1.5. Giới tính

UTP gặp cả hai giới nam và nữ, tỉ lệ mắc của nam và nữ cũng khác

nhau ở từng quốc gia. Với các nước phát triển như Anh, Pháp, Hoa Kỳ tỉ lệ

nam và nữ hút thuốc lá xấp xỉ nhau do đó tỉ lệ mắc UTPKTBN cũng xấp xỉ

tương đương nhau giữa hai giới. Còn tại Việt Nam, tỉ lệ nữ hút thuốc lá rất

thấp nên giữa nam và nữ có sự khác biệt rõ ràng [20].

1.1.2. Lâm sàng

Các triệu chứng lâm sàng thường gặp bao gồm ho, ho ra máu, khạc

đàm, khó thở. Ngoài ra còn có các triệu chứng do di căn như di căn xương,

não, gan, lách. Các hội chứng bao gồm hội chứng nội tiết (tiết ADH không

phù hợp, hội chứng Cushing, vú to, ..), hội chứng huyết học (thiếu máu, tăng

bạch cầu ái toan, ..) [20].

1.1.3. Cận lâm sàng

1.1.3.1. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh

Các thăm dò chẩn đoán hình ảnh có vai trò đặc biệt quan trọng trong

chẩn đoán và đánh giá giai đoạn UTP bao gồm: X - Quang phổi, chụp cắt lớp

vi tính lồng ngực, cộng hưởng từ hạt nhân, siêu âm, nội soi phế quản. Trong

6

đó nội soi phế quản giúp lấy bệnh phẩm như chải, rửa phế quản, chọc hút

xuyên thành phế quản hay sinh thiết tổn thương, phục vụ cho chẩn đoán tế

bào và mô bệnh học. Sinh thiết phổi xuyên thành ngực có vai trò đặc biệt

quan trọng trong chẩn đoán các u ở ngoại vi, khi mà nội soi phế quản không

tiếp cận được [1].

1.1.3.2. Giải phẫu bệnh

- Năm 2011, một phân loại quốc tế được đề nghị cho UTP loại biểu mô

tuyến với sự thống nhất của Hội nghiên cứu ung thư phổi quốc tế (IASLC),

Hội lồng ngực Hoa Kỳ (ATS) và Hội hô hấp Châu Âu (ERS) dựa trên mẫu

sinh thiết nhỏ và tế bào học [111]. Đây chính là cơ sở của sự ra đời phân loại

mô học mới của Tổ chức y tế thế giới (TCYTTG) (2015) [110] theo đó

UTPKTBN được chia thành 7 phân nhóm nhỏ như sau:

 Ung thư biểu mô vảy (squamous cell carcinoma)

 Ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma)

 Ung thư biểu mô tế bào lớn (large cell carcinoma)

 Ung thư biểu mô tuyến vảy (adenosquamous cell carcinoma)

 Ung thư biểu mô dạng sarcoma (sarcomatoid carcinoma)

 U carcinoid

 Ung thư biểu mô týp tuyến nước bọt

Ung thư biểu mô tuyến chiếm 40% tổng số UTPKTBN. UTBM tuyến

là loại ung thư gặp ở cả hai giới, và phổ biến ở nữ. UTBM tuyến thường được

tìm thấy ở những người không hút thuốc. Đây cũng là loại UTP phổ biến nhất

ở những người dưới 45 tuổi. Loại ung thư này thường ở khu vực ngoại vi của

phổi nên có xu hướng phát hiện muộn hơn so với các loại UTP khác.

Ung thư biểu mô tế bào vảy chiếm 25-30% tổng số ca UTPKTBN và có

liên quan chặt chẽ với tiền sử hút thuốc lá. Vị trí ung thư thường gặp ở trung

7

tâm phổi gần phế quản gốc. Bệnh thường gặp ở nam giới nhiều hơn so với

nữ, phát triển chậm và do vị trí của nó nên thường được phát hiện sớm hơn

các loại ung UTP khác.

Ung thư biểu mô tế bào lớn chiếm 5-10% UTPKTBN. Loại ung thư này

thường xảy ra ở các vùng bên ngoài của phổi, có xu hướng phát triển và lây

lan nhanh hơn so với hai loại trên, điều này khiến cho việc điều trị trở nên khó

khăn. Các khối u biểu mô tế bào lớn có liên quan chặt chẽ với việc hút thuốc

lá và có xu hướng phát triển nhanh là một thách thức lớn trong điều trị.

1.1.4. Các giai đoạn UTPKTBN

Phân loại TNM 7 [58]

T: U nguyên phát

• T0: Không có bằng chứng về u nguyên phát.

• T1: Kích thước lớn nhất của khối u ≤ 3 cm, được bao quanh bởi nhu

mô phổi hoặc lá tạng màng phổi, không có bằng chứng về xâm lấn

vượt quá đoạn gần của phế quản thuỳ. T1a: Kích thước lớn nhất ≤ 2

cm; T1b: 2 cm < kích thước lớn nhất ≤ 3 cm.

• T2: 3 cm < kích thước lớn nhất ≤ 7 cm hoặc bất kỳ nhưng xâm lấn

phế quản gốc, cách ngã ba khí phế quản (carina) ≥ 2 cm; xâm lấn lá

tạng màng phổi; gây xẹp phổi hoặc viêm phổi tắc nghẽn lan đến rốn

phổi nhưng chưa lan toàn bộ phổi. Gồm: T2a: 3 cm < kích thước lớn

nhất ≤ 5 cm; T2b: 5 cm < kích thước lớn nhất ≤ 7 cm

• T3: Kích thước lớn nhất > 7 cm hoặc xâm lấn một trong các thành

phần: thành ngực (bao gồm cả khối u rãnh liên thuỳ trên); cơ hoành;

thần kinh hoành; màng phổi trung thất; màng ngoài tim hoặc xâm

lấn phế quản gốc, cách carina < 2 cm nhưng chưa tới carina hoặc

8

gây ra xẹp phổi, viêm phổi do tắc nghẽn trên toàn bộ phổi hoặc có

các nốt riêng biệt trên cùng 1 thuỳ phổi.

• T4: Khối u kích thước bất kỳ nhưng xâm lấn: trung thất, tim, mạch

máu lớn, khí quản, thần kinh quặt ngược thanh quản, thực quản,

thân đốt sống, carina, các nốt khối u khác ở thuỳ phổi khác cùng

bên.

N: Hạch vùng

• No: Không có di căn hạch vùng.

• N1: Di căn hạch cạnh phế quản và hoặc hạch trong phổi, hạch rốn

phối cùng bên, bao gồm cả sự xâm lấn trực tiếp.

• N2: Di căn hạch trung thất cùng bên và hạch dưới carina.

• N3: Di căn hạch rốn phổi đối bên, hạch trung thất đối bên, hạch cơ

bậc thang cùng hoặc đối bên, hạch thượng đòn.

M: Di căn xa

• Mo: Không có di căn xa.

• M1: Di căn xa.

+ M1a: Có kèm theo các nốt khối u ở phổi đối bên, tràn dịch màng

phổi hoặc màng tim ác tính

+ M1b: Di căn

9

Bảng 1.1. Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC VII [34]

Giai đoạn

Giai đoạn 0 Giai đoạn IA Giai đoạn IB

Giai đoạn IIA

Giai đoạn IIB

Giai đoạn IIIA

Giai đoạn IIIB Tis T1 T2a T2b T1 T2a T2b T3 T1-2 T3 T4 T1-3 T4 Tiêu chuẩn N0 N0 N0 N0 N1 N1 N1 N0 N2 N1-2 N0-1 N3 N2-3

M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 Giai đoạn IV T bất kỳ N bất kỳ

1.1.5. Điều trị

Chiến lược đầu tiên trong điều trị UTP đó là bỏ thuốc lá nếu bệnh nhân

có hút thuốc lá, thuốc lào. Vì thuốc lá được xem là yếu tố nguy cơ chính gây

UTP. Điều trị UTPKTBN hiện nay là đa mô thức. Lựa chọn phương pháp

điều trị cho BN UTPKTBN phụ thuộc vào chẩn đoán giai đoạn bệnh và nhiều

yếu tố khác như: tuổi, tình trạng có đột biến gen ALK, EGFR, ROS1, BRAF,

KRAS… Phẫu thuật, xạ trị, hóa chất, điều trị đích đã trở nên phổ biến trong

điều trị UTPKTBN [1].

Phẫu thuật được chỉ định rộng rãi trong trường hợp khối u khu trú, chưa

có di căn và thể trạng bệnh nhân đủ đáp ứng cho cuộc phẫu thuật. Các bệnh

nhân giai đoạn 0, I, II được chỉ định phẫu thuật [1].

Hóa chất để điều trị UTPKTBN thường được chọn lựa để điều trị trước

khi xạ trị với mục đích làm giảm bớt kích thước khối u hoặc sau khi phẫu

thuật nhằm hạn chế di căn hoặc phối hợp song song với xạ trị nếu bệnh nhân

10

không thể phẫu thuật. Tuy nhiên, tác dụng phụ cũng rất hay gặp tùy thuộc

từng loại hóa chất, liều dùng và thời gian kéo dài điều trị [1].

Xạ trị được khai thác triệt để trong điều trị UTPKTBN trên cả hai phác

đồ: đơn lẻ hay phối hợp với phẫu thuật hoặc hóa chất. Hiệu quả điều trị của xạ

trị tăng rõ rệt khi phối hợp với hóa chất nhưng đồng thời các tác dụng phụ

cũng tăng lên đáng kể. Đặc biệt xạ trị bằng sóng cao tần dưới sự hướng dẫn

của CT scan là một chọn lựa cho những khối u phổi vùng rìa và gần với thành

ngực [1].

Điều trị đích dựa trên những đột biến trong UTPKTBN, các mục tiêu

được nhắm vào là thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), thụ thể của yếu

tố tăng sinh mạch (VGFR), đột biến gen ALK, BRAF, ROS1 và RET, MET…

là mục tiêu tiềm năng cho các liệu pháp điều trị đích trong tương lai [77].

Bảng 1.2. Bảng tóm tắt các thuốc nhắm trúng đích và đích trên tế bào ung

thư phổi [77].

Thuốc nhắm trúng đích Tác dụng TT

Bevacizumab (Avastin)

Đích trên TB ung thư phổi VEGF

1

2

VEGF Receptor Ramucirumab (Cyramza)

3

EGFR

Ức chế tăng sinh mạch máu. Ức chế tăng sinh mạch máu. Ức chế sự sự phát triển, tăng sinh của TB ung thư, ức chế tăng sinh mạch, chống di căn. Kích hoạt tế bào ung thư apoptosis

Erlotinib (Tarceva) Afatinib (Gilotrif) Gefitinib (Iressa) Osimertinib (Tagrisso) Cetuximab Nimotuzumab

4

Osimertinib (Tagrisso)

EGFR có đột biến T790M

11

Necitumumab (Portrazza)

5

6

EGFR đột biến/ thư dạng ung vảy Đột biến gen ALK

Ngăn chặn tế bào ung thư phát triển và phân chia

7

Crizotinib (Xalkori) Ceritinib (Zykadia) Alectinib (Alecensa) Brigatinib (Alunbrig) Dabrafenib (Tafinlar) Trametinib (Mekinist)

Đột biến gen BRAF

Ngăn chăn hoạt động của MEK, ngăn sự phát triển và di căn của tế bào ung thư

1.2. VAI TRÒ CỦA ĐỘT BIẾN GEN TRONG UNG THƯ PHỔI

KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

1.2.1. Đột biến gen EGFR

Gen EGFR, nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 7, tại locus 7p12, dài

110 kb và được chia thành 28 exon. Đột biến gen EGFR xảy ra ở giai đoạn rất

sớm và có tỉ lệ cao trong UTPKTBN. EGFR là một thụ thể tyrosine kinase và

EGF trên bề mặt các tế bào có nguồn gốc biểu mô.

Sự kích hoạt domain tyrosine kinase dẫn đến kích thích một loạt các con

đường tín hiệu: PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF//MAPK và JAK/STAT. Các

con đường này kích hoạt sự điều hòa chức năng của một số lượng lớn gen gây

ung thư, ví dụ như sự tăng sinh tế bào, sự biệt hóa, sự di căn...

Đột biến gen EGFR đã được xác định ở UTPKTBN với tỉ lệ từ 10-20%

trên bệnh nhân ở châu Âu, châu Mỹ và 30-60% trên bệnh nhân thuộc chủng

tộc Đông Á, người Việt Nam có tỉ lệ đột biến EGFR chiếm 64,2% [88]. Đột

biến gen EGFR chiếm tỉ lệ cao ở nhóm người không hút thuốc lá, ở UTBM

tuyến so với các phân nhóm mô bệnh học khác của UTPKTBN, ở nữ giới so

với nam giới và ở nhóm bệnh nhân Đông Á so với các chủng tộc khác.

12

Hình 1.1. Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR

“Nguồn: Mitsudomi T, 2010” [59]

Khoảng 10 - 60% bệnh nhân UTPKTBN có đột biến ở exon 18-21 trên

gen EGFR. Exon 18-21 mã hóa vùng tyrosine kinase, khiến cho protein

EGFR luôn trong trạng thái hoạt hóa không phụ thuộc vào yếu tố tăng trưởng

EGF. Exon 18–21 là nơi đột biến trong EGFR thường xảy ra, tạo ra sự nhạy

cảm với các chất ức chế tyrosine kinase (TKI). Các đột biến này tạo ra protein

EGFR có ái lực mạnh với thuốc điều trị đích, do đó bệnh nhân UTPKTBN

mang đột biến gen EGFR thường đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích [80].

Phổ biến nhất là mất đoạn ở exon 19 (khoảng 45%), phần lớn các

trường hợp bao gồm các axit amin từ codon L747 đến E749 (đột biến LREA),

thông thường nhất là E746-A750del. Đột biến mất đoạn ở exon 19 là nhóm

đột biến nhạy với EGFR TKI [93].

Đột biến phổ biến thứ hai ở EGFR là đột biến sai nghĩa ở exon 18, 19 và

21. Trong đó phổ biến nhất là L858R, đây là đột biến điểm ở exon 21 dẫn đến

13

sự thay đổi leucine thành arginine ở codon 858 (khoảng 40%). Bên cạnh đó,

có những đột biến sai nghĩa ở exon 18 như G719 (G719A, C hoặc S); ở exon

21 như N826S, A839T, K846R, L861Q, G863D nhưng chiếm tỉ lệ thấp hơn.

Đột biến ở exon 18 và 21 phần lớn là các đột biến nhạy với EGFR TKI [90].

Ngoài ra, còn có một loạt đột biến khác ít phổ biến hơn như đột biến

lặp đoạn, thêm đoạn và đột biến điểm tại exon 20 trên gen EGFR. Exon 20

chứa hầu hết là các đột biến làm cho tế bào UTP kháng lại với thuốc điều trị

đích như đột biến điểm T790M, V769L, S768I và các đột biến thêm đoạn

[90].

Các chất EGFR TKI là các phân tử tổng hợp có trọng lượng phân tử

thấp, có nguồn gốc từ nhóm quinazoline, có vai trò ngăn chặn vị trí gắn kết

ATP của vùng tyrosine kinase nội bào, từ đó ngăn chặn sự tự phosphoryl hóa

của EGFR và các con đường tín hiệu xuôi dòng. Thuốc EGFR TKI có 3 thế

hệ: thế hệ 1 gồm gefitinib (Iressa) và erlotinib (Tarceva), thế hệ 2 là afatinib

(Gilotril), thế hệ 3 là osimertinib hoặc AZD9291 (Tagrisso). Đáp ứng của

EGFR TKI với các loại đột biến EGFR khác nhau. Erlotinib là một chất ức

chế tyrosine kinase được chấp thuận điều trị cho bệnh nhân UTPKTBN. Vai

trò của Erlotinib được chứng minh trong các nghiên cứu thử nghiệm lâm

sàng về điều trị bước 1, điều trị bước 2,3 sau thất bại với hóa chất và điều trị

duy trì sau khi điều trị hóa chất ổn định đối với UTPKTBN có đột biến

EGFR [48]. Gefitinib và afatinib cũng được chấp thuận cho việc điều trị

bước 1, 2 ở những bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến triển hoặc di căn có

đột biến gen EGFR gồm đột biến mất đoạn ở exon 19 và là đột biến ở exon

21 (đột biến L858R) [76]. Những trường hợp UTPKTBN có đột biến gen

EGFR được điều trị bằng gefitinib hoặc erlotinib luôn phát triển khả năng

kháng lại các EGFR TKI này. Cơ chế phổ biến nhất (khoảng 50%) và được

14

xác định sớm nhất là người bệnh có mang đột biến kháng thuốc T790M

(thay thế Threonine bằng methionine ở vị trí acid amin 790) ở exon 20. Đột

biến này gây nên hiện tượng trơ do ảnh hưởng bởi sự thay đổi cấu hình tại

nơi gắn kết với TKI [65]. Các đột biến gây kháng thuốc khác ít gặp hơn đã

được xác định là đột biến L747S, D761Y, T854A, S768I và V769L… [18].

Nhóm thuốc TKI thế hệ thứ 3 như osimertinib có hiệu quả cho bệnh nhân

ung thư phổi có đột biến EGFR T790M và bệnh trầm trọng hơn sau khi điều

trị với các thuốc EGFR TKI khác [76].

1.2.2. Đột biến gen ALK (dung hợp gen EML4 -ALK)

EML4 (Echinoderm microtubule associated protein like 4) - ALK

(Anaplastic Lymphoma Kinase) là đột biến dung hợp đầu tiên được tìm thấy ở

UTPKTBN vào năm 2007. Gen ALK mã hóa tổng hợp protein thụ thể kinase

lymphoma kinase (ALK). Đột biến dung hợp EML4-ALK xuất hiện trong

UTPKTBN với tần suất thấp 1-7%, chủ yếu ở người trẻ tuổi không hút thuốc

lá hoặc tiền sử có hút và hiện tại đã bỏ thuốc. Alectinib, crizotinib là các

thuốc trúng đích cho bệnh nhân có đột biến gen ALK. Đột biến này kích hoạt

con đường RAS/MEK/ErK và PI3K/AKT, do đó thúc đẩy quá trình tăng sinh

tế bào và chống lại chết theo chương trình [39].

Có ít nhất chín biến thể dung hợp EML4- ALK được tìm thấy ở

UTPKTBN, bao gồm V1, V2, V3a/b, V4, V5a/b, V6, V7, “V4”, “V5”. Các

biến thể này mang phần exon 20 của gen ALK mã hóa tyrosine kinases kết

hợp với các exon khác của gen tổng hợp EML4 (bao gồm các exon 2, 6, 13,

14, 15, 18 và 20). Biến thể 1 là sự dung hợp với exon 13; biến thể 2 là sự

dung hợp với exon 20, biến thể 3a và 3b là sự dung hợp với exon 6a và 6b;

biến thể 4 là sự dung hợp với exon 13 (với sự chèn vào 11 nucleotide chưa

biết nguồn gốc (màu xanh đậm) bắt đầu tại nucleotide 50 của exon 20); biến

thể 5a và 5b là sự dung hợp với exon 2 (biến thể 5b có sự chèn vào của 117

15

nucleotide từ intron 19); biến thể 6 là sự dung hợp với exon 13 (với sự thêm

vào của 69 nucleotide từ intron 19 (màu xanh đậm); biến thể 7 là sự dung hợp

với exon 14 (bắt đầu tại nucleotide 13 ở exon 20); biến thể “V4” là sự dung

hợp với exon 15 (bắt đầu tại nucleotide 21 ở exon 20) và “V5” là sự dung hợp

với exon 18. Trong đó ghi nhận 2 biến thể phổ biến nhất là biến thể 1 (E13-

A20) và biến thể 3 (E6a/b-A20) [44].

Hình 1.2. Sơ đồ các biến thể dung hợp gen ALK ở UTPKTBN

“Nguồn: Horn L, 2009” [44]

1.2.3. Đột biến gen ROS1

ROS1 là một thụ thể tyrosine kinase có cấu trúc tương đồng với protein

ALK; nằm trên NST 6q22 và lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1986. Gen

ROS1 có 47 exon, mã hóa cho protein dài 2347 amino acid. Đây là protein

tích hợp màng RTK type I, chứa 3 vùng domain: một domain ngoại bào, một

domain xuyên màng và một domain tyrosine kinase [23].

ROS1 tham gia vào nhiều con đường tín hiệu để thực hiện hoạt động

biến đổi của nó. PLCγ, MAP kinase, IRS1 (phân tử tín hiệu đến PI3K),

VAV3, STATS, cytoskeleton và các protein tương tác giữa các tế bào có thể

16

tương tác với ROS1 và quá trình phosphoryl hóa các protein này bởi ROS1 có

thể kích hoạt các con đường gây ung thư tương ứng [19].

Hình 1.3: Con đường truyền tín hiệu của đột biến ROS1

“Nguồn: Chin L.P, 2012” [23]

Sự tái sắp xếp gen thụ thể tyrosine kinase ROS1 đã được mô tả ở

UTPKTBN, chiếm tỉ lệ 2% và crizotinib là thuốc TKI được lựa chọn đầu tay

cho BN có đột biến ROS1[18]. Nhiều biến thể dung hợp ROS1 được tìm thấy

ở UTPKTBN, trong đó hai biến thể phổ biến nhất bao gồm sự dung hợp giữa

đầu 5’ SLC34A2 với đầu 3’ của ROS1 (18%) và sự dung hợp giữa đầu 5’ của

CD74 và đầu 3’ của ROS1 (41%) [27].

17

Hình 1.4. Các biến thể dung hợp gen ROS1 ở UTPKTBN

“Nguồn: Chin L.P, 2012” [23]

1.2.4. Đột biến gen KRAS

Họ gen RAS (gồm HRAS, NRAS và KRAS) là những gen có tỉ lệ đột

biến cao trong các bệnh ung thư ở người. Protein RAS chia làm hai nhóm

chính: yếu tố thay đổi guanine nucleotide (Guanine Nucleotide Exchange

Factors – GEFs) và protein kích hoạt GTPase (GTPase- Activating Proteins -

GAPs). GEFs chịu trách nhiệm cho việc chuyển đổi GDP thành GTP, trong

khi đó GAPs kích thích sự thủy phân GTP. Một khi được kích hoạt bởi các

yếu tố kích thích ngoại bào, protein RAS sẽ kích hoạt các con đường ở phía

“hạ lưu” (downstream), bao gồm RAF/MEK/ERK và PI3K)/AKT)/mTOR,

kích hoạt sự tăng sinh và phát triển của tế bào [108].

Trong UTPKTBN, KRAS là một trong những gen gây ung thư bị đột

biến chiếm tỉ lệ cao với chủ yếu là dạng đột biến thay thế một nucleotid tại

codon 12 và 13. Các đột biến acid amin đơn vị trí G12 và G13 thường gặp

nhất. Các đột biến KRAS được xác định chiếm khoảng 15 - 25%, chủ yếu gặp

ở người da trắng và có tiền sử hút thuốc lá [61].

18

Trong UTPKTBN, KRAS có ý nghĩa là yếu tố tiên lượng xấu, bệnh

nhân có đột biến KRAS cho thấy thời gian sống thêm và thời gian sống thêm

bệnh không tiến triển đều thấp hơn đáng kể so với các bệnh nhân không có

đột biến KRAS. Tuy nhiên đột biến KRAS không phải là yếu tố để loại trừ việc

điều trị thuốc EGFR TKI [63].

Năm 2021 FDA đã phê duyệt sotorasib để điều trị cho BN UTPKTBN

giai đoạn cuối có đột biến G12C của gen KRAS [63].

1.2.5. Đột biến gen NRAS

NRAS là một ATPase tương tự như KRAS, được xác định trong các

dòng tế bào u nguyên bào thần kinh và là thành viên thứ ba của gia đình RAS

sau KRAS và HRAS. RAS GTPase điều khiển sự tăng trưởng tế bào, tăng sinh

và biệt hóa thông qua các con đường RAF/MEK/ERK và PI3K)/AKT)/mTOR

[61].

Đột biến sinh dưỡng NRAS chiếm khoảng 1% ở bệnh nhân UTPKTBN,

thường được tìm thấy ở UTBM tuyến và ở những người có tiền sử hút thuốc.

Đột biến sai nghĩa dẫn đến thay thế amino acid ở vị trí 61 có trong phần lớn

trường hợp mang đột biến NRAS, bao gồm: Q61K (10-25%), Q61L (25-50%),

Q61R (17-19%), Q61H (3%). Đột biến ngay tại vị trí 12, bao gồm: G12C,

G12R, G12S, G12A, G12D chiếm khoảng 3% trong tổng số đột biến NRAS

[68].

Hiện tại, không có liệu pháp chống NRAS trực tiếp có sẵn, nhưng các

mô hình tiền lâm sàng cho thấy các thuốc ức chế MEK có thể có hiệu quả.

1.2.6. Đột biến gen BRAF

BRAF thuộc họ protein kinase-threonine bao gồm ARAF, BRAF và

CRAF (RAF1). Gen BRAF mã hóa thông tin cho protein BRAF có trọng lượng

phân tử 94 kDa là chất có hoạt tính kinase với chức năng truyền tín hiệu nội

19

bào xuôi dòng phía sau protein KRAS của con đường tín hiệu RAS-MAPK.

BRAF là một proto-oncogen, là một tín hiệu điều khiển chuyển tải

serin/threoninprotein kinase có khả năng thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và sự

sống còn của tế bào ung thư [56].

Các đột biến soma BRAF đã được tìm thấy trong 1–4% của tất cả

UTPKTBN, phổ biến nhất ở bệnh nhân UTBM tuyến. Những đột biến này

thường được liên kết với những người có tiền sử hút thuốc trước đây hoặc

hiện tại đang hút thuốc. Đối với gen BRAF có hơn 30 loại đột biến khác nhau

được mô tả. Tuy nhiên hơn 90% đột biến gen BRAF xảy ra ở codon 600

(V600E) chuyển acid amin Glycin thành acid amin Valin. Đột biến này gia

tăng hoạt tính kinase xuôi dòng từ protein BRAF đến MEK thúc đẩy phân chia

tế bào ngay cả khi không có tín hiệu phía trước protein BRAF đến. Chính cơ

chế này làm tăng khả năng kháng thuốc ức chế EGFR của tế bào ung thư [28].

Đột biến BRAF V600E ở UTPKTBN thường gặp ở nữ và là yếu tố tiên lượng

xấu của bệnh. Những thuốc điều trị ung thư gây ra bởi đột biến gen BRAF đã

và đang được phát triển. Hai trong số các loại thuốc này, vemurafenib và

trametinib đã được FDA phê duyệt để điều trị cho BN UTPKTBN giai đoạn

cuối có đột biến V600E của gen BRAF [67].

1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN

1.3.1. Hóa mô miễn dịch (IHC: immunohistochemistry)

Nhiều nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát

hiện đột biến đích đã biết trong UTPKTBN. Với đột biến EGFR hiện nay có 2

loại kháng thể đơn dòng có thể phát hiện được đột biến mất đoạn exon 19 (

dòng 6b6) và đột biến điểm L858R (dòng 43b2) với độ nhạy 70 – 100% và độ

đặc hiệu lên đến 100% [70]. Hóa mô miễn dịch cũng có khả năng chẩn đoán

nhanh chuyển đoạn ALK và ROS1. Kháng thể đơn dòng 5A4 cho độ nhạy

20

90%, độ đặc hiệu 100% khi so sánh với phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ

(ALK break Apart FISH rearrangement probe Kit) [68]. Với kháng thể đơn

dòng D4D6, hóa mô miễn dịch giúp phát hiện chuyển đoạn ROS1 với độ

nhạy 100%, độ đặc hiệu 92% [96].

1.3.2. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: fluorescence in situ)

FISH là phương pháp sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện các chuyển

đoạn gen trong ung thư phổi. FDA đã phê chuẩn FISH (Vysis ALK probe Kit)

là phương pháp chuẩn để phát hiện chuyển đoạn gen ALK trước khi sử dụng

crizotinib [53]. FISH cũng được dùng để xác định chuyển đoạn ROS1 và RET

và khuếch đại gen MET.

1.3.3. Các kỹ thuật PCR

 Xét nghiệm EGFR Cobas Version 2

Xét nghiệm EGFR sử dụng hệ thống Cobas phiên bản 2 là một phương

pháp tổng hợp chuỗi thời gian thực (real-time PCR). Xét nghiệm được thực

hiện trên hệ thống cobas 4800, hệ thống này cung cấp khả năng phát hiện và

khuếch đại PCR hiệu suất cao cùng với phần mềm tự động hóa phân tích và

báo cáo kết quả. Xét nghiệm EGFR Cobas V2 có thể phát hiện định tính 42

đột biến EGFR khác nhau (phụ lục 3), đa số là những đột biến đã được xác

định có ảnh hưởng đến tính đáp ứng với các thuốc điều trị đích. Trong đó có

29 đột biến trên exon 19 nhiều hơn so với các kit khác như kit Qiagen chỉ

phát hiện được 29 đột biến EGFR gồm 19 đột biến trên exon 19, kit

StripAssay (ViennaLab) phát hiện được 30 đột biến. Điều này rất có giá trị

trong chẩn đoán và điều trị vì tỉ lệ bệnh nhân có đột biến trên exon 19 là cao

nhất so với các exon khác [21].

Xét nghiệm EGFR Cobas V2 được cấp chứng nhận chất lượng CE-

IVD cho phép sử dụng trong chẩn đoán, cho kết quả nhanh chóng, độ nhạy

21

cao, có khả năng phát hiện khi số lượng tế bào mang đột biến là 5% . Đây là

xét nghiệm EGFR đầu tiên và duy nhất hiện tại được FDA chấp thuận cho cả

sinh thiết mô và sinh thiết lỏng [109]. Một số nghiên cứu lâm sàng lớn như

AURA, AURA2, FLAURA, ENSURE, EURTAC và FASTACT2 đã chứng

minh rằng EGFR Cobas V2 là một xét nghiệm chẩn đoán mạnh mẽ và đáng

tin cậy để phát hiện các đột biến của gen EGFR từ sinh thiết mô khối u hoặc

từ huyết tương và có thể xác định những bệnh nhân có nhiều khả năng đáp

ứng với liệu pháp ức chế EGFR TKI [21].

 Kỹ thuật PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR: digital droplet PCR) [69]

PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) là PCR thế hệ thứ ba, sau Real-time

PCR. Kỹ thuật này khắc phục những hạn chế của Real-time PCR, cho phép

định lượng chính xác các phân tử DNA, RNA mục tiêu. Với độ nhạy, độ

chính xác và độ lặp lại cao, ddPCR được ứng dụng ngày càng nhiều trong các

lĩnh vực sau [50],[105]:

- Đánh giá chất lượng thư viện trước khi giải trình tự NGS.

- Thẩm định kết quả giải trình tự NGS cho những đột biến ở tần số thấp.

- Phát hiện và xác định tỉ lệ của các cfDNA trong sinh thiết lỏng.

- Nghiên cứu biểu hiện gen, đặc biệt với những mẫu khó như tế bào đơn

(single cell) hoặc mẫu mô đúc trong paraffin (FFPE)

- Phát hiện các gen mang đột biến hiếm, xuất hiện ở tỉ lệ thấp trong các mẫu

khối u ung thư phức tạp hoặc mẫu liên quan đến bệnh di truyền.

- Chẩn đoán di truyền không xâm lấn dựa trên máu mẹ.

Quy trình PCR kỹ thuật số của Bio-Rad bao gồm 5 bước sau [29],[43] :

(1) Chuẩn bị phản ứng PCR: Việc chuẩn bị phản ứng ddPCR tương

tự như phản ứng PCR thông thường. Phản ứng cũng bao gồm các thành phần

22

cơ bản như enzyme Taq polymerase, mồi, dNTP, … và bổ sung thêm chất

phát quang EvaGreen hoặc mẫu dò huỳnh quang TaqMan. Các mẫu DNA sẽ

được bổ sung vào các phản ứng này. Tổng thể tích cuối cùng của phản ứng là

20 μL. Cũng giống như khi chạy PCR, bên cạnh các phản ứng cho mẫu xét

nghiệm, kỹ thuật viên thường chạy thêm các phản ứng chứng dương (chứa

DNA mục tiêu) và phản ứng chứng âm (không chứa DNA mục tiêu).

(2) Tạo vi giọt: Bằng một thiết bị đặc biệt của hãng Bio-Rad gọi là

Droplet Genrator, một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên

thành 20.000 vi giọt có thể tích khoảng 1 nL. Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các

thành phần của 1 phản ứng Real-time PCR như trên. Các phân tử DNA sẽ

được phân bố ngẫu nhiên vào các vi giọt này.

(3) Nhân bản DNA có trong vi giọt: Tất cả 20.000 vi giọt được tạo

ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng

và được đặt vào máy PCR thông thường. Khi chương trình luân nhiệt diễn ra,

DNA có trong mỗi vi giọt sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông

thường. Tín hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc chất phát quang sẽ được

tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục tiêu được phân bố vào

vi giọt.

(4) Đọc tín hiệu trong vi giọt: Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi

giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳnh quang của hãng Bio-Rad.

Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow cytometer. Từng vi giọt

trong mỗi ống chứa ở bước 3 sẽ được hút vào đường ống của thiết bị và lần

lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang. Cường độ tín hiệu của mỗi màu

huỳnh quang có trong mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại. Hiện tại, máy

đọc vi giọt của Bio-Rad đọc được 3 loại màu huỳnh quang khác nhau.

23

(5) Phân tích dữ liệu: Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ

từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang phần mềm phân tích trên máy vi

tính. Đối với từng phản ứng 20 μL ban đầu, kết quả được phân tích bao gồm:

- Tổng số vi giọt (droplet) tạo ra được từ 20 μL phản ứng ban đầu, bao gồm

vi giọt dương tính và vi giọt âm tính.

- Tổng số vi giọt dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu

huỳnh quang cao hơn hẳn so với những vi giọt trong phản ứng chứng âm).

- Tổng số vi giọt âm tính (không chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín

hiệu huỳnh quang ngang ngửa với những vi giọt trong phản ứng chứng

âm).

Dựa vào số lượng vi giọt dương tính và tổng số vi giọt tạo ra từ mỗi

phản ứng ban đầu, phần mềm sẽ áp dụng mô hình phân phối Poisson để tính

ra nồng độ DNA mục tiêu có trong 20 μL thể tích phản ứng ban đầu.

1.3.4. Giải trình tự gen

 Giải trình tự gen Sanger

Đây là phương pháp sớm nhất được sử dụng phát hiện đột biến gen

EGFR và KRAS. Trình tự DNA được giải trình tự trực tiếp ngay sau khi được

khuếch đại bằng PCR. Kỹ thuật gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn đầu gọi là giai đoạn phản ứng giải trình tự : đoạn DNA cần

được giải trình tự được sử dụng như trình tự khuôn cho phản ứng giải trình tự

bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử

dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào

mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng

hợp. Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các

đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích

thước khác nhau. Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA được xác định bằng

24

cách chạy một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được

đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.

Giai đoạn kế gọi là giai đoạn điện di giải trình tự: sản phẩm sau phản

ứng giải trình tự sẽ được dùng điện di độ phân giải cao (điện di bản gel

polyacrylamide hay điện di mao quản) để sắp xếp các đoạn trình tự dài ngắn

khác nhau theo kích thước (ngắn trước, dài sau dù chỉ cách nhau có một

nucleotide) và chính nhờ trình tự này mà biết được thứ tự sắp xếp các

nucleotide của đoạn DNA. Đọc trình tự bằng máy giải trình tự tự động sử

dụng bảng gel polyacrylamide. Máy gồm 2 phần: phần dùng điện di gel, phần

phát hiện các vạch điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang

phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm

quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng. Sau đó,

trình tự gen của mẫu nghiên cứu sẽ được đối chiếu với trình tự gen tham chiếu

trên ngân hàng gen thế giới (GenBank) và được phân tích để xác định vùng

hoặc điểm đột biến.

Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi cách đây nhiều năm và dần được

thay thể bằng các kỹ thuật phức tạp và chất lượng cao hơn.

 Giải trình tự thế hệ mới

Giải trình tự gen thế hệ mới là phương thức giải trình tự đồng

thời và lượng lớn các đoạn ngắn nucleotide. Đây là một cuộc cách mạng về

công nghệ giải trình tự vì nếu giải trình tự Sanger chỉ cho phép giải trình tự

không quá 1500 bps, thì giải trình tự thế hệ mới cho phép giải được từ 8

Gbases 600 Gbases, có nghĩa là cho phép giải trình tự nguyên bộ gen. Cùng

một thời điểm, máy giải trình tự gen thế hệ mới có khả năng tạo hàng triệu

đến hàng tỷ dòng nên sẽ giải được hàng triệu đến hàng tỷ mảnh DNA cùng

lúc. Giải trình tự gen thế hệ mới có thể phát hiện đồng thời nhiều loại đột biến

25

như: đột biến điểm, mất đoạn, chuyển đoạn, khuếch đại gen hay mất nhiều

gen.

Bảng 1.3: Các phương pháp phát hiện đột biến gen trong UTPKTBN [55].

Loại đột biến

FISH Multiplex

Hóa mô miễn dịch (IHC)

PCR

Giải trình tự Sanger

X

Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) X

X

X (EGFR L858R)

X

X

X

Đột biến điểm EGFR, KRAS HER2, BRAF PIK3CA, AKT MEK Đảo đoạn, mất đoạn EGFR, HER2

X

X

Chuyển đoạn ALK, ROS1, RET

Khuếch đại MET

X

X

X (EGFR mất đoạn exon 19) X ( ALK, ROS1 cần kiểm chứng lại bằng FISH) X (cần kiểm chứng lại bằng FISH)

X

Các đột biến khác chưa phát hiện

Giải trình tự gen bằng tổng hợp (SBS: sequencing by synthesis) của

hãng Illumina có quá trình PCR thực hiện trên các vi bản. Ngày nay, Illumina

là hệ thống giải trình tự phổ biến nhất, gồm nhiều platform phù hợp với nhiều

ứng dụng khác nhau. Giải trình tự Illumina bắt đầu từ một hỗn hợp DNA

mạch đơn (có gắn 2 adapter ở hai đầu 3’ và 5’) được gắn lên trên bề mặt flow

cell. Mỗi flow cell được chia thành tám làn riêng biệt và trên bề mặt bên trong

có gắn cộng hóa trị với các oligo và chính các oligo này bắt cặp bổ sung với

các adaptor đặc hiệu mà đã được gắn với các đoạn.

26

DNA trong thư viện được tạo ban đầu. Bề mặt này được thiết kế để gắn

các mạch DNA sao cho thuận lợi cho việc tiếp xúc với các enzyme cũng như

tạo sự ổn định cho các mạch khuôn DNA này. Pha khuếch đại tạo ra tối đa

1.000 bản sao từ một mạch khuôn ban đầu [55]. Công nghệ giải trình tự bằng

cơ chế tổng hợp sử dụng 4 nucleotide đánh dấu phát huỳnh quang để giải trình

tự hàng chục triệu cụm cluster trên bề mặt flow cell. Mỗi chu kỳ giải trình tự,

một deoxynucleoside triphosphate (dNTP) đã đánh dấu được thêm vào chuỗi

nucleic acid. Các dNTP này bị khóa ở vị trí 3’-OH, do đó, sau mỗi lần một

dNTP được gắn vào mạch thì việc gắn dNTP tiếp theo bị ức chế trong một

khoảng thời gian đủ dài (1 chu kỳ) để máy ghi nhận tín hiệu huỳnh quang từ

dNTP được gắn vào, sau đó một loại enzyme được thêm vào để gỡ khóa tại vị

trí 3’-OH và cho phép tiếp tục gắn nucleotide tiếp theo. Vì tất cả 4 dNTP (A,

T, G, C) đều bị khóa ở vị trí 3’-OH giúp ghi nhận chính xác tín hiệu của từng

nucleotide, đặc biệt là dễ dàng giải trình tự các homopolymer [53]. Ưu điểm

nổi bật nhất của NGS đó là giải trình tự song song hàng triệu phân tử DNA

khác nhau, cho phép phát hiện nhiều đột biến ở nhiều gen vì vậy giúp giảm

giá thành giải trình tự xuống đáng kể, có thể đạt đến $0,1 cho mỗi 1 triệu

nucleotide so với mức giá $2.400 của phương pháp giải trình tự Sanger truyền

thống.

27

Hình 1.5: Giải trình tự gen thế hệ mới bằng tổng hợp (Illumina)

“Nguồn: Mardis E.R, 2012” [55]

1.3.5. Sinh thiết lỏng

Hiện nay kỹ thuật xét nghiệm đột biến gen dựa trên mẫu mô u được

xem là tiêu chuẩn vàng. Tuy nhiên có một số khó khăn khi xét nghiệm từ mẫu

sinh thiết như bệnh nhân già yếu, không đủ sức khoẻ để sinh thiết, vị trí u

không thể sinh thiết, bệnh nhân không còn u sau một thời gian điều trị hoặc

bệnh nhân không đồng ý sinh thiết. Sinh thiết lỏng (liquid biopsy) là một

phương pháp mới với rất nhiều ưu điểm so với phương pháp sinh thiết mô u

truyền thống và đang dần được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng. Sinh thiết

lỏng dựa trên sự phát hiện các đột biến sinh dưỡng đặc hiệu của mô ung thư,

hiện diện trên những phân mảnh DNA tự do được phóng thích từ tế bào ung

thư vào máu ngoại biên. DNA tự do trong máu (cfDNA) lần đầu tiên được

phát hiện vào năm 1987 bởi Mandel và Metails. Nhiều nghiên cứu chứng

minh rằng, cfDNA có kích thước khoảng 166 bp và được cho là kết quả của

28

quá trình chết theo chương trình hoặc hoại tử của tế bào [30]. cfDNA có thời

gian bán hủy ngắn (1,5 giờ) và nồng độ có thể khác nhau tùy theo khối u và

diễn tiến bệnh. cfDNA phản ánh hầu như toàn bộ những bất thường về gen có

trong khối u ban đầu. Người ta phát hiện rằng, nồng độ cfDNA ở bệnh nhân

ung thư lớn hơn bốn đến tám lần so với nồng độ của cfDNA ở người bình

thường [37].

Mặt khác, sinh thiết lỏng phản ánh đặc tính di truyền của toàn bộ khối u

(cả nguyên phát và di căn) tốt hơn so với sinh thiết mô. Nguyên nhân do việc

sử dụng mô u có những hạn chế trong quá trình đánh giá sự phát triển và xác

định kiểu gen của khối u do sự không đồng nhất và thay đổi theo thời gian của

khối u. Số liệu ước tính cho thấy 63-69% trong tổng số đột biến sinh dưỡng

không tìm thấy ở mọi vùng khối u. Sự không đồng nhất khối u có thể dẫn đến

việc đánh giá không hoàn chỉnh cấu trúc gen của khối u và là thách thức lớn

cho việc theo dõi tiến trình điều trị [74].

Một ưu điểm lớn nhất của sinh thiết lỏng chính là dễ dàng thu mẫu trong

quá trình theo dõi tiến trình điều trị và có vai trò phát hiện những đột biến mới

do kết quả của việc kháng thuốc. Bởi vì, trong sinh thiết lỏng, mẫu máu chủ

yếu được sử dụng làm nguồn mẫu để phân tích DNA khối u lưu hành trong

máu (circulating tumor DNA – ctDNA). Bên cạnh đó, việc sinh thiết mô

thường xuyên trong tiến trình điều trị sẽ gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của

bệnh nhân từ các biến chứng thủ thuật. Ngoài ra, vài khối u nằm ở vị trí

không thể nào sinh thiết mô được [25].

Tuy nhiên, việc phát hiện ctDNA từ cfDNA ở bệnh nhân ung thư gặp

nhiều thử thách lớn. Một thử thách lớn đó chính là phân biệt ctDNA từ

cfDNA ở bệnh nhân ung thư. Một điều rõ ràng rằng, ctDNA mang các đột

biến hiện diện trong bộ gen của các tế bào ung thư chứ không hiện diện ở các

29

tế bào bình thường. Do vậy, hiện nay, các phương pháp giải trình tự có thể

phân biệt ctDNA một các dễ dàng nếu ctDNA chiếm một số lượng lớn trong

máu của bệnh nhân ung thư. Tuy nhiên, ctDNA chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ trong

tổng số cfDNA ở bệnh nhân ung thư, gây khó khăn cho việc phát hiện đột biến

sinh dưỡng từ huyết tương. Nồng độ này thay đổi phụ thuộc vào dạng ung thư,

giai đoạn bệnh và kích thước khối u; thông thường kích thước mô u càng lớn,

lượng ctDNA được phóng thích càng nhiều. Ở bệnh nhân ung thư giai đoạn

tiến triển, tần suất đột biến (MAF: mutant allele fraction) có thể ở khoảng

1%, nghĩa là cứ mỗi 100 phân tử cfDNA được phát hiện trong dòng máu, chỉ

có 1 phân tử ctDNA mang đột biến được phóng thích từ tế bào ung thư [40].

Do đó, cần phải lựa chọn các phương pháp chính xác và tối ưu để phân tích

ctDNA. Trong ung thư phổi, nhiều phương pháp được sử dụng để phân tích

ctDNA. Các phương pháp dựa trên PCR có thể được sử dụng bao gồm digital

PCR và qPCR, ví dụ sử dụng real-time PCR để phân tích đột biến kháng

thuốc T790M ở gen EGFR; kỹ thuật ddPCR phát hiện đột biến mất exon 19 ở

EGFR; bộ kit Cobas (Roche) phát hiện đồng thời 42 đột biến trên 4 exon 18,

19, 20 và 21 của thụ thể EGFR trong bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn cuối

[69],[79]. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp dựa trên PCR là chỉ phát hiện

một số ít đột biến đã biết trước trên một số lượng gen rất giới hạn. Bên cạnh

đó, phương pháp dựa trên PCR rất khó để phát hiện sự tái sắp xếp gen (ALK

hoặc ROS1), bởi vì các điểm tái sắp xếp thường nằm trên vùng intron rộng mà

không có “điểm nóng” (hot spots) rõ ràng vì thế rất khó khăn trong việc thiết

kế mồi. Một phương pháp khác để nhận biết đột biến gen là phương pháp giải

trình tự Sanger truyền thống. Tuy nhiên phương pháp này không thể được sử

dụng cho sinh thiết lỏng vì không đủ độ nhạy để phát hiện những đột biến có

tần suất thấp hơn 20%, hơn thế nữa phương pháp Sanger không thể phát hiện

những đột biến thêm hoặc mất đoạn và chuyển đoạn.

30

Do đó, một hướng mới hiện nay trong việc xác định đột biến ở mẫu sinh

thiết lỏng chính là kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới với độ sâu lớn. Hiện nay,

việc dùng NGS để phát hiện đột biến từ mẫu sinh thiết lỏng từ bệnh nhân ung

thư được sử dụng một cách rộng rãi. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc phát

hiện đột biến ở mẫu sinh thiết lỏng dựa trên NGS có tỉ lệ tương đồng từ 60-

86% so với mẫu sinh thiết mô ở các bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến

triển. Gần đây, việc dùng NGS với độ sâu lớn để phát hiện các đột biến có tần

suất > 1% đã được báo cáo. Ngoài ra, việc phát hiện đột biến ở ctDNA bằng

NGS cho thấy có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phát hiện đột biến mất đoạn

ở exon 19, đột biến điểm L858R và T790M ở gen EGFR. Sử dụng NGS để

phát hiện đột biến dung hợp ở gen ALK cũng đã được báo cáo trong nhiều

nghiên cứu trước đây [64].

1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN

UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

1.4.1. Các nghiên cứu nước ngoài:

Sasaki H. (2005) tình trạng đột biến gen EGFR tương quan đáng kể với

giới tính, hút thuốc lá và các phân nhóm bệnh lý của ung thư phổi [88].

Shim H.S. (2011) nghiên cứu cho thấy trong đột biến EGFR, các đột

biến mất đoạn và đột biến điểm, phổ biến nhất trong các exon 19 và 21 với tỉ

lệ tương ứng 61,1% và 31,5% [95].

Nghiên cứu IPASS (2011) cho thấy tỉ lệ đột biến gen EGFR ở BN

UTBM tuyến ở nữ lên tới 76,7% và ở BN không hút thuốc là 92,7% [35].

Wu J.Y. (2011) khi nghiên cứu trên 327 BN UTPKTBN cho thấy tỉ lệ

đột biến gen EGFR là 52,0%, gặp nhiều hơn ở nữ giới (p < 0,001) và những

người không hút thuốc (p < 0,01) [112].

31

Cai X (2014) phân tích đột biến gen EGFR trên 76 bệnh nhân

UTPKTBN cũng cho thấy tỉ lệ đột biến gen EGFR ở nữ cao hơn ở nam với tỉ

lệ tương ứng là 61,1% và 25,0% [22].

Nghiên cứu PIONEER (2014) trên BN châu Á cho thấy tỉ lệ đột biến

gen EGFR ở nữ cao hơn so với nam (61,1% so với 44%), BN không hút thuốc

có tỉ lệ đột biến gen EGFR cao hơn BN đã từng hút thuốc (60,7% so với

43,2%) [92].

Wang R (2015) xét nghiệm đột biến gen trên 1356 BN Trung Quốc bị

UTBM tuyến ghi nhận tỉ lệ đột biến EGFR là 63,1%, đột biến KRAS là

8%, đột biến ALK là 5,2%, đột biến BRAF là 1,3%, đột biến ROS1 là 0,8%

[112].

Tại Trung tâm Ung thư Memorial Sloan Kettering, là trung tâm ung thư

lớn lâu đời và uy tín tại Hoa Kỳ, thực hiện nghiên cứu MSK-IMPACT và

công bố vào năm 2017. Nghiên cứu đã giải trình tự NGS các khối u từ 11.369

bệnh nhân ung thư, trong đó có 1668 BN UTPKTBN, phát hiện tỉ lệ đột biến

EGFR là 24,5%, đột biến KRAS là 26,9%, đột biến ALK là 4,4%, đột biến

BRAF là 5,2%, đột biến ROS1 là 3,1%, đột biến NRAS là 1,2% [46].

Jing C (2018) giải trình tự gen thế hệ mới Iontorrent trên mô u 112 BN

UTPKTBN, đồng thời được kiểm tra bằng PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR).

Kết quả ghi nhận tỉ lệ đột biến EGFR là 51,7%, đột biến KRAS là 8,9%, đột

biến BRAF là 1,7%, đột biến NRAS là 1,7%. Tỷ lệ dương tính của EGFR là

68,29% trong UTBM tuyến so với 8,33% trong UTBM tế bào vảy. So với

ddPCR, độ nhạy và độ đặc hiệu của NGS lần lượt là 95,8% và 98,1%. Độ

tương đồng cao của các đột biến được báo cáo trong xét nghiệm NGS và

ddPCR, cho thấy xét nghiệm NGS trong lâm sàng thường quy có thể hữu ích

trong việc xác định quyết định điều trị ở bệnh nhân UTPKTBN [45].

32

Remon J (2019) nghiên cứu trên 94 BN UTPKTBN chưa điều trị, thực

hiện NGS sinh thiết mô và sinh thiết lỏng trong khảo sát các gen EGFR exon

18-21, BRAF, KRAS, MET exon 14, ERBB2 exon 20, cho thấy sự tương đồng

giữa hai phương pháp là 95%; độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 72% và 97%

[84].

Hanibuchi M (2019) thực hiện NGS trên 45 BN UTPKTBN ở cả mô u

và sinh thiết lỏng ghi nhận sự tương đồng là 64%, độ nhạy là 67%, độ đặc

hiệu là 98% [40].

Steendam C.M.J (2019) nghiên cứu trên 162 BN UTPKTBN cho thấy

sự tương đồng giữa ddPCR và NGS sinh thiết lỏng là 86% (κ = 0,63) đối với

phát hiện các đột biến nhạy với EGFR TKI (L858R và del19) và tương đồng

94% (κ = 0,89) đối với các đột biến kháng với EGFR TKI (T790M). Sự tương

đồng giữa ddPCR và NGS mô u trong phát hiện đột biến L858R và del19 là

83% và trong phát hiện T790M là 75% (κ = 0,49) [99].

Papadopoulou E (2019) nghiên cứu ở các BN UTPKTBN tái phát sau

khi điều trị EGFR TKI. Khi thực hiện ở 50 mẫu máu sinh thiết lỏng ở BN

bằng cả hai xét nghiệm Cobas và NGS, cho thấy tỉ lệ tương đồng 82% giữa

cobas và NGS đối với đột biến nhạy EGFR (ở exons 18, 19, 21), trong khi tỉ

lệ này là 94% đối với đột biến T790M [72].

Nghiên cứu của Tan AC (2020) trên 173 BN UTPKTBN cho kết quả

EGFR (56 %), KRAS (14 %), BRAF (2 %) và ERBB2 (1 %) và ALK (6 %),

RET (3 %) và ROS1 (1 %). Đồng thời khi phân tích chi phí và hiệu quả điều

trị đã chứng minh rằng so với xét nghiệm tuần tự các gen ở những BN âm tính

với EGFR, xét nghiệm NGS đa gen mục tiêu từ lúc đầu sẽ giúp xác định thêm

33

1 % BN có những đột biến phù hợp liệu pháp nhắm trúng đích mà không làm

tăng chi phí xét nghiệm và thời gian của BN [103].

Stitz R (2021) khi phân tích so sánh các mẫu sinh thiết lỏng của BN

UTPKTBN, cho thấy sự tương đồng là 91% giữa NGS và ddPCR, độ nhạy

96% và độ đặc hiệu 100%. Kết quả này xác nhận rằng NGS sinh thiết lỏng có

thể được sử dụng để theo dõi ở bệnh nhân đang điều trị EGFR TKI [100].

Murakami S (2022) khi so sánh NGS và EGFR Cobas V2 ở 200 BN

UTPKTBN cho thấy tỉ lệ phù hợp cao với cobas® EGFR trong việc phát hiện

đột biến EGFR. Tỉ lệ phù hợp và hệ số kappa lần lượt là 97,5% và 0,93 [62].

Nhiều nghiên cứu cho thấy quần thể BN UTBM tuyến ở người sắc tộc

Đông Á, nữ giới, không hút thuốc thường có xu hướng đáp ứng tốt hơn đối

với các thuốc EGFR TKI. Hầu hết các BN này đều có đột biến gen EGFR. Tỉ

lệ đột biến được ghi nhận là 33% trong số những BN sắc tộc Đông Á, trong

khi đó chỉ có khoảng 8% đột biến là gặp trên BN nguồn gốc khác. Đột biến

EGFR thường gặp ở nữ giới nhiều hơn nam giới (38% so với 10%) và những

người không hút thuốc gặp nhiều hơn người từng hút thuốc (54% so với 16%)

[94].

1.4.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam:

Hoàng Anh Vũ (2011) xác định đột biến của EGFR và KRAS bằng kỹ

thuật giải trình tự chuỗi DNA ở 71 BN UTPKTBN, kết quả ghi nhận đột biến

EGFR chiếm 42%, đột biến KRAS chiếm 46,5%. Có 12/71 trường hợp mang

cùng lúc đột biến của cả 2 gen này. Vì thế cho thấy BN Việt Nam bị

UTPKTBN có tần suất đột biến EGFR và KRAS cao nhưng hai đột biến

không loại trừ lẫn nhau. Giải trình tự chuỗi DNA để chẩn đoán đột biến gen

có thể giúp chọn lựa bệnh nhân phù hợp cho điều trị EGFR TKI [15].

34

Năm 2014, nghiên cứu Pioneer xác định tần suất đột biến gen EGFR

trên 1482 bệnh nhân UTPKTBN thể biểu mô tuyến từ 51 trung tâm ở 7 nước

châu Á. Tỷ lệ đột biến gen EGFR của Việt Nam là 64,2%, cao nhất trong các

nước tham gia nghiên cứu. Trong đó, tỉ lệ đột biến mất đoạn tại exon 19 là

27,5%, đột biến L858R exon 21 là 12,5%, còn các đột biến kháng thuốc như

T790M exon 20, S768I exon 20, đột biến thêm đoạn exon 20 …chiếm 8,3%.

Do sử dụng kỹ thuật Scorpion ARMS nên nghiên cứu Pioneer không phát

hiện ra đột biến mới [92].

Nguyễn Minh Hà (2014) nghiên cứu bằng hai kỹ thuật giải trình tự gen

và Scorpion ARMS cho thấy tỉ lệ đột biến EGFR là 58,6%, tỉ lệ đột biến

LREA (exon 19) và L858R (exon 21) là 48,2% và 40,7%, các đột biến khác

chiếm 12,1%. Đột biến tăng tính nhạy với thuốc EGFR TKI chiếm 97,0% còn

đột biến kháng EGFR TKI chiếm 3%. Tỉ lệ đột biến KRAS là 15,5% với tỉ lệ

đột biến tại codon 12 là 82,2% và tại codon 13 là 17,8% [3].

Nguyễn Thị Băng Sương (2020) nghiên cứu 319 mẫu mô u được cố định

bằng paraffin (FFPE) từ các BN UTPKTBN. Phân tích đột biến ở exon 18-21

của gen EGFR bằng phương pháp Realtime-PCR trên bộ kit therascreen EGFR

RGQ PCR Kit V2 và EGFR Cobas V2. Kết quả cho thấy 43,3% bệnh nhân có

đột biến EGFR, các đột biến phổ biến nhất là del19 và L858R chiếm 51,4% và

38,4%; ins20 (3,6%), G719X (2,1%), T790M (2,1%), S768I (2,1%) và

L861Q (0,7%) [11].

Phạm Thị Mai (2021) nghiên cứu tiến cứu, mô tả 149 bệnh nhân

UTBM tuyến điều trị nội trú tại bệnh viện Quân Y 103 và bệnh viện K3. Tỉ lệ

đột biến gen EGFR là 39,6%, đột biến nhạy thuốc chiếm 86,4%, đột biến

exon 19 là 50,8%, exon 21 là 35,6%, đột biến kép trên cả 2 exon là 5,1%. Tỉ

lệ đột biến gen EGFR xảy ra cao hơn ở nhóm bệnh nhân nữ, tiền sử không hút

35

thuốc. Một số triệu chứng ho khan, đau ngực, khó thở hoặc cơ quan di căn xa

không ảnh hưởng tới tỉ lệ đột biến gen EGFR [8].

Nguyễn Thị Thái Hòa (2021) mô tả hồi cứu ở BN UTPKTBN giai IV

có đột biến EGFR hiếm hoặc kép. Kết quả cho thấy các vị trí đột biến hiếm

gặp trong nghiên cứu là: G719X, S768I, L861Q. Đột biến kép chiếm 24%. Tỉ

lệ đáp ứng và kiểm soát bệnh với TKI thế hệ 1 là 41,7% và 66,7%; với TKI

thế hệ 2 là 82,3% và 88,2%. TKI thế hệ 1 và 2 có hiệu quả ở một số đột biến

EGFR hiếm và kép, TKI thế hệ 2 có tỷ lệ đáp ứng và kiểm soát bệnh cao hơn

TKI thế hệ 1 [4].

Trần Huy Thịnh (2022) nghiên cứu trên 35 BN UTPKTBN, sử dụng

kỹ thuật Realtime PCR và FISH để xác định đột biến gen EGFR, và đột biến

dung hợp gen EML4-ALK, ROS1. Kết quả cho thấy 51,1% bệnh nhân

UTPKTBN có đột biến exon 19, 20, 21 của gen EGFR, 6,7% bệnh nhân

UTPKTBN có đột biến dung hợp gen EML4-ALK, 2,2% bệnh nhân

UTPKTBN có đột biến dung hợp gen ROS1 [13].

36

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

Đây là một nghiên cứu có thiết kế cắt ngang mô tả.

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bệnh nhân ung thư phổi đến khám và điều trị tại Bệnh viện Phạm Ngọc

Thạch, thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu, được giải thích và mời tham gia nghiên

cứu.

2.2.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

+ Bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định UTPKTBN giai đoạn IIIB-IV

(theo tiêu chuẩn của AJCC VII [34])

+ Bệnh nhân chưa điều trị đích, hóa trị, xạ trị.

+ Bệnh nhân đủ hoặc trên 18 tuổi.

+ Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu.

2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ

+ Bệnh nhân không có mô bệnh phẩm.

2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2018 đến tháng 9/2020 tại khoa

ung thư bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.

2.4. CỠ MẪU CỦA NGHIÊN CỨU

2.4.1. Cỡ mẫu cho mục tiêu 1, 2: khảo sát đồng thời các đột biến gen bằng

NGS mô u và so sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến EGFR giữa

NGS mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2

Cỡ mẫu được tính theo công thức [78]

37

Trong đó:

n là cỡ mẫu nhỏ nhất phải đạt được.

Z1-α/2: 1,96 với α: Xác suất sai lầm loại I (mức ý nghĩa), α = 0,05.

d: sai số cho phép là 0,1

Dựa trên tỉ lệ đột biến của 6 gen trong UTPKTBN và tỉ lệ tương đồng của NGS mô u và Cobas:

+ p: 42% là tỉ lệ đột biến EGFR của bệnh nhân UTPKTBN Việt Nam, lấy từ nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ [15].

+ p: 6,7% là tỉ lệ đột biến ALK của bệnh nhân UTPKTBN lấy từ nghiên cứu của Soda M [97].

+ p: 3,4% là tỉ lệ đột biến ROS1 của bệnh nhân UTPKTBN lấy từ

nghiên cứu của Kim H.R [49].

+ p: 3% là tỉ lệ đột biến BRAF của bệnh nhân UTPKTBN lấy từ nghiên

cứu của Davies H [28].

+ p: 15,5% là tỉ lệ đột biến KRAS của bệnh nhân UTPKTBN lấy từ

nghiên cứu của Nguyễn Minh Hà [2]

+ p: 97,5% là tỉ lệ tương đồng giữa NGS mô u và EGFR Cobas V2

trong phát hiện đột biến các gen EGFR lấy từ nghiên cứu của

Murakami S [62].

 Như vậy, cỡ mẫu chung cần ít nhất là 94 bệnh nhân có mẫu mô phù hợp.

2.4.2. Cỡ mẫu cho mục tiêu 3: So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen giữa NGS sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2

Cỡ mẫu được tính theo công thức [78]

38

Trong đó:

n là cỡ mẫu nhỏ nhất phải đạt được.

Z1-α/2: 1,96 với α: Xác suất sai lầm loại I (mức ý nghĩa), α = 0,05.

d: sai số cho phép là 0,1.

Dựa trên tỉ lệ tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và các phương pháp

+ p: 95% là tỉ lệ tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và mô u trong

phát hiện đột biến các gen EGFR, BRAF, KRAS lấy từ số liệu của

Remon J [84].

+ p: 91% là tỉ lệ tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và ddPCR trong

phát hiện đột biến các gen EGFR lấy từ số liệu của Stitz R [100].

+ p: 82% là tỉ lệ tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và EGFR Cobas

V2 trong phát hiện đột biến các gen EGFR lấy từ số liệu của

Papadopoulou E [72].

 Như vậy, cỡ mẫu chung cần ít nhất là 57 bệnh nhân có mẫu máu.

2.5. XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU

Các biến số trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1. Các biến số sử dụng trong nghiên cứu

Tên biến số Đo lường

Tuổi Loại biến số Liên tục

Xác định bằng số năm dương lịch, tính ở thời điểm bệnh nhân được thu nhận vào nghiên cứu.

Giới tính Nhị giá Nam, Nữ

Hút thuốc lá Nhị giá Có, Không

Giai đoạn bệnh Nhị giá IIIB, IV

39

Giải phẫu bệnh Định danh UTBM tuyến, UTBM vảy, UTBM tế bào lớn,

UTBM tuyến vảy

Đột biến EGFR Định danh

Đột biến KRAS Định danh

Đột biến ALK Định danh L858R, Del19, Ins20, H773A, L768C, G719A, G719S, G719C, G719D, G719R, L861P, L861Q, L861R,... G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13C, G13R, G13S, G13A, G13D, G13V, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R Q61H), K117N, Q22K, ... ALK-EML4 fusion

Đột biến ROS1 Định danh CD74 |SLC34A2|SDC4|EZR|TPM3|FIG|LRIG3

fusions

Đột biến BRAF Định danh V600E, G499,…

Đột biến NRAS Định danh

G12C, G12S, G12A, G12D, G12V), G13S, G13C, G13S, Q61K, Q61R,...

2.6. PHƯƠNG PHÁP, CÔNG CỤ ĐO LƯỜNG, THU THẬP SỐ LIỆU

2.6.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

- Hệ thống máy giải trình tự Nextseq 550 (Illumina).

- Máy cô đặc Micro-cenvac (N-biotek).

- Máy

ly tâm Centrifuge 5702R (Eppendorf) và Centrifuge 5415R

(Eppendorf), Centrifuge 5424 (Eppendorf).

- Máy PCR Mastercycler Nexus X2 (Eppendorf).

- Máy vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS), máy lắc (VXR basic Vibrax®

IKA).

- Tủ đông sâu -20 oC, -80oC; tủ mát 4oC.

- Pipet 1000 μl, 200 μl, 100 μl, 10 μl, 2,5 μl.

- Eppendorf 1,5 ml; 0,2 ml; falcon 15 ml, 50 ml.

- Hóa chất dùng để tách chiết cfDNA: Magmax™ Cell-free DNA Isolation

40

Kit (Applied Biosystem).

- Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ mẫu mô u: FFPE Tissue Kit (Qiagen).

- Hóa chất dùng để đo nồng độ tách chiết DNA: Quantus™ FluoroMETer

(Promega).

- Hóa chất dùng để chuẩn bị thư viện: NEBNext® Ultra™ II FS DNA

Library Prep Kit for Illumina (Biolab); xGen Lockdown Probes and Reagents

(IDT).

- Hóa chất gắn UID: Accel-NGS® 2S DNA Library Kits (Swift

Biosciences).

- Hóa chất giải trình tự: NextSeq 500/550 Mid Output v2 kit (150 cycles).

Hình 2.1: Hệ thống máy giải trình tự Nextseq 550 (Ilumina/Mỹ)

2.6.2. Giải trình tự gen thế hệ mới

Giải trình tự gen thế hệ mới được thực hiện tại Trung tâm y sinh học

phân tử Đại học y dược TP.HCM và Viện di truyền y học. Quy trình thực hiện

được tiến hành theo kết quả công trình nghiên cứu “ Xây dựng quy trình

phát hiện đột biến gen từ mẫu sinh thiết lỏng bằng công nghệ giải trình tự

gen thế hệ mới với ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư ” thuộc

sở khoa học công nghệ TP. Hồ Chí Minh [10].

41

2.6.2.1. Xử lý mẫu sinh thiết mô và sinh thiết lỏng

- Xử lý mẫu mô: mẫu mô sử dụng là mẫu mô u được cố định bằng

paraffin (FFPE). Nghiên cứu dùng cùng một mẫu mô được xét nghiệm EGFR

Cobas V2 để giải trình tự gen thế hệ mới. Vùng mô ung thư được đánh dấu trên

lam giải phẫu bệnh để phân biệt với vùng mô lành xung quanh (từ 5-10 tiêu

bản), sau đó được cạo vào ống 1,5 ml bằng luỡi dao phẫu thuật vô trùng.

Những trường hợp mẫu sinh thiết quá nhỏ, hoặc không phân biệt vùng mô ung

thu hay mô lành thì mẫu sinh thiết đuợc thu nhận toàn bộ. Mẫu mô u sau khi

cạo sẽ được trữ ở -80°C.

- Xử lý mẫu sinh thiết lỏng: mẫu máu thu nhận là 10 ml máu ngoại

biên. Mẫu máu được trữ trong ống EDTA Vacutainer (Becton Dickinson) và

giữ mát tại 4oC. Nếu chưa xử lý kịp thời có thể lữu mẫu trong 6 giờ ở 4oC.

Mẫu máu được ly tâm 2 đợt để tách huyết tương. Đầu tiên ly tâm ống máu tại

2.500 xg trong 10 phút ở 4oC. Sau đó nhẹ nhàng chuyển lớp huyết tương phía

trên vào mỗi ống 2 ml, tránh không chạm pipette vào lớp phân cách. Ly tâm

lần hai ống 2ml chứa huyết tương vừa thu được tại 16.000 xg trong 10 phút ở

4oC. Nhẹ nhàng thu dịch nổi phía trên vào ống LoBind 1,5 ml, tránh không

chạm pipette vào tủa tế bào. Mẫu huyết tương sẽ được kiểm tra hiện tượng

tiêu máu sau khi tách và được trữ ở -80 oC

2.6.2.2. Tách chiết DNA từ mẫu sinh thiết mô và sinh thiết lỏng

 Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô u

DNA từ mô u được tách chiết bằng bộ kit QiaAmp DNA FFPE kit

(Qiagen). gDNA được dung giải trong 20 µl elution buffer. Quy trình thực

hiện theo hướng dẫn của bộ kit như sau:

(1) Dùng xylene để ly giải paraffin và loại bỏ phần dịch nổi bằng phương

pháp ly tâm tốc độ cao;

42

(2) Rửa phần mô u bằng dung dịch ethanol 96-100% trước khi huyền phù

hoá bằng buffer ATL và proteinase K để phá vỡ tế bào và ly giải DNA bộ gen

(3) Chuyển dịch huyền phù có chứa DNA lên cột thu hồi MinElute và thực

hiện qua các bước rửa theo hướng dẫn chi tiết;

(4) Thu hồi DNA bộ gen trong 20uL dịch dung giải ATE và lưu trữ ở -

20oC.

 Quy trình tách chiết cfDNA từ mẫu sinh thiết lỏng

cfDNA được tách chiết từ 1 ml huyết tương cho mỗi bệnh nhân

NSCLC bằng bộ kít Magmax™ Cell-free DNA Isolation Kit (Applied

Biosystem) và dung giải trong 30µl elution buffer. Quy trình thực hiện như

sau:

(1) Ly giải dung dịch huyết tương và buffer Lysis/Binding Solution theo tỉ

lệ 1:1,25, sau đó gắn với 15uL hạt từ;

(2) Rửa hai lần với buffer Wash solution;

(3) Rửa hai lần với dung dịch Ethanol 80% và tiến hành làm khô ở nhiệt độ

phòng trong 3-5 phút;

Thu hồi cfDNA bằng 30uL dịch dung giải Elution solution cung cấp trong

bộ kit và lưu trữ ở -20oC

 Định lượng DNA sau khi tách chiết

DNA sau khi tách chiết được định lượng bằng bộ kit QuantiFluor®

dsDNA System. Quy trình thực hiện như sau:

(1) Pha loãng 20X TE buffer thành 1X với nước nuclease-free.

(2) Pha loãng QuantiFluor® dsDNA Dye 1:400 trong TE buffer.

(3) Chuẩn bị mẫu blank: trộn 2 μl 1X TE buffer vào 199 μl QuantiFluor®

dsDNA Dye đã pha loãng vào ống PCR 0,5 ml.

(4) Chuẩn bị mẫu chuẩn: trộn 2 μl DNA Standard (100ng/µl) vào 199 μl

QuantiFluor® dsDNA Dye đã pha loãng vào ống PCR 0,5 ml.

43

(5) Chuẩn bị mẫu đo: trộn 2 μl mẫu đo vào 199 μl QuantiFluor® dsDNA

Dye đã pha loãng vào ống PCR 0,5 ml.

(6) Vortex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút (tránh ánh sáng).

(7) Đo nồng độ của từng ống và lưu lại số liệu cho từng mẫu.

2.6.2.3. Chuẩn bị thư viện

 Chuẩn bị thư viện cho mẫu DNA tách từ mô u

DNA sau khi tách chiết được chuẩn bị thư viện bằng bộ kit NEBnext

dsDNA fragmentase và NEBnext Multiplex Oligos Dual bao gồm các bước:

phân cắt DNA thành từng phân mảnh, chỉnh sửa hai đầu mút (khử phosphryl

hóa và gắn đuôi dA), gắn NEBNext Adaptor và dùng USER enzyme để cắt

vòng chữ U ở hai đầu. DNA sau khi được phân cắt, chỉnh sửa và gắn adaptor

sẽ được chọn lọc kích thước bằng KAPA Pure Beads (KAPA biosystems) để

có được DNA với kích thước trong khoảng 250-450 bp. Sản phẩm sau khi

được chọn lọc sẽ được khuếch đại qua PCR bằng cặp mồi P5 index (chứa

trình tự mã hóa mẫu) và P7 adapter.

 Cắt nhỏ và sửa đuôi DNA

DNA được phân cắt thành những đoạn nhỏ và chỉnh sửa hai đầu mút để

tạo đầu bằng. Quy trình thực hiện như sau:

(1) Chuẩn bị thành phần hóa chất cho phản ứng cắt và sửa đuôi

(2) Vortex 5 giây.

(3) Ủ với chu kỳ nhiệt như sau: 37oC trong 15 phút, 65 oC trong 30 phút,

giữ 4 oC.

 Nối các đoạn adaptor

Sản phẩm DNA sau khi được phân cắt và chỉnh sửa hai đầu mút sẽ

được nối với NEBNext adaptor. Quy trình thực hiện như sau:

(1) Pha loãng NEBNext adaptor 10 lần với 10nM Tris-HCl, 10nM NaCl

44

pH8.

(2) Chuẩn bị thành phần hóa chất cho phản ứng nối đoạn adaptor.

(3) Trộn đều hỗn hợp bằng cách pipette lên và xuống.

(4) Ủ ở 20oC trong 15 phút.

(5) Thêm 3 µl USER enzyme.

(6) Trộn đều hỗn hợp bằng cách pipette lên và xuống.

(7) Ủ ở 37oC trong 15 phút. Sản phẩm có thể trữ qua đêm ở -20oC.

 Chọn lọc kích thước sau khi gắn adaptor

Sản phẩm DNA sau khi được phân cắt, chỉnh sửa và gắn adaptor sẽ

được chọn lọc kích thước bằng KAPA Pure Beads (KAPA biosystems) để có

được DNA với kích thước trong khoảng 250-450. Quy trình thực hiện như

sau:

(1) Thêm 28.5µl H20.

(2) Thêm 60µl KAPA Pure Beads (0.6X) (chọn lọc kích thước >450 bp).

Trộn đều bằng cách pipette lên xuống. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15 phút.

(3) Đặt lên giá từ và đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ được giữ

lại, cẩn thận chuyển dịch nổi sang ống mới.

(4) Thêm 30µl KAPA Pure Beads (0.9X) (chọn lọc kích thước >250 bp).

(5) Trộn đều bằng cách pipette lên xuống. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15

phút.

(6) Đặt lên giá từ và đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ được giữ

lại, hút bỏ dịch nổi bằng pipette. Tránh chạm pipette vào hạt từ.

(7) Thêm 200µl ethanol 80%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, loại bỏ

dịch nổi.

(8) Lặp lại bước (4).

(9) Ly tâm ngắn, dùng pipette 10 µl để loại bỏ hoàn toàn ethanol 80%.

45

(10) Giữ ống trên giá từ, để khô hạt từ trong 3-5 phút.

(11) Thêm 15μl TE 0.1X. Vortex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15 phút.

(12) Đặt ống lên giá từ, chuyển 15 μl dịch sang ống mới.

 Khuếch đại và tinh sạch thư viện DNA

Sản phẩm DNA sau khi được chọn lọc kích thước sẽ được khuếch đại

qua PCR bằng cặp mồi P5 index (chứa trình tự mã hóa mẫu) và P7 adapter. Sản

phẩm sau khi PCR sẽ được tinh sạch bằng KAPA Pure Beads.

- Khuếch đại thư viện DNA:

(1) Chuẩn bị hỗn hợp khuếch đại thư viện DNA.

(2) Ly tâm ngắn.

(3) Ủ với chu kỳ nhiệt như sau: 98oC - 30 giây, 12 chu kỳ (98oC - 10

giây, 65 oC – 75 giây), 65 oC – 5 phút, 4 oC – giữ.

- Tinh sạch thư viện DNA

Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại sẽ được tinh sạch bằng KAPA Pure

Beads (KAPA biosystems). Quy trình thực hiện như sau:

(1) Thêm 45µl KAPA Pure Beads (0,9X).

(2) Trộn đều bằng cách pipette lên xuống. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15

phút.

(3) Đặt lên giá từ và đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ được giữ

lại, hút bỏ dịch nổi bằng pipette. Tránh chạm pipette vào hạt từ.

(4) Thêm 200µl ethanol 80%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, loại bỏ

dịch nổi.

(5) Lặp lại bước (4).

(6) Ly tâm ngắn, dùng pipette 10 µl để loại bỏ hoàn toàn ethanol 80%.

(7) Giữ ống trên giá từ, để khô hạt từ trong 3-5 phút.

46

(8) Thêm 30μl TE 0,1X. Vortex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15 phút.

(9) Đặt ống lên giá từ, chuyển 30 μl dịch sang ống mới. Trữ mẫu ở -

20oC.

 Chuẩn bị thư viện cho mẫu cfDNA tách từ sinh thiết lỏng

cfDNA tách chiết được chuẩn bị thư viện bằng bộ kit Accel-NGS 2S

DNA Library Kit. Quy trình bao gồm 4 bước ủ: sửa chữa 2 đầu 5’ và 3’, gắn

adaptor ở hai đầu mút 3’ (P7) và 5’ (P5) cho mỗi phân mảnh dsDNA. Giữa

các bước ủ, mẫu sẽ được tinh sạch bằng hạt từ để loại bỏ các oligonucleotides,

các mảnh nhỏ, và để thay đổi thành phần đệm enzyme.

 Sửa chữa đầu mút lần 1:

(1) Chuyển 40µl cfDNA sang ống PCR 0,2mL (thêm Low EDTA TE nếu

cần thiết).

(2) Thêm 20µl hỗn hợp Master Mix

(3) Trộn đều bằng cách pipette, và ủ với chu kỳ nhiệt như sau: 37˚C, 5

phút, 65˚C, 2 phút, 37˚C, 5 phút.

(4) Thêm 84μl KAPA Pure Beads (được làm ấm ở nhiệt độ phòng) vào

mỗi hỗn hợp phản ứng. Và tiến hành các bước tinh sạch như sau:

(4a) Pipette lên xuống nhiều lần cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ ở nhiệt

độ phòng 5- 15 phút.

(4b) Ly tâm nhanh, đặt lên giá từ và đợi đến khi dịch trong suốt và hạt từ

được giữ lại, hút bỏ dịch nổi bằng pipette. Tránh chạm pipette vào hạt từ.

(4c) Thêm 200µl ethanol 80%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, loại bỏ

dịch nổi.

(4d) Lặp lại bước (4c).

(4e) Ly tâm ngắn, dùng pipette 10 µl để loại bỏ hoàn toàn ethanol 80%.

(4f) Giữ ống trên giá từ, để khô hạt từ trong 3-5 phút

47

 Sửa chữa đầu mút lần 2:

(1) Thêm 50µl hỗn hợp Master Mix vào mẫu và pipette cho đến khi hỗn

hợp đồng nhất.

(2) Ủ với chu kỳ nhiệt 20 ˚C trong 20 phút (tắt chế độ làm nóng nắp)

(3) Thêm 60μl PEG NaCl và tiến hành các bước tinh sạch tương tự ở bước

sửa chữa đầu mút lần 1.

 Gắn adaptor ở đầu 3’

Sản phẩm DNA sau khi được chọn lọc kích thước sẽ được khuếch đại qua

PCR

(1) Thêm 25µl hỗn hợp Master Mix vào mẫu.

(2) Thêm 5µl indexed Reagent Y2 và trộn đều bằng cách pipette.

(3) Ủ với chu kỳ nhiệt 25 ˚C trong 15 phút (tắt chế độ làm nóng nắp).

(4) Thêm 31,5μl PEG NaCl và tiến hành các bước tinh sạch tương tự ở

bước sửa chữa đầu mút lần 1.

 Gắn adaptor ở đầu 5’

Sản phẩm DNA sau khi được chọn lọc kích thước sẽ được khuếch đại

qua PCR bằng cặp mồi P5 index (chứa trình tự mã hóa mẫu) và P7 adapter. Sản

phẩm sau khi PCR sẽ được tinh sạch bằng KAPA Pure Beads.

(1) Thêm 48µl hỗn hợp Master Mix vào mẫu.

(2) Ủ với chu kỳ nhiệt 40˚C trong 10 phút (tắt chế độ làm nóng nắp).

(3) Thêm 52,5μl PEG NaCl và tiến hành các bước tinh sạch tương tự ở

bước sửa chữa đầu mút lần 1.

(4) Tái huyền phù hạt từ với 50µl Low EDTA TE buffer, ủ trong 1-2 phút.

(5) Thêm 52,5µl PEG NaCl solution. Tiến hành bước tinh sạch lần 2 tương

tự ở bước sửa chữa đầu mút lần 1.

(6) Tái huyền phù hạt từ trong 20µl Low EDTA TE buffer, ủ trong 2 phút.

48

(7) Ly tâm nhẹ và đặt ống mẫu lên giá từ. Chuyển 20µl hỗn hợp dịch có

chứa mẫu sang ống PCR 0,2ml mới.

 Khuếch đại

(1) Thêm 30 µl hỗn hợp Optional PCR Master Mix vào ống PCR 0,2 ml

có chứa mẫu. Trộn đều bằng cách pipette.

(2) Ủ với chu kỳ nhiệt như sau: 98ºC trong 30 giây, 14 chu kỳ ( 98 ºC

trong 10 giây, 60ºC trong 30 giây, 68ºC trong 60 phút), giữ tại 4ºC.

Ngay lập tức chuyển sang bước tinh sạch.

(3) Thêm 37,5μl KAPA Pure Beads và tiến hành bước tinh sạch tương tự

ở bước sửa chữa đầu mút lần 1.

(4) Tái huyền phù hạt từ bằng 20µl of Low EDTA TE buffer. Ủ trong 2

phút.

(5) Ly tâm nhẹ đặt lên giá từ. Chuyển 20µl dịch nổi sang ống 1,5 ml. Bảo

quản ở -20oC

2.6.2.4. Làm giàu các phân mảnh DNA từ gen mục tiêu

Sản phẩm PCR từ bước tạo thư viện sẽ được tiến hành lai với hỗn

hợp mẫu dò có chứa gen và gắn biotin đặc hiệu cho các gen mục tiêu. Quy

trình sử dụng theo bộ kit xGen Lockdown Reagents. Các mẫu dò được

thiết kế và tổng hợp bởi xGen panel (IDT).

 Đông khô hỗn hợp thư viện DNA

Thư viện DNA từ mỗi mẫu sẽ được trộn chung với nhau, human cot -1

DNA và xGen Universal Blockers sẽ được thêm vào để khóa những vùng lặp

lại trên bộ gen và khóa hai đầu adaptor để làm giảm tỉ lệ bắt cặp không đặc

hiệu. Sau đó, hỗn hợp tiến hành đông khô. Quy trình thực hiện như sau:

(1) Chuẩn bị hỗn hợp đông khô thư viện DNA

(2) Làm khô hỗn hợp bằng cách dùng máy SpeedVac tại nhiệt độ <70oC

49

hoặc thấp hơn.

 Lai với mẫu dò

Sản phẩm từ bước đông khô sẽ tiến hành lai với hỗn hợp mẫu dò có

chứa gen EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, ALK và ROS1. Quy trình thực hiện

như sau:

(1) Thêm 8,5µL 2X Hybridization Buffer + 2,7µL Hybridization Buffer

Enhancer + 1,8µL Nuclease-Free Water vào sản phẩm đông khô.

(2) Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.

(3) Trộn đều hỗn hợp bằng cách pipette lên xuống và ly tâm ngắn.

(4) Ủ ở 95oC trong 10 phút.

(5) Di chuyển ống chứa mẫu ra khỏi máy ủ và ngay lập tức cho 4µL xGen

Lockdown Probe pool.

(6) Vortex và ly tâm ngắn.

(7) Ủ ở 65 oC trong vòng 4 giờ.

 Chuẩn bị dung dịch rửa

(1) Pha loãng xGen buffer

(2) Ủ 100µL 10X Wash Buffer I và 400 µL 10X Stringent Wash Buffer

ở 65oC ít nhất 2 tiếng trước khi rửa streptavidin beads.

(3) Giữ các buffer khác ở nhiệt độ phòng.

 Chuẩn bị hạt từ Streptavidin

(1) Để hạt từ Dynabeads M-270 Streptavidin ở nhiệt độ phòng trong 30

phút trước khi rửa.

(2) Trộn đều bead bằng cách vortex.

(3) Chuyển 100µL/phản ứng vào ống Low-bind. Đặt trên giá từ và đợi đến

khi đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ được giữ lại, hút bỏ dịch nổi

bằng pipette. Tránh chạm pipette vào hạt từ.

50

(4) Thêm 200µL Bead Wash Buffer, vortex 10 giây.

(5) Đặt trên giá từ và đợi đến khi đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ

được giữ lại, hút bỏ dịch nổi bằng pipette. Tránh chạm pipette vào hạt từ.

(6) Lặp lại bước (4) và (5).

(7) Thêm 100µL Bead Wash Buffer, huyền phù và chuyển dịch sang ống

Low-bind 0,2 ml.

(8) Đặt lên giá từ và đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ được giữ lại,

hút bỏ dịch nổi bằng pipette. Tránh chạm pipette vào hạt từ.

 Gắn biotin đặc hiệu cho các gen mục tiêu

(1) Chuyển sản phẩm lai vào streptavidin bead vừa mới chuẩn bị.

(2) Trộn đều bằng cách pipette.

(3) Ủ ở 65oC ở 45 phút. Sau mỗi 12 phút, tiến hành vortex.

 Rửa streptavidin bead để loại bỏ DNA không được bắt giữ

Rửa ở 65oC:

(1) Thêm 100μl 1X Wash Buffer I ủ ở 65oC đã chuẩn bị

(2) Chuyển hỗn hợp sang Low-bind 1,5 ml, vortex nhanh.

(3) Đặt lên giá từ, ủ 5 phút. Loại bỏ dịch nổi

(4) Thêm 200μl 1X Stringent Wash Buffer, pipette lên xuống nhẹ nhàng,

tránh tạo bọt khí.

(5) Ủ ở 65oC trong 5 phút.

(6) Đặt lên giá từ, ủ 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.

(7) Lặp lại bước (4), (5) và (6).

Rửa ở nhiệt độ phòng:

(8) Thêm 200μl 1X Wash Buffer I (giữ ở nhiệt độ phòng), vortex trong 2

phút.

(9) Đặt lên giá từ, ủ 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.

51

(10) Thêm 200μl 1X Wash Buffer II, vorter trong 1 phút.

(11) Đặt lên giá từ, ủ 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.

(12) Thêm 200μl 1X Wash Buffer III (giữ ở nhiệt độ phòng), vortex trong

30 giây.

(13) Đặt lên giá từ, ủ 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.

(14) Thêm 20µL Nuclease-Free Water vào hạt từ. Pipette lên xuống 10

lần và chuyển sang bước khuếch đại.

 Khuếch đại sản phẩm lai

(1) Thêm 25µL 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix + 2,5µL 10 µM

Illumina P5 primer + 2,5µL 10 µM Illumina P7 primer vào hạt từ.

(2) Vortex và ly tâm ngắn.

(3) Ủ theo chu kỳ nhiệt như sau: 98oC - 45 giây, 14 chu kỳ (98oC - 15

giây, 60 oC – 30 giây, 72 oC – 30 giây, 70 oC – 1 phút), 4 oC – giữ.

2.6.2.5. Xác định độ sâu tối thiểu (coverage) và ngưỡng giới hạn phát

hiện đột biến (LOD - Limits of Detection)

Độ sâu của giải trình tự là tổng dung lượng giải trình tự cần cho một

mẫu, ví dụ nếu tổng dung lượng giải trình tự là 300 Mbp cho một vùng có

kích thước 30.000 bp, nghĩa là trung bình mỗi nucleotit trong vùng gen mục

tiêu được giải 10.000 lần, đây được gọi là độ sâu của giải trình tự (10.000X).

Khi độ sâu càng tăng, càng nhiều phân tử DNA được giải trình tự; vì vậy làm

tăng xác suất ctDNA (DNA ngoại bào phóng thích từ khối u mang đột biến)

hiện diện tại nồng độ thấp được giải trình tự và nhận diện. Tuy nhiên, việc sử

dụng độ sâu càng cao sẽ càng làm tăng chi phí giải trình tự. Vì vậy, việc xác

lập độ sâu tối thiểu sẽ phụ thuộc vào ngưỡng cắt của độ nhạy và chi phí. Để

xác định ngưỡng giới hạn phát hiện đột biến, chúng tôi sử dụng các DNA

chứng dương từ các dòng tế bào mang đột biến đã biết và trộn với DNA

không mang đột biến để tạo các tần suất đột biến khác nhau: 5%, 2,5% và 1%.

52

 Phân cắt và chọn lọc kích thước gDNA từ chứng dương

Chứng dương có mang biến đổi di truyền trên 6 gen mục tiêu sẽ được

sử dụng để đánh giá quy trình sinh thiết lỏng. Ở đây chúng tôi sử dụng Tru-

Q1 và EML4-ALK Reference Standard từ hãng Horizon làm chứng dương.

Bảng 2.2. Các dòng tế bào mang đột biến được khảo sát trong nghiên cứu

Dòng tế bào SW48 A549 H2228 H1666 HCC78 SK-MEL-2

Gen EGFR KRAS ALK BRAF ROS1 NRAS

Dạng đột biến G719S G12S dung hợp gen EML4-ALK G466V dung hợp gen SLC34A2-ROS1 Q61K

(1) Tru-Q 1 (5% Tier) Reference Standard (Horizon), có chứa các đột

biến trên các gen cần khảo sát được mô tả ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thông tin chứng dương Tru-Q 1

Gen

Biến thể

BRAF BRAF EGFR EGFR KRAS KRAS KRAS NRAS

V600E V600K G719S T790M G12A G12R G13D Q61K

Tần suất đột biến 8% 4% 16.7% 4.2% 5% 5% 25% 5%

Nhiễm sắc thể 7q34 7q34 7p12 7p12 12p12.1 12p12.1 12p12.1 1p13.2

(2) EML4-ALK Reference Standard có chứa tần suất đột biến 50%.

gDNA từ các chứng dương mang đột biến và từ mẫu không mang đột

biến sẽ được phân cắt bằng bộ kit NEBnext dsDNA fragmentase. Quy trình

thực hiện như sau:

(1) Chuẩn bị hỗn hợp sau: 8μl DNA (0,5μg) + 1μl Fragmentase reaction

buffer + 1μl Fragmentase enzyme mix + 0,5μl MgCl2 200mM.

53

(2) Trộn đều bằng cách piptte lên xuống và ly tâm ngắn (giữ mẫu trên đá).

(3) Ủ trong 30 phút ở 37 oC.

Sản phẩm sau khi phân cắt sẽ được chọn lọc kích thước để có được DNA

với kích thước trong khoảng 150-450 bp tương ứng với kích thước của

cfDNA trong máu. Quy trình thực hiện như sau:

(1) Thêm 37µl H20.

(2) Thêm 30µl KAPA Pure Beads (chọn lọc kích thước >450 bp). Trộn

đều bằng cách pipette lên xuống. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15 phút.

(3) Đặt lên giá từ và đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ được giữ

lại, cẩn thận chuyển dịch nổi sang ống mới.

(4) Thêm 45µl KAPA Pure Beads (chọn lọc kích thước >150 bp).

(5) Trộn đều bằng cách pipette lên xuống. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15

phút.

(6) Đặt lên giá từ và đợi cho đến khi dịch trong suốt và hạt từ được giữ

lại, hút bỏ dịch nổi bằng pipette. Tránh chạm pipette vào hạt từ.

(7) Thêm 200 µl ethanol 80%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, loại bỏ

dịch nổi.

(8) Lặp lại bước (4).

(9) Ly tâm ngắn, dùng pipette 10 µl để loại bỏ hoàn toàn ethanol 80%.

(10) Giữ ống trên giá từ, để khô hạt từ trong 3-5 phút.

(11) Thêm 20μl TE 0.1X. Vortex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5-15 phút

(12) Đặt ống lên giá từ, chuyển 20 μl dịch sang ống mới

 Pha loãng các tần suất đột biến

DNA phân cắt có chứa đột biến và không chứa đột biến sẽ được trộn

với nhau tại các nồng độ pha loãng: 5%, 2,5%, 1% để tạo nên những tần suất

54

đột biến khác nhau. Quy trình thực hiện như sau (các DNA đã được phân cắt,

chọn lọc kích thước và pha loãng về 0,2ng/µl):

Hỗn hợp DNA có các MAF khác nhau sẽ được tiến hành giải trình tự

trên hệ thống máy giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq (Illumina) sử dụng bộ

hóa chất NextSeq Mid Output kit (150 cycles) tại độ sâu tối thiểu 10.000X.

Nếu kết quả giải trình tự thấp hơn độ sâu tối thiểu thì mẫu sẽ được lặp lại giải

trình tự để đảm bảo độ sâu tối thiểu.

Quy trình giải trình tự NGS với độ sâu lớn của sinh thiết lỏng cho phép

phát hiện được đột biến ở cfDNA với giới hạn phát hiện (LOD - Limits of

Detection) là 1% (1 phân tử đột biến trên 100 phân tử DNA), ngoại trừ gen

EML4-ALK (phát hiện ở 2,5%).

Sinh thiết mô u được xem là chuẩn vàng cho giải phẫu bệnh và cho việc

xác định đặc tính di truyền của khối u. Tuy nhiên, quá trình cố định trong

formalin có thể gây tổn thương DNA như gây đứt gãy mạch DNA, “cross-

link” giữa DNA với DNA hay DNA với protein, gây biến đổi nucleotide (đặc

biệt C thành T và G thành A). Nghiên cứu trước đây cho thấy kết quả giải

trình tự của DNA tách chiết từ mô u (FFPE) với tần suất đột biến dưới 10%

có tín hiệu giả cao, trong khi trên 10% thì kết quả đột biến sẽ đáng tin cậy

[113]. Vì vậy, đối với mẫu sinh thiết mô u (FFPE), giới hạn phát hiện LOD là

10% (những biến thể có tần suất cao hơn 10% mới được xem là dương tính)

và được giải trình tự ở độ sâu tối thiểu 100x.

2.6.2.6. Giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq (Illumina)

Mẫu sinh thiết mô và sinh thiết lỏng sau khi được tách chiết, chuẩn bị

thư viện và làm giàu gen mục tiêu sẽ được tiến hành giải trình tự trên hệ thống

máy giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq (Illumina) sử dụng bộ hóa chất

NextSeq Mid Output kit (150 cycles). Trong đó mẫu sinh thiết mô sẽ được

55

giải trình tự ở độ sâu tối thiểu 100x, mẫu sinh thiết lỏng sẽ được giải trình tự ở

độ sâu tối thiểu 10.000x.

Giải trình tự gen thế hệ mới NextSeq gồm các bước: tạo cụm, giải trình

tự và phân tích. Mỗi bước diễn ra tự động trong lần chạy giải trình tự.

(1) Tạo cụm:

- Trên một tấm kính có các giếng phủ đầy các mồi bổ sung với P5 và P7, đã

cố định đầu 5' trên mặt giếng. DNA thư viện đã tạo ở trên được biến tính

thành mạch đơn và thả vào giếng để cho liên kết bổ sung với mồi.

- Mỗi mạch đơn DNA được nhân bản thành hàng triệu bản bằng kỹ thuật

PCR theo nguyên tắc “bắc cầu”, hình thành các cụm trình tự (cluster).

- Cắt và rửa loại bỏ mạch bổ sung (RV-ngược) và giữ lại mạch chính (Fw-

xuôi) để toàn bộ các trình tự trên cluster là 1 chiều phục vụ cho việc giải trình

tự chiều thứ nhất.

(2) Giải trình tự tại các cụm:

- Thả DNA polymerase và mồi vào (mồi lúc này gọi là Read1 Seq primer

bắt cặp bổ sung với PE adapter) cùng với 4 loại nucleotide gắn huỳnh quang

mang gốc khóa ở 3OH. Nucleotide bắt cặp bổ sung được gắn vào những phản

ứng tạm dừng lại.

- Tia Laser chiếu vào để kích thích phát huỳnh quang và một camera ghi lại

huỳnh quang tương ứng với nucleotide.

- Gốc khóa được cắt ra, huỳnh quang cũng bị loại bỏ và rửa gắn. Chu trình

lặp lại đến khi hết độ dài trình tự quan tâm (hết 1 chiều). Sản phẩm đọc chiều

1 được rửa đi.

- Tiếp tục bổ sung Index1 primer và các thành phần PCR, cơ chế giải trình

tự tương tự trên đến khi hết phần index, sản phẩm được rửa đi.

- Một lần nữa PCR bắc cầu lại được lặp lại tạo cụm, nhưng lần này DNA

gắn với mồi xuôi bị cắt và rửa trôi.

56

- Thả DNA và mồi Read2 Seq primer (bắt cặp với PE’ adapter) cùng với 4

loại nucleotide gắn huỳnh quang. Giải trình tự tiếp tục.

(3) Phân tích: khi tiến hành chạy, phần mềm điều khiển sẽ tự động truyền

các tệp kết quả đọc base (*.bcl) đến thư mục đầu ra được chỉ định để phân

tích dữ liệu. Phương pháp phân tích dữ liệu này phụ thuộc vào ứng dụng và

cấu hình hệ thống.

2.6.2.7. Phân tích kết quả giải trình tự

Quá trình phân tích kết quả giải trình tự được tiến hành theo các bước sau:

(1) Cặp trình tự (pair-end reads) được sắp xếp (align/map) lên trình tự bộ

gen của người phiên bản số 19 (human genome version hg19) bằng phần mềm

BWA. Những cặp trình tự sắp xếp duy nhất lên một vị trí trên bộ gen

(uniquely mapped pair-end reads) sẽ được sử dụng để xác định đột biến di

truyền.

(2) Đột biến điểm và đột biến mất/thêm đoạn ngắn được xác định bằng quy

trình tính toán VarScan 2 qua nhiều bước kiểm tra (xác định đột biến, tái sắp

xếp trình tự sau khi có đột biến, lặp lại bước xác định đột biến, chọn lọc đột

biến dựa trên độ sâu/tiêu chuẩn trình tự) để tăng độ tin cậy của mỗi đột biến

được tìm thấy.

(3) Đột biến chuyển đoạn và dung hợp đoạn được xác định bằng quy trình

FACTERA qua các bước:

i) Xác định những cặp trình tự sắp xếp bất hợp lý trên trình tự bộ gen người

(discordant reads) - đây là những trình tự bao phủ vùng chuyển đoạn và dung

hợp đoạn nên sẽ có chiều dài chèn bất thường, hay được sắp xếp trên 2 nhiễm

sắc thể khác nhau, những cặp trình tự này được dùng xác lập những vùng gen

có nhiều khả năng chuyển đoạn hay dung hợp đoạn;

ii) Xác định vị trí chuyển đoạn/dung hợp đoạn ở mức độ từng nucleotide -

những vùng gen có nhiều khả năng chuyển đoạn hay dung hợp đoạn sẽ được

57

xếp hạng dựa trên độ sâu tại vị trí chuyển đoạn hay dung hợp đoạn (tối thiểu

là 2X), sau đó những cặp trình tự sắp xếp đúng ở gần những vùng này sẽ được

sử dụng để xác định chính xác vị trí nucleotide mà hiện tượng chuyển

đoạn/dung hợp đoạn đã xảy ra;

iii) Kiểm tra đột biến chuyển đoạn/dung hợp đoạn bằng phương pháp giả lập

trên máy tính - tạo ra những trình tự giả lập ở từng đột biến chuyển đoạn/dung

hợp đoạn và tái sắp xếp những cặp trình tự lên trình tự giả lập này để kiểm tra

mức độ định vị của những cặp trình tự. Tỉ lệ định vị cao (quality alignment)

thể hiện độ chính xác của việc xác định đột biến chuyển đoạn/dung hợp đoạn.

2.6.3. PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR)

Để đảm bảo độ tin cậy của xét nghiệm NGS trên mẫu mô u và mẫu máu

chúng tôi tiến hành kiểm tra với ddPCR ít nhất 30 mẫu đầu tiên của mẫu mô u

và mẫu sinh thiết lỏng bằng bộ kit phát hiện đột biến gen EGFR (L858R,

T790M, mất đoạn exon 19) của hãng Biorad (ddPCR EGFR exon 19 Deletions

Screening kit; EGFR C797S T790M L858R Mutiplex Tube 2).

ddPCR được thực hiện tại Trung tâm y sinh học phân tử TP.HCM và

Bệnh viện Tân Hưng với hệ thống PCR vi giọt kỹ thuật số QX200™ với máy

tạo vi giọt thao tác tay của hãng Biorad. Quy trình ddPCR bốn bước được

thực hiện bằng cách sử dụng thuốc thử và thiết bị của Bio-Rad theo hướng

dẫn của nhà sản xuất. Đầu tiên, hỗn hợp PCR được chuẩn bị bằng cách trộn

dung dịch ddPCR Supermix, mồi và mẫu dò (IDT DNA) và khuôn mẫu DNA

(0,8 hoặc 1,6 ng). Tiếp theo, 20 μl hỗn hợp PCR và 70 μl dầu tạo được cho

vào máy tạo giọt QX100TM để tạo ra các giọt. Sau đó, các giọt được chuyển

sang một đĩa 96 giếng trước khi đặt vào bộ xử lý nhiệt (C1000 Touch, Bio-

Rad) để khuếch đại PCR. Chu trình nhiệt PCR được thực hiện như sau: 95°C

trong 10 phút, sau đó 40 chu kỳ khuếch đại liên tiếp (94°C trong 30 giây;

55°C trong 60 giây) và 98°C trong 10 phút. Cuối cùng, việc đọc giọt được thu

58

nhận bởi đầu đọc QX200 Droplet và được phân tích bằng Phần mềm

QuantaSoft [29]. Để phát hiện đột biến T790M và L858R ở exon 20 và 21 của

R-

F-GCCTGCTGGGCATCTG

gen EGFR , cần sử dụng một phản ứng của ddPCR với hai bộ mồi và mẫu dò

TGATGAG-

TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC ; đầu dò đột biến T790M FAM- ATGAGCTGC

R-

ZEN/3'IBFQ; mồi L858R

R-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT ; mồi L858R

GCCCAA-

CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT ; đầu dò đột biến L858R HEX-AGTTTGGCC

ZEN/3'IBFQ. Để phát hiện 15 vị trí xóa ở exon 19 (del19) của gen EGFR , phản

như sau: mồi T790M ; mồi T790M

ứng ddPCR (Bio-rad) có bán trên thị trường đã được sử dụng

(ddPCR ™ EGFR Exon 19 Bộ sàng lọc xóa # 12002392).

2.6.4. Thu thập số liệu:

Các thông tin được thu thập theo mẫu bệnh án nghiên cứu đã thiết kế sẵn

(Phụ lục 1).

2.6.4.1. Đặc điểm lâm sàng

 Tuổi: là biến số liên tục, xác định bằng số năm dương lịch, tính ở thời

điểm BN được thu nhận vào nghiên cứu.

 Giới: là biến số định danh (nam, nữ)

 Hút thuốc lá: là biến số định danh (có hút thuốc, không hút thuốc)

 Đánh giá giai đoạn bệnh AJCC VII.

2.6.4.2. Xét nghiệm mô bệnh học giải phẫu bệnh

Xét nghiệm mô bệnh học được thực hiện tại khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh

viện Phạm Ngọc Thạch.

Áp dụng phân loại mô bệnh học của Tổ chức y tế thế giới (2015) [115]

theo đó UTPKTBN được phân loại như sau:

- UTBM tuyến

- UTBM vảy

- UTBM tế bào lớn.

59

- UTBM tuyến vảy.

2.6.4.3. Xác định đột biến gen

- Thu thập kết quả đột biến gen EGFR bằng xét nghiệm EGFR Cobas V2

thực hiện trên hệ thống Realtime PCR Cobas 4800 của hãng Roche từ hồ sơ

bệnh án.

- Xét nghiệm đột biến gen EGFR bằng ddPCR tại Trung tâm y sinh học phân

tử Đại học Y dược TP.HCM và Bệnh viện Tân Hưng.

- Xét nghiệm đột biến đồng thời EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS mô

u bằng NGS tại Trung tâm y sinh học phân tử Đại học Y dược TP.HCM và

Viện di truyền y học.

- Xét nghiệm đột biến đồng thời EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS

sinh thiết lỏng bằng NGS tại Trung tâm y sinh học phân tử Đại học Y dược

TP.HCM và Viện di truyền y học.

60

2.7. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU

Tiếp xúc bệnh nhân, cung cấp bản thông tin dành cho đổi tượng nghiên cứu và chấp thuận nghiên cứu.

Bệnh nhân đồng ý sẽ tiến hành lấy mẫu mô và máu.

Thu thập ít nhất 94 mẫu mô phù hợp đang lưu trữ tại khoa GPB

Thu thập ít nhất 57 mẫu máu của BN có mẫu mô phù hợp

NGS ít nhất 94 mẫu mô u

NGS ít nhất 57 mẫu máu

ddPCR xác định đột biến EGFR ít nhất 30 mẫu mô u

ddPCR xác định đột biến EGFR ít nhất 30 mẫu máu

Thu thập kết quả xét nghiệm đột biến EGFR ít nhất 94 mô u bằng kit EGFR Cobas V2 qua hồ sơ bệnh án.

- Xác định tỉ lệ đột biến EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS. - Xác định sự tương đồng giữa NGS và ddPCR trong phát hiện đột biến EGFR - Xác định sự tương đồng giữa NGS và Cobas trong phát hiện đột biến EGFR

- Xác định sự tương đồng giữa NGS mô u và sinh thiết lỏng trong phát hiện EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS. - Xác định sự tương đồng giữa NGS và ddPCR trong phát hiện đột biến EGFR. - Xác định sự tương đồng giữa NGS và Cobas trong phát hiện đột biến EGFR.

Bệnh nhân phù hợp với tiêu chuẩn chọn mẫu

Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu và xử lý số liệu

61

2.8. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DỮ LIỆU

Số liệu được xử lý và phân tích bằng phần mềm thống kê y học Stata 10 và

được trình bày trong các bảng, biểu đồ.

Số liệu được tóm tắt và trình bày dưới dạng tỉ lệ (đối với các biến số

rời/định tính); số trung bình toán học và độ lệch chuẩn (đối với các biến số

liên tục có phân phối bình thường); số trung vị đối với các biến số liên tục có

phân phối không bình thường.

Sử dụng phép kiểm Chi bình phương (2) để kiểm định mối liên hệ giữa

các biến số rời hoặc định tính, các so sánh có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Trong trường hợp giá trị mong đợi nhỏ hơn 5 thì sử dụng test χ2 với hiệu

chỉnh Fisher.

So sánh sự tương đồng giữa các phương pháp chẩn đoán sử dụng chỉ số

Kappa với khoảng tin cậy 95% [41].

+ Kappa < 0: không tương đồng

+ Kappa từ 0 đến 0,2: tương đồng rất ít

+ Kappa từ 0,21 đến 0,4: tương đồng ít

+ Kappa từ 0,41 đến 0,6: tương đồng trung bình

+ Kappa từ 0,61 đến 0,8: tương đồng tốt

+ Kappa từ 0,81 đến 1: tương đồng rất tốt

2.9. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

Tất cả BN trong nghiên cứu đều hoàn toàn tự nguyện tham gia. Xét

nghiệm phân tích đột biến gen chỉ được thực hiện khi có sự đồng ý của BN

hoặc gia đình BN. Các thông tin chi tiết về tình trạng bệnh tật, các thông tin

62

cá nhân của người bệnh được bảo mật thông qua việc mã hóa các số liệu trên

máy vi tính.

Nghiên cứu đã được thông qua Hội đồng y đức Đại học Y dược

TP.HCM (quyết định số 027/ĐHYD-HĐ).

Nghiên cứu đã được sự đồng ý của bệnh viện Phạm Ngọc Thạch (quyết

định số 38/NCKH-PNT).

Bệnh nhân không mất chi phí xét nghiêm giải trình tự gen thế hệ mới

và ddPCR.

63

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Qua nghiên cứu 146 bệnh nhân được chẩn đoán UTPKTBN giai đoạn

cuối (IIIB-IV) điều trị tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch từ 9/2018 đến 9/2020,

chúng tôi thu nhận được 146 mẫu mô u và 61 mẫu máu tương ứng.

Sơ đồ 3.1: Quy trình thực hiện xét nghiệm đột biến gen

64

3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG Ở BỆNH

NHÂN UTPKTBN

3.1.1. Tuổi

Biểu đồ 3.1. Nhóm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu (%)

Nhận xét:

+ Tuổi trung bình là 61 ± 11,7, tuổi thấp nhất là 30 tuổi, tuổi cao nhất

là 90 tuổi.

+ BN > 60 tuổi chiếm tỉ lệ 57,5% (84/146 BN) cao hơn nhóm ≤ 60 tuổi

(62/146 BN)

3.1.2. Giới tính

Bảng 3.1. Đặc điểm về giới tính

Nhóm Số bệnh nhân Tỷ lệ (%)

Nam Nữ Tổng 98 48 146 67,1 32,9 100

Nhận xét:

Bệnh nhân nam gặp nhiều hơn nữ và tỉ số nam/nữ là 2,04.

65

3.1.3. Giai đoạn bệnh

Biểu đồ 3.2. Phân loại giai đoạn bệnh (%)

Nhận xét:

Có 69,3% (101/146 BN) các BN UTPKTBN thuộc giai đoạn IV cao

hơn giai đoạn IIIB là 30,7% (45/146 BN)

3.1.4. Hút thuốc lá

Bảng 3.2. Đặc điểm về tiền sử hút thuốc lá

Nhóm Số bệnh nhân Tỷ lệ (%)

44 30,1 Không hút thuốc lá

102 69,9 Hút thuốc lá

146 100 Tổng

Nhận xét:

Bệnh nhân hút thuốc lá chiếm tỉ lệ cao 69,9% (102/146 BN), không hút

thuốc lá chiếm tỉ lệ 30,1% (44/146 BN).

66

3.1.5. Đặc điểm mô học khối u phổi trên giải phẫu bệnh

Biểu đồ 3.3. Phân bố bệnh nhân theo phân loại mô học khối u (%)

Kết quả cho thấy có 90,4% (132/146 BN) là UTBM tuyến và 8,9% Nhận xét:

(13/146 BN) là UTBM dạng vảy và chỉ có 0,7% (1/146 BN) là UTBM tế bào

lớn.

3.2. XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỘT BIẾN GEN (EGFR, ALK, ROS1,

BRAF, KRAS, NRAS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN

THẾ HỆ MỚI TỪ MÔ U VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐỘT

BIẾN GEN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG Ở BỆNH NHÂN

UTPKTBN

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp giải trình tự song song hàng loạt để

phát hiện những thay đổi di truyền 6 gen điều khiển chính bao

gồm EGFR , KRAS , NRAS, BRAF , ALK và ROS1 trong các mô khối u từ 146

bệnh nhân UTPKTBN, kết quả ghi nhận được trình bày cụ thể ở Phụ lục 4.

67

3.2.1. Kết quả xác định tỉ lệ các loại gen đột biến

Trong số 146 bệnh nhân được giải trình tự gen thế hệ mới, 88 trường hợp

(60,2%) được phát hiện mang ít nhất một đột biến gen trong 6 gen khảo sát

(EGFR , KRAS , NRAS, BRAF , ALK và ROS1 ), trong khi 58 trường hợp còn

lại (39,7%) âm tính với những đột biến gen này.

Biểu đồ 3.4.: Tỉ lệ các đột biến gen trong UTPKTBN

Nhận xét:

EGFR (41,7%) là gen bị đột biến thường gặp nhất, tiếp theo là

KRAS (12,3%). Gen ALK và BRAF chiếm tỉ lệ ít là 1,4%. Nghiên cứu chưa

phát hiện đột biến gen ROS1 và NRAS trong 146 mẫu mô u này. Bên cạnh đó

phát hiện 5 trường hợp (3,4%) mang đồng thời 2 đột biến là EGFR và KRAS.

3.2.2. Kết quả xác định tỉ lệ các loại đột biến của gen EGFR

Khi thực hiện giải trình tự gen để xác định các loại đột biến trên gen

EGFR của 146 mẫu mô UTPKTBN đã xác định được các dạng và tỉ lệ đột

biến như sau.

68

Bảng 3.3. Tỉ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen EGFR

Exon bị đột biến Tần số (n) Tỷ lệ (%)

26 42,6 Exon 21

23 37,7 Exon 19

9 14,7 Exon 20

1 1,6 Exon 18 + exon 20

2 3,3 Exon 18+ exon 21

61 100 Tổng số đột biến

Nhận xét:

Đột biến EGFR chủ yếu được phát hiện ở exon 21 và exon 19. Đột biến

ở exon 21 chiếm tỉ lệ cao nhất với 42,6% (26/61 trường hợp). Đột biến ở exon

19 cũng chiếm tỉ lệ cao với 37,7% (23/61 bệnh nhân). Exon 20 chiếm 14,7%.

Ngoài ra, các đột biến ở exon 18 hiếm gặp hơn, chiếm tỷ lệ 4,9% và xuất hiện

kết hợp với exon 20, exon 21.

Bảng 3.4. Tỉ lệ các loại đột biến gen EGFR

Tần số (n) Tỷ lệ (%) Loại

L858R 26 42,6

Del19 23 37,7

Ins20 7 11,5

H773A 1 1,6

L768C 1 1,6

G719C + S768I 1 1,6

G719A + L861Q 2 3,3

Tổng 61 100

69

Nhận xét:

Đột biến L858R (26 trường hợp) và del19 (23 trường hợp) chiếm phần

lớn trong các đột biến EGFR (80,3% tổng số trường hợp đột

biến EGFR ). Đột biến được báo cáo có liên quan đến kháng trị liệu TKI,

ins20 ở exon 20, được phát hiện ở 7 bệnh nhân (11,5% tổng số bệnh

nhân). Ngoài ra, các đột biến hiếm gặp khác cũng được phát hiện như

H773A, L768C, G719A, G719C, S768I , G719D, L861Q với tỉ lệ lưu hành

1,6 đến 3,3%.

3.2.3. Kết quả xác định tỉ lệ các loại đột biến của gen KRAS

Thực hiện giải trình tự gen tìm đột biến gen KRAS trên 146 mẫu mô

UTPKTBN, đã xác định được các dạng và các tỉ lệ đột biến được trình bày

trong biểu đồ và bảng sau:

Biểu đồ 3.5. Tỉ lệ phân bố đột biến theo exon trên gen KRAS

Nhận xét:

70

Các đột biến KRAS phổ biến nhất xảy ra ở exon 2 ở gốc G12 và G13,

chiếm 16/18 trường hợp (88,9% tổng số trường hợp đột biến KRAS). Các đột

biến cũng được phát hiện ở exon 3 với 2 trường hợp chiếm 11,1%.

Bảng 3.5. Tỉ lệ các loại đột biến gen KRAS

Tần số (n) Tỷ lệ (%) Loại

5 4 3 1 1 1 1 1 1 18 G12V G12C G12D G12A G12S G13C G13S Q61H Q61R Tổng 27,8 22,2 16,7 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 100

Nhận xét:

- Trong số những trường hợp mang đột biến, loại đột biến G12V (exon 2)

chiếm tỉ lệ cao nhất (27,8%), tiếp đó đến đột biến G12C (22,2%) và G12V

(16,7%). Các đột biến hiếm khác trên exon 3 như Q61H, Q61R chiếm tỉ lệ thấp

nhất (5,6%).

- Đột biến tại codon 12 chiếm đa số với 14/18 trường hợp (77,7%), cao

gấp 7 lần đột biến tại codon 13 với 2/18 trường hợp (11,1%).

- Không có trường hợp nào mang cùng lúc 2 đột biến gen KRAS

3.2.4. Kết quả xác định tỉ lệ các loại đột biến đồng thời của hai gen EGFR

và KRAS

Kết hợp kết quả xác định đột biến của gen EGFR và KRAS giúp xác định

tình trạng đột biến các gen ảnh hưởng đến tính nhạy cảm với EGFR TKI trong

71

UTPKTBN như sau:

Bảng 3.6: Tỉ lệ các loại đột biến đồng thời của gen EGFR và KRAS

Loại Tần số (n) Tỷ lệ (%)

del19 + G12D 20 1

del19 + G13S 20 1

L858R + G12V 20 1

L858R + G13S 20 1

Ins20 + G12C 20 1

Tổng 100 5

Nhận xét: Có 5 bệnh nhân mang đột biến đồng thời 2 gen EGFR và

KRAS

3.2.5. Kết quả xác định tỉ lệ các loại đột biến của gen BRAF

Biểu đồ 3.6: Tỉ lệ các loại đột biến của gen BRAF

72

Nhận xét: đột biến trong BRAF được phát hiện ở 1 trường hợp exon 11

(G649R) và 1 trường hợp exon 12 (K483N) với tỉ lệ bằng nhau 50%.

3.2.6. Mối liên quan giữa các đột biến gen và giới tính

Bảng 3.7: Mối liên quan giữa các loại đột biến và giới tính

Nữ Nam Tổng p

Đột biến n % n % n %

18 37,5 67 68,4 85 58,2 Không đột biến

< 0,01 EGFR

30 62,5 31 31,6 61 41,8 Đột biến

44 91,7 84 85,7 128 87,7 Không đột biến

> 0,05 KRAS

4 8,3 14 14,3 18 12,3 Đột biến

Nhận xét:

+ Tỉ lệ nhóm BN nữ có đột biến gen EGFR là 62,5% cao hơn nhóm BN

nam là 31,6%. Có mối liên quan giữa giới tính và tình trạng đột biến gen

EGFR với p < 0,01.

+ Tỉ lệ có đột biến gen KRAS ở nhóm BN nữ là 8,3% và nhóm BN nam

là 14,3%. Không tìm thấy có mối liên quan giữa giới tính và tình trạng đột

biến gen KRAS với p > 0.05.

73

3.2.7. Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và tuổi

Bảng 3.8: Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và tuổi

≤ 60 > 60 Tổng p

n % n % n %

50 54 64,3 85 58,2 Không đột biến 31

> 0,05 EGFR

31 50 30 35,7 61 41,8 Đột biến

89,3 128 87,7 Không đột biến 53 85,5 75

> 0,05 KRAS

9 14,5 9 10,7 18 12,3 Đột biến

Nhận xét:

+ Tỉ lệ nhóm BN dưới 60 tuổi có đột biến gen EGFR là 50%, trong khi

nhóm BN trên 60 tuổi có đột biến gen EGFR là 35,7%. Tuy nhiên sự khác

biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

+ Tỉ lệ nhóm BN dưới 60 tuổi có đột biến gen KRAS là 14,5% tương

đương với nhóm BN trên 60 tuổi có đột biến gen KRAS là 10,7%. Sự khác

biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

74

3.2.8. Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và hút thuốc lá

Bảng 3.9: Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và hút thuốc lá

Tổng p Không hút thuốc Hút thuốc Đột biến

n % n % n %

15 34,1 70 68,6 85 58,2 Không đột biến EGFR < 0.01

29 65,9 32 31,4 61 41,8 Đột biến

40 90,9 88 86,3 128 87,7 Không đột biến

> 0.05 KRAS

4 9,1 14 13,7 18 12,3 Đột biến

Nhận xét:

+ Có mối liên quan giữa tiền sử không hút thuốc lá và tình trạng đột

biến gen EGFR với p < 0,01. Nhóm BN không hút thuốc có tỉ lệ đột biến gen

EGFR là 65,9% cao hơn nhóm BN hút thuốc là 31,4%.

+ Không có mối liên quan giữa tiền sử hút thuốc lá và tình trạng đột

biến gen KRAS. Nhóm BN không hút thuốc có tỉ lệ đột biến gen KRAS là

9,1% và ở nhóm BN hút thuốc là 13,7%.

75

3.2.9. Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và phân loại mô học

Bảng 3.10: Mối liên quan giữa các loại đột biến gen và phân loại mô học

Tổng p

Ung thư biểu mô tuyến Ung thư biểu mô vảy Ung thư tế bào lớn Đột biến

n % n % n % n %

71 53,8 11 84,6 1 100 85 58,2 Không đột biến

< 0.05 EGFR

46,2 2 15,4 0 0 61 41,8 Đột biến 61

115 87,1 12 92,3 1 100 128 87,7 Không đột biến >0.05 KRAS

12,9 1 7,7 0 0 18 12,3 Đột biến 17

Nhận xét:

+ Có mối liên quan giữa phân loại mô học và tình trạng đột biến gen

EGFR với p < 0,05. Nhóm BN UTBM tuyến có tỉ lệ đột biến gen EGFR là

46,2% cao hơn nhóm BN UTBM vảy 15,4% .

+ Không có mối liên quan giữa phân loại mô học và tình trạng đột biến

gen KRAS. Tỉ lệ đột biến gen KRAS ở nhóm BN UTBM tuyến là 12,9% và ở

nhóm BN UTBM vảy là 7,7%.

76

3.3. SO SÁNH SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN

EGFR GIỮA GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TỪ MÔ U VỚI

DIGITAL DROPLET PCR VÀ EGFR COBAS V2

Trong phương pháp NGS, nghiên cứu áp dụng giới hạn phát hiện LOD

đối với sinh thiết mô u là 10% (những biến thể có tần suất cao hơn 10% được

xem là dương tính) và đối với sinh thiết lỏng 1% (riêng EML4-ALK là 2,5%).

3.3.1. So sánh sự tương đồng giữa NGS mô u và ddPCR

Để đánh giá được độ tin cậy của quy trình NGS các mẫu mô u, chúng

tôi tiến hành so sánh với phương pháp ddPCR trên 30 mẫu mô u. Phương

pháp ddPCR được thực hiện với bộ kit phát hiện ba đột biến chính ở gen

EGFR (L858R, T790M, mất đoạn exon 19) của hãng Biorad (ddPCR EGFR

exon 19 Deletions Screening kit; EGFR C797S T790M L858R Mutiplex Tube

2).

Bảng 3.11. So sánh sinh thiết mô NGS và ddPCR

NGS mô u

ddPCR mô u Tổng Không đột biến Có đột biến Tỉ lệ tương đồng:

96,7% 25 0 25 Không đột biến Hệ số Kappa:

1 4 5 Có đột biến k=0,86 ± 0,18

26 4 30 Tổng

Nhận xét:

Kết quả chẩn đoán giữa NGS và ddPCR trên mô u tương đồng 96,7%

(29/30 trường hợp) với chỉ số tương đồng Kappa ở mức độ rất tốt (k= 0,86 ±

0,18). Theo kết quả NGS, trong 5 mẫu dương tính, 4 mẫu được xác định

77

dương tính cả với NGS và ddPCR. Có 1 trường hợp âm tính với NGS nhưng

dương tính với ddPCR.

Bảng 3.12. Kết quả NGS và ddPCR của 30 mẫu sinh thiết mô trong

phát hiện đột biến L858R, T790M, mất đoạn exon 19.

NGS mô u

ddPCR mô u

Mẫu mô

Đột biến

MAF (%)

Đột biến

MAF (%)

(-)

LBL001

(-)

65

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) L858R

38,9

LBL002 LBL003 LBL004 LBL005 LBL006 LBL007 LBL008 LBL009 LBL011 LBL012 LBL013 LBL014 LBL015

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) L858R

(-)

LBL016

(-)

90 23

L858R (-) Del19 (-) (-) (-) (-) del19 (-)

51,9 3,9 27,5

LBL017 LBL020 LBL021 LBL022 LBL023 LBL024 LBL025 LBL026 LBL027

L858R (-) (-) (-) (-) (-) (-) del19 (-)

(-)

LBL028

(-)

18

(-) Del19

6,7

LBL029 LBL030

(-) del19

(-) (-)

(-) (-) (-)

LBL031 LBL037 LBL041

(-) (-) (-)

78

3.3.2. So sánh sự tương đồng giữa NGS mô u và EGFR Cobas V2

Chúng tôi tiến hành giải trình tự gen 146 mẫu sinh thiết mô u và so sánh với

kết quả xét nghiệm đột biến gen EGFR Cobas V2. Kết quả ghi nhận được

trình bày chi tiết ở Phụ lục 5.

Bảng 3.13. So sánh sinh thiết mô NGS và EGFR Cobas V2 trong phát hiện

đột biến EGFR

NGS

Tổng Cobas Tỉ lệ tương Không đột biến Có đột biến

đồng: 92,5%

80 6 86 Không đột biến Hệ số Kappa:

k=0,84 ± 0,08 5 55 60 Có đột biến

85 61 146 Tổng

Nhận xét:

Kết quả khi so sánh xét nghiệm đột biến EGFR giữa NGS mô u và với

EGFR Cobas V2, nghiên cứu ghi nhận tỉ lệ tương đồng giữa 2 phương pháp là

92,5% (135/146 trường hợp). Chỉ số tương đồng Kappa ở mức độ rất tốt (k=

0,84 ± 0,08).

Trong 60 trường hợp dương tính, có 55 trường hợp đồng phát hiện dương

tính ở NGS và Cobas, 5 trường hợp Cobas ghi nhận dương tính nhưng âm

tính với NGS. Trong 86 trường hợp âm tính, có 80 trường hợp đều âm tính ở

79

NGS và Cobas, 6 trường hợp Cobas ghi nhận âm tính nhưng được phát hiện

dương tính với NGS.

3.4. SO SÁNH SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRONG PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN

GEN GIỮA GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TỪ SINH THIẾT LỎNG

VỚI MÔ U, DIGITAL DROPLET PCR VÀ EGFR COBAS V2.

3.4.1. So sánh sự tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và ddPCR

Khi tiến hành so sánh các mẫu sinh thiết lỏng bằng ddPCR với bộ kit phát

hiện ba đột biến chính ở gen EGFR (L858R, T790M, mất đoạn exon 19) của

hãng Biorad (ddPCR EGFR exon 19 Deletions Screening kit; EGFR C797S

T790M L858R Mutiplex Tube 2) trong 34 mẫu máu, chúng tôi ghi nhận được

kết quả như sau:

Bảng 3.14. So sánh sinh thiết lỏng NGS và ddPCR

NGS sinh thiết lỏng

Tổng Tỉ lệ tương đồng: ddPCR sinh thiết lỏng Không đột biến Có đột biến

97%

29 0 29 Hệ số Kappa: Không đột biến

k=0,87 ± 0,17 1 4 5 Có đột biến

30 4 34 Tổng

Nhận xét:

Kết quả chẩn đoán giữa NGS và ddPCR từ sinh thiết lỏng tương đồng

97% (33/34 trường hợp) với chỉ số tương đồng Kappa ở mức độ rất tốt (k=

0,87 ± 0,17). Theo kết quả NGS, trong 5 mẫu dương tính, 4 mẫu được xác

định dương tính cả với NGS và ddPCR. Có 1 trường hợp âm tính với NGS

nhưng dương tính với ddPCR.

80

Bảng 3.15. Kết quả NGS và ddPCR của 34 mẫu sinh thiết lỏng

trong phát hiện đột biến L858R, T790M, mất đoạn exon 19.

NGS sinh thiết lỏng

Mẫu máu

Đột biến

MAF (%)

ddPCR sinh thiết lỏng Đột biến

MAF (%)

(-)

LBL001

(-)

5

89

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Del19 (-) (-) (-) (-) L858R

12.1 46.2

LBL002 LBL003 LBL004 LBL005 LBL006 LBL007 LBL008 LBL009 LBL010 LBL011 LBL012 LBL013 LBL014 LBL015

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Del19 (-) (-) (-) (-) L858R

(-)

LBL016

(-)

2 0.8

2.8 1.2 0.7

L858R L858R (-) Del19 (-) (-) (-) (-) (-) (-)

LBL017 LBL019 LBL020 LBL021 LBL022 LBL023 LBL024 LBL025 LBL026 LBL027

L858R L858R (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

(-)

LBL028

(-)

(-) (-)

LBL029 LBL030

(-) (-)

(-) (-) (-) (-) (-)

LBL031 LBL037 LBL039 LBL040 LBL041

(-) (-) (-) (-) (-)

81

3.4.2. So sánh sự tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và EGFR Cobas

V2 mô u

Khi giải trình tự gen thế hệ mới 61 mẫu sinh thiết lỏng và so sánh với kết quả

xét nghiệm đột biến gen EGFR Cobas V2 mô u. Kết quả ghi nhận được trình

bày cụ thể ở phụ lục 6.

Bảng 3.16. So sánh sinh thiết lỏng NGS và EGFR Cobas V2 trong phát hiện

đột biến EGFR

NGS sinh thiết lỏng

Tổng Tỉ lệ tương đồng: EGFR Cobas V2 mô u Không đột biến Có đột biến

86,9%

43 4 47 Không đột biến Hệ số Kappa:

k=0,63 ± 0,12 4 10 14 Có đột biến

47 14 61 Tổng

Nhận xét:

Kết quả chẩn đoán giữa NGS sinh thiết lỏng và EGFR Cobas V2 mô u

cho thấy sự tương đồng 86,9% (53/61 trường hợp) với chỉ số tương đồng

Kappa ở mức độ tốt (k= 0,63 ± 0,12).

Trong 14 trường hợp dương tính, có 10 trường hợp đồng phát hiện dương

tính ở NGS sinh thiết lỏng và Cobas, 4 trường hợp Cobas mô u ghi nhận

dương tính nhưng âm tính với NGS sinh thiết lỏng. Trong 47 trường hợp âm

tính, có 43 trường hợp đều âm tính ở NGS và Cobas mô u, 4 trường hợp

82

Cobas mô u ghi nhận âm tính nhưng được phát hiện dương tính với NGS sinh

thiết lỏng.

3.4.3. So sánh sự tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và sinh thiết mô

trong phát hiện 6 gen EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS

Khi tiến hành xét nghiệm giải trình tự gen thế hệ mới trên 61 mẫu có cả mẫu

huyết tương và mô u. Kết quả ghi nhận được trình bày chi tiết ở phụ lục 7.

Bảng 3.17. So sánh sinh thiết lỏng NGS và sinh thiết mô NGS

Sinh thiết lỏng

Sinh thiết mô Tổng Tỉ lệ tương đồng: Không đột biến Có đột biến

86,9%

31 1 32 Hệ số Kappa: Không đột biến

k=0,73 ± 0,12

7 22 29 Có đột biến Độ nhạy: 75,9%

Độ đặc hiệu: 96,9% 38 23 61 Tổng

Nhận xét:

Kết quả chẩn đoán giữa NGS sinh thiết lỏng và sinh thiết mô u cho thấy

sự tương đồng 86,9% (53/61 trường hợp) với chỉ số tương đồng Kappa ở mức

độ tốt (k= 0,73 ± 0,12). Sử dụng kết quả NGS mô u làm tiêu chuẩn tham

chiếu, chúng tôi ghi nhận được độ nhạy là 75,9%, độ đặc hiệu là 96,9% cho

quy trình sinh thiết lỏng với độ sâu lớn.

83

Trong 29 trường hợp dương tính, có 22 trường hợp đồng phát hiện dương

tính ở NGS sinh thiết lỏng và sinh thiết mô, 7 trường hợp NGS mô u ghi nhận

dương tính nhưng âm tính với NGS sinh thiết lỏng. Trong 32 trường hợp âm

tính, có 31 trường hợp đều âm tính ở NGS sinh thiết lỏng và sinh thiết mô, 1

trường hợp NGS mô u ghi nhận âm tính nhưng được phát hiện dương tính với

NGS sinh thiết lỏng.

84

CHƯƠNG 4

BÀN LUẬN

4.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG Ở BỆNH NHÂN

UTPKTBN

4.1.1. Tuổi

Trong số 146 BN nghiên cứu, tuổi trung bình là 61 ± 11,7, đây là độ

tuổi có nguy cơ tiếp xúc và tích lũy với các yếu tố sinh bệnh cao. BN ở nhóm

tuổi trên 60 (57,5%) cao hơn nhóm nhỏ hơn 60 tuổi (42,5%). Độ tuổi thấp

nhất là 30 tuổi, điều này cho thấy độ tuổi xuất hiện ung thư ngày càng trẻ hóa.

Kết quả độ tuổi này phù hợp với nghiên cứu trong nước trước đây về UTP

như trong nghiên cứu của Vũ Văn Thịnh (2014) cho thấy tuổi trung bình của

BN UTPKTBN là 61,6 ± 11,1 [14] Nghiên cứu của Phạm Văn Thái (2015)

trên BN UTPKTBN di căn não, lứa tuổi thường gặp là 50 – 70, chiếm tỷ lệ

71,7% [12], Nguyễn Thị Lựu (2013) cho thấy lứa tuổi mắc cao nhất trong

nhóm nghiên cứu trên 60 tuổi chiếm 62,7% [7].

4.1.2. Giới tính

Kết quả cho thấy nam giới mắc bệnh nhiều hơn nữ với tỉ số nam/nữ =

2,04. Theo y văn cũng như các nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy rằng,

nam giới có tỉ lệ mắc UTP cao hơn nữ giới, tỉ số nam/nữ dao động từ 2,5-4

[20]. Tỉ số nam/nữ trong nghiên cứu này tương đồng với nghiên cứu của Vũ

Văn Thịnh (2014) là 2 [14]. Thói quen hút thuốc lá phổ biến hơn ở nam giới.

Điều này phần nào giải thích tại sao tỉ lệ UTP cao hơn ở nam giới. Tuy nhiên

các báo cáo gần đây cho thấy UTP đang có xu hướng gia tăng ở nữ giới với

mô bệnh học là UTBM tuyến [92]. UTP ở nữ giới ngày càng tăng điều này

85

được lý giải do tỉ lệ hút thuốc lá ở nữ giới ngày càng tăng. Hơn nữa, cùng với

nền công nghiệp phát triển song song với ô nhiễm môi trường, hóa chất độc

hại, đột biến gen cũng thay đổi.

4.1.3. Giai đoạn bệnh

Nghiên cứu được thực hiện trên nhóm BN ung thư giai đoạn cuối và kết

quả cho thấy phần lớn bệnh nhân ở giai đoạn IV (69,3%). Trong UTPKTBN

thì UTBM tuyến chiếm tỉ lệ cao nhất, và khối u thường nằm vùng ngoại vi

của phổi có xu hướng phát triển chậm, nên ít gây ra các triệu chứng rầm rộ

buộc BN phải đi khám ngay trong giai đoạn đầu. Khi khối u có kích thước

lớn, xâm lấn hoặc di căn tới các cơ quan khác thì triệu chứng mới xuất hiện rõ

và bệnh đã ở giai đoạn muộn, tiên lượng xấu. Nghiên cứu trước đây của Vũ

Văn Thịnh (2014) cũng cho kết quả tương tự với ghi nhận 82,3% BN ở giai

đoạn IV [14].

Hút thuốc là một trong những yếu tố nguy cơ hàng đầu gây UTP. Theo

4.1.4. Hút thuốc lá

khuyến cáo của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ, tỉ lệ bệnh nhân UTP có hút thuốc

chiếm 87 – 90%. Mức độ tăng nguy cơ phụ thuộc vào: tuổi bắt đầu hút (hút

càng sớm nguy cơ càng cao), số gói- năm (càng lớn nguy cơ càng cao), thời

gian hút càng dài (nguy cơ mắc bệnh càng lớn). Người hút thuốc nguy cơ

UTP cao gấp 10 lần so với người không hút thuốc [106]. Các nghiên cứu phân

tích gộp trong những năm gần đây cũng cho thấy nguy cơ UTP trên những

người hút thuốc lá thụ động cũng tăng cao hơn không kém với những người

hút thuốc [104]. Kết quả nghiên cứu cho thấy BN có tiền sử hút thuốc lá

chiếm tỉ lệ cao (69,9%) hơn BN không hút thuốc lá (30,1%). Kết quả này

tương đương với nghiên cứu Lê Hoàn (2010) trong đó tiền sử hút thuốc lá

86

chiếm 63,8% [5]; Vũ Văn Thịnh (2014) là 64,2% [14]. Theo Prager D. và CS

(2000), hơn 80% bệnh nhân UTP có tiếp xúc với khói thuốc lá [81].

4.1.5. Đặc điểm mô học khối u phổi trên giải phẫu bệnh

Xét nghiệm mô bệnh học trên giải phẫu bệnh có ý nghĩa quan trọng

hàng đầu trong chẩn đoán, lựa chọn phương pháp điều trị và tiên lượng BN

UTPKTBN. Vì BN UTPKTBN thường được phát hiện ở giai đoạn muộn

không còn chỉ định phẫu thuật nên việc chẩn đoán và điều trị thường dựa vào

các mảnh sinh thiết nhỏ.

Kết quả nghiên cứu cho thấy đa số bệnh nhân thuộc nhóm UTBM tuyến

(90,4%). UTBM vảy và UTBM tế bào lớn chiếm tỉ lệ rất ít (8,9% và 0,7%)

trong tổng số bệnh nhân. Trong số 146 BN nghiên cứu chỉ gặp 3 loại này. Kết

quả phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới và trong nước, đều cho thấy đây

là 3 loại mô bệnh học phổ biến nhất trong UTPKTBN. Nghiên cứu của

Gurrola C.M. (2010) trong 206 BN UTPKTBN, UTBM tuyến chiếm 74,7%,

UTBM vảy chiếm 22,3% và UTBM tế bào lớn 2,6% [38]. UTPKTBN chiếm

khoảng 85% các ca UTP và trong các phân loại của UTPKTBN thì UTBM

tuyến chiếm tỉ lệ ngày càng gia tăng, đặc biệt tại các nước Châu Á. Nghiên

cứu của Mai Trọng Khoa (2016) cho kết quả tương tự, tỉ lệ UTBM tuyến là

93,9% [6].

4.2. TỈ LỆ CÁC ĐỘT BIẾN GEN (EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI MÔ U VÀ

MỐI QUAN HỆ GIỮA CÁC ĐỘT BIẾN GEN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM

LÂM SÀNG CỦA BỆNH NHÂN

UTPKTBN là loại ung thư phổi phổ biến nhất với tỉ lệ cao các đột biến

mắc phải. Phổ đột biến gen liên quan đến điều trị đích trong UTPKTBN là rất

87

quan trọng để hướng dẫn điều trị đích nhằm cải thiện tỉ lệ sống còn của bệnh

nhân. Mặc dù tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong do UTPKTBN ở Việt Nam cao, nhưng

phổ đột biến gen liên quan đến điều trị đích của bệnh nhân Việt Nam vẫn

chưa được kiểm tra kỹ lưỡng. Nghiên cứu đã áp dụng phương pháp giải trình

tự song song hàng loạt mô u để xác định những thay đổi trong 6 gen điều

khiển chính (EGFR , KRAS, NRAS, BRAF, ALK và ROS1) ở 146 bệnh nhân

UTPKTBN.

4.2.1. Tỉ lệ các loại gen đột biến trong UTPKTBN

Các thay đổi di truyền mắc phải trong một số gen điều khiển dẫn đến sự

phát triển và xâm lấn của khối u, đồng thời những bệnh nhân có một số đột

biến nhất định có thể được hưởng lợi từ các liệu pháp điều trị

đích [102]. Bệnh nhân UTPKTBN có đột biến gen EGFR , một trong những

gen điều khiển chính của UTPKTBN, có thời gian không tiến triển bệnh dài

hơn khi được điều trị bằng gefitinib, so với những người được điều trị bằng

hóa trị liệu. Ngoài EGFR, bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến gen

ALK hay ROS1 được chứng minh là đáp ứng tốt với crizotinib, trong khi

bệnh nhân UTPKTBN đột biến BRAF có thể được điều trị bằng sự kết hợp

của các chất ức chế BRAF, dabrafenib và trametinib [44],[67],[91]. Những

phát hiện này cho thấy rằng việc xác định các cấu hình đột biến của

UTPKTBN là rất quan trọng để chỉ định liệu pháp TKI phù hợp cũng như làm

sáng tỏ cơ sở phân tử của kháng thuốc để điều chỉnh điều trị kịp thời [46].

Dữ liệu kết quả trong nghiên cứu cho thấy 60,2% bệnh nhân

UTPKTBN có ít nhất một đột biến trong sáu gen được khảo sát. Phát hiện này

phù hợp với nghiên cứu đa trung tâm thực hiện tại Việt Nam sử dụng cùng

một bảng 6 gen này và báo cáo tỉ lệ đột biến tương tự là 66,3% ở 344 bệnh

nhân UTPKTBN [24]. Trong các đột biến gen, đột biến thường gặp nhất

88

là EGFR (41,7%) và KRAS (12,3%), tiếp theo là ALK (1,4%)

và BRAF (1,4%).

Tỉ lệ đột biến EGFR là 41,7% phù hợp với một số nghiên cứu trước

đây như nghiên cứu của Kosaka (2009) cho thấy tỉ lệ đột biến gen EGFR trên

BN Nhật Bản là 49% [51]. Tương tự nghiên cứu PIONEER (2014) đánh giá

tình trạng đột biến gen EGFR trên các bệnh nhân châu Á bị UTBM tuyến. Kết

quả nhận thấy tỉ lệ đột biến EGFR tại Trung Quốc (50,2%), Ấn Độ ( 22,2%),

Thái Lan (53,8%), Việt Nam (64,2%) [92]. Theo Hoàng Anh Vũ (2014)

nghiên cứu trên UTPKTBN, phát hiện tỉ lệ đột biến gen EGFR là 40,7% [15].

Tỉ lệ đột biến EGFR trong nghiên cứu cao hơn đáng kể so với nhóm bệnh

nhân da trắng ở nghiên cứu MSK-IMPACT (41,7% so với 29,1%) do Trung

tâm Ung thư Memorial Sloan Kettering (MSK) tiến hành [117]. Như vậy

nghiên cứu khẳng định lại các báo cáo trước đây rằng đột biến EGFR phổ

biến hơn ở bệnh nhân châu Á so với bệnh nhân da trắng khi tỷ lệ đột biến gen

EGFR trên BN UTBM tuyến chiếm khoảng 5 - 15% BN ở người da trắng và

khoảng 30 - 60% BN Châu Á [120].

Tỉ lệ đột biến KRAS trong nghiên cứu này thấp hơn so với nhóm bệnh

nhân da trắng MSK-IMPACT (12,3% so với 26,9%) [117] và cao hơn nhóm

Đông Á (Trung Quốc) (12,3% so với 8,0%) [112]. Kết quả đột biến KRAS

cũng cao hơn so với Jing C (2018) là 8,9% [45]. Các đột biến KRAS được

phát hiện ở 30% bệnh nhân UTPKTBN không đáp ứng với điều trị TKI. Tuy

nhiên, việc sử dụng tình trạng đột biến KRAS như một dấu hiệu dự đoán tiêu

cực của liệu pháp TKI vẫn còn gây tranh cãi do kết quả không nhất quán thu

được từ các nghiên cứu phân tích tổng hợp. Điều thú vị là các đột biến KRAS,

đặc biệt là đột biến phổ biến nhất G12C, khi cùng tồn tại với biểu hiện PD-L1

trong khối u của bệnh nhân, được cho là có tiên lượng xấu hỗ trợ lợi ích tiềm

89

năng của thử nghiệm đột biến KRAS trong việc lựa chọn bệnh nhân cho liệu

pháp miễn dịch.

Tỉ lệ đột biến ALK trong nghiên cứu thấp hơn so với nhóm bệnh nhân

da trắng MSK-IMPACT (1,4% so với 4,4%) [117] và cũng thấp hơn nhóm

Đông Á (1,4% so với 5,2%) [112]. Tỉ lệ đột biến ALK được xác định trong

nghiên cứu cũng thấp hơn với các nghiên cứu đã được Hiệp hội nghiên cứu

ung thư Hoa Kỳ công bố trong dự án AACR GENIE dao động từ 5 đến

7% [8], [85].

Tỷ lệ đột biến BRAF trong nghiên cứu thấp hơn so với nhóm bệnh nhân

da trắng MSK-IMPACT (1,4% so với 5,2%) [117] và tương đương nhóm

Đông Á (1,4% so với 1,3%) [112].

Không phát hiện được đột biến NRAS và ROS1 trong nghiên cứu, có

thể do số lượng mẫu chưa đủ lớn để phát hiện các đột biến hiếm này. Tuy

nhiên ở nghiên cứu thực hiện trên 350 BN UTPKTBN đa trung tâm của nhóm

nghiên cứu chúng tôi công bố vào năm 2020 [26] phát hiện được tỉ lệ đột biến

ROS1 là 2,3% và đột biến NRAS là 0,6%. Tỉ lệ đột biến NRAS trong nghiên

cứu MSK-IMPACT là 1,2% trên số lượng mẫu là 764 bệnh nhân [117]. Tỉ lệ

đột biến ROS1 trong nghiên cứu nhóm Đông Á là 0,8% trên số lượng mẫu là

361 bệnh nhân [112].

Bảng 4.1: Tỉ lệ các đột biến gen trong một số nghiên cứu.

EGFR KRAS ALK BRAF ROS1 NRAS

Tác giả

Hoàng Anh Vũ (2014) [15]

42

46,5

-

-

-

-

Nguyễn Minh Hà (2014) [2]

58,6

15,5

-

-

-

-

Kosaka (2009) [51]

49

-

-

-

-

-

90

Pioneer (2014) [92]

-

64,2

-

-

-

-

Jing C (2018) [45]

1,7

51,7

8,9

-

1,7

-

Wang (2015) [112]

-

63,1

8,0

5,2

1,3

0,8

1,2

MSK-IMPACT (2017) [117]

-

24,5

26,9

4,4

5,2

3,1

Tan (2020) [103]

56

14

6

2

1

Đặng Huỳnh Anh Thư và CS (2020) [26]

35,4

22,6

6,6

2,3

0,6

3,1

Nghiên cứu này

41,7

12,3

1,4

0

0

1,4

Nhìn chung, dữ liệu của nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến

ở EGFR , KRAS là hai đột biến phổ biến nhất, xảy ra ở hơn một nửa số bệnh

nhân UTPKTBN.

Sự tồn tại đồng thời các đột biến gen có thể cùng tồn tại trong cùng một

tế bào khối u hoặc thuộc các dòng tế bào khối u khác nhau. Tỉ lệ các trường

hợp đồng đột biến khác nhau giữa các nghiên cứu. Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ

đột biến đồng thời gen EGFR và KRAS chiếm 3,4% và không ghi nhận đồng

đột biến giữa các gen còn lại. Các nghiên cứu khác gần đây của Zhuang và

cộng sự [121] trên 3774 bệnh nhân UTPKTBN Trung Quốc báo cáo tỷ lệ

đồng đột biến 1,7% trong 5 gen điều khiển được thử nghiệm

(EGFR , KRAS ,ALK , ROS1 và BRAF) hay nghiên cứu của Hiệp hội đột biến

ung thư phổi của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ được báo cáo có 5% chứa

đồng thời các đột biến gen [52]. Các nghiên cứu đều ghi nhận tương tự nghiên

cứu này là EGFR và KRAS là đồng đột biến phổ biến nhất ở bệnh nhân

UTPKTBN. Việc xác định những bệnh nhân có các đồng đột biến có tầm

91

quan trọng trong lâm sàng vì những đột biến đồng thời này có thể có tác động

đáng kể đến kết quả điều trị. Các nghiên cứu trước đây cho thấy bệnh nhân

mang đồng đột biến EGFR và ALK sẽ khác nhau về mức độ nhạy cảm và sự

lựa chọn giữa hai nhóm thuốc TKI điều trị đầu tay cho những bệnh nhân này

vẫn còn đang được tranh luận [97]. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn để

xác định hiệu quả lâm sàng và độ nhạy cảm với thuốc của các dạng đồng đột

biến gen khác nhau để lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

4.2.2. Tỉ lệ các loại đột biến của gen EGFR

Thời gian gần đây, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt

Nam chứng minh hiệu quả điều trị BN UTBM tuyến bằng các thuốc EGFR

TKI. Các nghiên cứu cũng kết luận hiệu quả điều trị của các thuốc EGFR TKI

phụ thuộc vào các đột biến ở exon 18 đến exon 21 của gen EGFR, do đột biến

này tạo ra các protein EGFR có ái lực mạnh đối với thuốc điều trị. Vì vậy, kết

quả xác định đột biến gen EGFR là một thông tin quan trọng giúp các bác sĩ

lâm sàng cân nhắc sử dụng liệu pháp điều trị đích cho BN UTBM tuyến. Mặc

dù có khoảng 40 dạng đột biến gen EGFR đóng vai trò bệnh sinh và đáp ứng

hiệu quả của điều trị đích trong UTBM tuyến, trong đó đột biến xóa đoạn

(LREA) ở exon 19 và đột biến điểm (L858R) ở exon 21 là hai dạng thường

gặp nhất trong tổng số các đột biến gen EGFR liên quan đến tính đáp ứng với

EGFR TKI.

Kết quả nghiên cứu ghi nhận đột biến EGFR chủ yếu được phát hiện ở

exon 19 và exon 21. Đột biến ở exon 21 chiếm tỉ lệ cao nhất với 42,6% (26/61

trường hợp). Đột biến ở exon 19 chiếm tỉ lệ cao thứ hai với 37,7% (23/61

bệnh nhân). Exon 20 chiếm 14,7% (9/61 bệnh nhân). Ngoài ra, các đột biến ở

exon 18 hiếm gặp hơn, chiếm tỷ lệ 4,9% và xuất hiện kết hợp với exon 20,

exon 21.

Đột biến L858R (42,6%) và del19 (37,7%) chiếm phần lớn trong các đột

92

biến EGFR (80,3% tổng số trường hợp đột biến EGFR). Ngoài ra, các đột

biến hiếm gặp khác cũng được phát hiện như H773A, L768C, G719A,

G719C, S768I , G719D, L861Q với tỉ lệ lưu hành 1,6 đến 3,3%. Kết quả

nghiên cứu phù hợp với đa số các nghiên cứu trên thế giới cũng như tại Việt

Nam với đột biến mất đoạn (LREA) trên exon 19 và đột biến điểm (L858R)

trên exon 21 là hai loại đột biến hay gặp nhất. Nguyễn Minh Hà (2014), áp

dụng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS xác định đột biến gen

EGFR trên 120 mẫu mô UTPKTBN, được tỷ lệ là 50,8%, trong đó đột biến

xóa đoạn LREA tại exon 19 và đột biến điểm L858R chiếm tỷ lệ cao nhất là

44,3% và 37,7%; 9 loại đột biến khác chiếm tỷ lệ thấp hơn [3]. Nghiên cứu

của Mitsudomi T. (2010) cho thấy đột biến L858R (42,2%) và del19 (48,2%)

[59].

Đột biến del19 và L858R trong nghiên cứu chiếm 49/146 trường hợp

(33,6%). Đây là đột biến kích hoạt và được chứng minh lâm sàng là nhạy cảm

với các phương pháp điều trị đích bằng các loại thuốc TKI có sẵn. Vì thế cho

thấy khoảng 40% bệnh nhân UTPKTBN sẽ được hưởng lợi từ các loại thuốc

trúng đích sẵn có. Trong các trường hợp UTBM tuyến tiến triển, sự hiện diện

đột biến gen EGFR thường dự báo hiệu quả điều trị tốt bằng các thuốc EGFR

TKI thế hệ 1 và 2. Theo Wu J.Y. (2011), BN UTPKTBN có đột biến L858R

(exon 21) và đột biến exon 19 nếu điều trị gefitinib hoặc erlotinib có tỉ lệ đáp

ứng cao hơn các đột biến khác [114].

Kết quả nghiên cứu ghi nhận có 3/61 trường hợp (4,9%) mang đột

biến điểm G719A và G719C trên exon 18. Kết quả này phù hợp với nghiên

cứu của Mitsudomi T. (2010) với tần suất đột biến exon 18 khoảng 3,2% [59].

Nhìn chung các đột biến này có liên quan đến tăng nhạy cảm với các thuốc

EGFR TKI. Theo Wu J.Y. (2011), BN UTPKTBN có đột biến exon 18 có tỷ lệ

93

đáp ứng thấp hơn đột biến ở exon 19 và exon 21 khi điều trị bằng các thuốc

EGFR TKI [114].

Đột biến ins20 còn được gọi là đột biến kháng thuốc và được phát hiện

ở 7 trường hợp (11,5%) và không cùng tồn tại với bất kỳ đột biến EGFR kích

hoạt nào như đột biến L858R và del19, cho thấy rằng đột biến ins20 có khả

năng là đột biến bất hoạt chính hơn là đột biến kháng thuốc mắc phải. Hầu hết

các đột biến chèn đoạn ở exon 20 thường xảy ra trong 14 amino acid tại N-

lobe của thụ thể EGFR: từ G762 đến C775. Nguyên nhân do đa số các đột

biến chèn ở exon nằm trong vị trí Ser768 đến Val774 (nằm ngoài vùng C-

helix), điều này cho thấy vùng này có lẽ quan trọng trong sự thay đổi về cấu

hình giữa cấu trúc hoạt động và không hoạt động của EGFR. Việc chèn đoạn

trong khu vực này có thể gây ung thư bằng cách thúc đẩy trạng thái hoạt động

của domain kinase của EGFR và có thể ảnh hưởng đến ái lực của receptor này

với gefitinib và erlotinib (ít nhạy với gefitinib và erlotinib). Đa số những bệnh

nhân UTPKTBN có đột biến chèn đoạn ở exon 20 có các đặc điểm chung như

không hút thuốc, thường là nữ giới và hầu hết là UTBM tuyến. Tuy nhiên,

gần đây phát hiện ra một ngoại lệ, một đột biến thêm 4 acid amin tại exon 20,

đột biến A763_Y764insFQEA, lại làm tăng tính nhạy cảm của tế bào UTP với

thuốc điều trị đích.

Kết quả không phát hiện đột biến T790M do nghiên cứu được thực hiện

trên các bệnh nhân chưa được điều trị đích. Nguyên nhân gây kháng thuốc

TKI thường gặp nhất được xác định là do xuất hiện đột biến T790M trên exon

20. Đột biến này chiếm 40-55% các nguyên nhân gây kháng thuốc. Một số

nguyên nhân khác gặp với tỉ lệ thấp hơn như khuếch đại gen MET, khuếch đại

gen ERBB2 hay chuyển dạng tế bào từ không tế bào nhỏ sang tế bào nhỏ hoặc

xuất hiện thêm một số đột biến gen khác như KRAS, NRAS…[76].

94

4.2.3. Tỉ lệ các loại đột biến của gen KRAS

Trong nghiên cứu 12,3% các bệnh nhân UTPKTBN có mang đột biến

gen KRAS. Trong các nghiên cứu lâm sàng, đột biến codon 12 và 13 của

KRAS đã được chứng minh là yếu tố gây kháng nguyên phát với các thuốc ức

chế EGFR [107]. Kết quả nghiên cứu cho thấy đột biến KRAS phổ biến nhất

xảy ra ở exon 2 chiếm 88,9% (16/18 trường hợp). Đột biến tại codon 12

chiếm đa số với 14/18 trường hợp (77,7%), cao gấp 7 lần đột biến tại codon

13 với 2/18 trường hợp (11,1%). Tỉ lệ này tương đồng nghiên cứu của

Nguyễn Minh Hà (2014) cho thấy đột biến codon 2 chiếm 82,2% và codon 3

chiếm 17,8% [2]. Trong số những trường hợp mang đột biến, loại đột biến

G12V (exon 2) chiếm tỉ lệ cao nhất (27,8%), tiếp đó đến đột biến G12C

(22,2%) và G12D (16,7%).

Nghiên cứu phát hiện thêm đột biến hiếm khác trên exon 3 như Q61H,

Q61R chiếm tỉ lệ thấp nhất (5,6%). Mặc dù một tỉ lệ đáng kể bệnh nhân

UTPKTBN được xác định mang đột biến KRAS, các thuốc trúng đích vào đột

biến KRAS vẫn đang được đánh giá lâm sàng [36].

4.2.4. Tỉ lệ các loại đột biến đồng thời của hai gen EGFR và KRAS

Trong nghiên cứu phát hiện 3,4% (5/146) trường hợp có kết hợp đột

biến KRAS cùng với sự hiện diện của đột biến EGFR. Đây là một yếu tố được

quan tâm đặc biệt, vì hai đột biến này luôn được coi là loại trừ lẫn nhau. Tuy

nhiên, khi ứng dụng kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện đột biến KRAS, như

kỹ thuật giải trình tự alen đột biến (mutant-allele sequencing), cũng có những

nghiên cứu ghi nhận đột biến KRAS gặp trong những trường hợp có đột biến

EGFR và là nguyên nhân kháng erlotinib và gefitinib nguyên phát [86].

Những bệnh nhân có đột biến KRAS có thể không đáp ứng với TKI. Kết quả

nghiên cứu cho thấy trong UTPKTBN cần khảo sát đồng thời cả hai đột biến

95

gen EGFR và KRAS để giúp chọn lựa bệnh nhân phù hợp cho điều trị đích

bằng erlotinib và gefitinib [31].

4.2.6. Tỉ lệ các loại đột biến của gen BRAF

Đột biến trong BRAF được phát hiện 2/146 trường hợp chiếm 1,4%, đều

là phụ nữ, không hút thuốc lá. Điều này phù hợp với sự các công bố hiện nay

là đột biến BRAF là đột biến hiếm gặp, chiếm khoảng 2% trong UTPKTBN

và thường xuyên xảy ra hơn ở những người không hút thuốc, phụ nữ [66].

Trong đó 1 trường hợp exon 11 (G649R) và 1 trường hợp exon 12

(K483N) với tỉ lệ bằng nhau 50%. Đột biến BRAF có thể được chia thành ba

loại dựa trên vị trí đột biến. Các đột biến loại I bao gồm V600E/ K/ D/ R, xuất

hiện trong gốc valine ở vị trí axit amin 600 của exon 15, thúc đẩy sự hoạt hóa

cấu thành của con đường MAPK và gây ra sự hoạt hóa mạnh mẽ

của BRAF kinase; loại đột biến này thường có độ nhạy cao với các chất ức

chế BRAF và MEK. Đột biến loại II, bao gồm đột biến K601, L597, G483 và

G649, nằm trong đoạn kích hoạt hoặc vòng lặp P và phát tín hiệu dưới dạng

dimer không phụ thuộc RAS. Các đột biến loại III xảy ra trong vòng P, vòng

xúc tác, hoặc mô típ DFG đã làm suy giảm hoạt động của BRAF kinase. Đột

biến BRAF thường được phân loại là đột biến V600 và đột biến không phải

V600 trong thực hành lâm sàng thường quy. Trên thực tế, khoảng 50% đột

biến BRAF trong UTPKTBN là đột biến không phải V600 [17].

Sorafenib, một chất ức chế BRAF thế hệ sớm, được phát triển như một

liệu pháp trúng đích đột biến BRAF. Dabrafenib và vemurafenib, chất ức

chế BRAF thế hệ mới, là chất ức chế cạnh tranh ATP của BRAF kinase. Cả

hai tác nhân đều đặc hiệu trong việc điều trị đích đột biến BRAF V600E.

Ngoài ra, một nghiên cứu gần đây cho thấy vemurafenib đặc biệt nhắm trúng

đích vào các đột biến BRAF V600 nhưng không hiệu quả ở những bệnh nhân

96

có đột biến BRAF không phải V600 [17]. Chính vì thế việc xét nghiệm các

dạng đột biến của gen BRAF là quan trọng trong điều trị.

4.2.7. Mối liên quan giữa các loại đột biến và giới tính

Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo mối liên quan đáng kể giữa sự phổ

biến của các đột biến gen và các đặc điểm bệnh lý lâm sàng của bệnh

nhân. Tuy nhiên, các kết quả thường không nhất quán giữa các nghiên cứu

khác nhau. Trong nghiên cứu, do đột biến BRAF và ALK chỉ có 2 trường hợp

cho mỗi loại đột biến, nên chúng tôi tập trung vào tìm mối liên quan của hai

đột biến gen thường gặp trong hơn 50% bệnh nhân UTPKTBN là EGFR và

KRAS với một số đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân. Mặc dù có lợi ích trong

việc sử dụng EGFR TKI cho liệu pháp đầu tay đối với tất cả các đột biến nhạy

cảm, nhưng trong các tình huống hạn chế về nguồn lực, việc sàng lọc mục

tiêu là cần thiết. Do đó, kiến thức về sự phổ biến của đột biến EGFR và KRAS

trong các phân nhóm bệnh nhân khác nhau có thể cung cấp thông tin về chính

sách và chiến lược xét nghiệm.

Chúng tôi đã thực hiện kiểm tra chi bình phương (χ²) để xác định mối

liên quan giữa giới tính của bệnh nhân và tỉ lệ mắc đột biến gen. Phù hợp với

các nghiên cứu trước đây, nghiên cứu cho thấy rằng đột biến EGFR thường

được phát hiện ở bệnh nhân nữ hơn bệnh nhân nam (62,5% so với 31,6%, p <

0,01). Kết quả này tương tự kết quả của Cai X (2014) khi phân tích đột biến

gen EGFR trên 76 bệnh nhân UTP cũng cho thấy tỉ lệ đột biến gen EGFR ở

nữ cao hơn ở nam với tỉ lệ tương ứng là 61,1% và 25,0% [22]. Nghiên cứu

IPASS (2011) cho thấy tỉ lệ đột biến gen EGFR ở BN UTBM tuyến ở nữ lên

tới 76,7% [35].

Ngược lại, tần suất đột biến KRAS ở nam cao hơn bệnh nhân nữ (14,3%

so với 8,3%), tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Các

nghiên cứu trước đây báo cáo rằng đột biến KRAS gặp ở người hút thuốc

97

thường xuyên hơn ở người không hút thuốc nên tần suất sẽ gặp ở nam nhiều

hơn nữ [31].

4.2.8. Mối liên quan giữa các loại đột biến và tuổi

Mặc dù trong nghiên cứu chưa tìm ra mối liên quan giữa tuổi bệnh nhân

và tỉ lệ đột biến của các gen EGFR , KRAS. Có thể do số lượng mẫu nghiên

cứu chưa đủ lớn để tìm ra mối liên quan. Trong nghiên cứu của Sacher A.G.

(2016) trên 2237 BN UTPKTBN cho thấy đột biến gen EGFR hay gặp hơn ở

người trẻ và thường có tiên lượng xấu. Theo tác giả Sacher A.G thì nguyên

nhân gây UTBM tuyến ở BN trẻ tuổi liên quan nhiều tới các đột biến gen như

EGFR, ALK, ROS1… do vậy khi chẩn đoán đột biến gen ở BN trẻ tuổi thì cần

xét nghiệm nhiều đột biến cùng một thời điểm và phác đồ điều trị cho các BN

UTBM tuyến ở người trẻ tuổi cần phải thay đổi so với các BN lớn tuổi [87].

Trong nghiên cứu trên 344 bệnh nhân Việt Nam cho thấy đột biến KRAS được

phát hiện thường xuyên hơn ở bệnh nhân tuổi cao trên 61 so với bệnh nhân trẻ

hơn (25,3% so với 20,1%, p <0,05), ngược lại, nhóm bệnh nhân trẻ hơn cho

thấy tỉ lệ lưu hành đột biến ALK (9,8% so với 3,5%, p < 0,05) và ROS1 (5,2%

so với 1,2%, p < 0,05) cao hơn nhóm trên 61 tuổi và cũng không có mối liên

quan giữa tuổi bệnh nhân và tỉ lệ đột biến của các gen EGFR , NRAS và BRAF

[26].

4.2.7. Mối liên quan giữa các loại đột biến và hút thuốc lá

Trong nghiên cứu có tới 66,9% BN có tiền sử hút thuốc lá. Nghiên cứu

phát hiện mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa tỉ lệ đột biến gen EGFR và

tình trạng hút thuốc. Nghiên cứu chỉ ra rằng những người không hút thuốc có

tần suất đột biến EGFR cao hơn đáng kể (65,9% so với 31,4%, p <0,01).

Nhiều nghiên cứu trước đây đã cho thấy đột biến gen EGFR gặp nhiều hơn ở

nữ giới và không hút thuốc như theo Wu J.Y (2011) khi nghiên cứu trên 327

BN UTPKTBN cho thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR là 52,0%, gặp nhiều hơn ở

98

nữ giới (p < 0,001) và những người không hút thuốc (p < 0,01) [114]. Còn

theo nghiên cứu của Shigematsu H. (2006) thì đột biến gen EGFR gặp phổ

biến ở nữ giới hơn là nam giới (38% so với 10% với p < 0,001), ở người

không hút thuốc nhiều hơn so với người hút thuốc (54% so với 16%; p <

0,001) [94].

Mặc dù đột biến KRAS đã được xác định trong UTP cách đây hơn 2 thập

kỷ, tầm quan trọng lâm sàng của tình trạng đột biến KRAS chỉ mới trở nên rõ

ràng gần đây, vì UTBM tuyến chứa đột biến KRAS thường biểu hiện không

đáp ứng với liệu pháp EGFR TKI. Không giống như đột biến EGFR, đột

biến KRAS cho thấy không có khuynh hướng giới tính, thường xảy ra ở người

da trắng hơn người châu Á và hầu hết bệnh nhân là người hút thuốc lá trước

đây hoặc hiện tại. Trong nghiên cứu chưa tìm thấy mối liên quan giữa đột

biến gen KRAS và hút thuốc lá. Tuy nhiên trong một nghiên cứu khi chúng tôi

khi thực hiện với số mẫu cao hơn công bố năm 2020 với 344 bệnh nhân

UTPKTBN Việt Nam cho thấy tần suất đột biến KRAS ở người hút thuốc cao

hơn đáng kể so với người không hút thuốc lá (29,6% so với 6,9%, p <0,001)

[26]. Điều này tương đương với Dogan S (2012) cho thấy đột biến KRAS xảy

ra ở 34% người hút thuốc và 6% người không bao giờ hút thuốc. Bên cạnh đó

nghiên cứu còn cho thấy ở những người không bao giờ hút thuốc, đột

biến KRAS phổ biến nhất là G12D, và G12C là đột biến thường xuyên ở

những người hút thuốc trước đây và hiện tại [31].

4.2.8. Mối liên quan giữa các loại đột biến và phân loại mô học

Nghiên cứu phát hiện mối liên quan giữa kiểu mô học và đột

biến EGFR với tỉ lệ hiện mắc ở nhóm UTBM tuyến cao hơn nhóm UTBM vảy

và tế bào lớn (46,2% so với 15,4% và 0%, p <0,05). Tác giả Wu (2011) cũng

cho thấy kết quả tương tự tỉ lệ đột biến gen EGFR nhiều hơn ở UTBM tuyến

[114]. Các bệnh nhân có mô bệnh học ở mức độ biệt hóa cao thì thường có đột

99

biến gen EGFR nên tiên lượng đáp ứng với TKI tốt hơn các bệnh nhân khác.

Điều này cũng tương tự với giả thuyết của Yoshida (2015) về vai trò của phân

loại giải phẫu bệnh và mối liên quan với tiên lượng đối với bệnh nhân

UTPKPTBN điều trị bằng TKI [116].

Như vậy, kết quả nghiên cứu phát hiện ra rằng bệnh nhân UTPKTBN là

phụ nữ, không hút thuốc và bị UTBM tuyến có nhiều khả năng mang đột

biến EGFR. Tương tự như các nghiên cứu trước đây tỉ lệ lưu hành đột biến

EGFR bị ảnh hưởng rõ ràng bởi các đặc điểm này và do đó khi không có hoặc

có thể thực hiện đầy đủ các biện pháp sàng lọc, có thể nhắm mục tiêu đến các

nhóm bệnh nhân này là những người có nhiều khả năng mang đột biến [120].

4.3. SO SÁNH SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN

EGFR GIỮA GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TỪ MÔ U VỚI

DIGITAL DROPLET PCR VÀ EGFR COBAS V2.

4.3.1. So sánh sự tương đồng giữa NGS mô u và ddPCR

Phương pháp phát hiện đột biến bằng Sanger ở mẫu mô u được xem

như tiêu chuẩn vàng, tuy nhiên, phương pháp này không đủ độ nhạy để phát

hiện những đột biến có tần suất thấp hơn 20% và không thể phát hiện những

đột biến mất đoạn và chuyển đoạn [73]. Kỹ thuật PCR vi giọt kỹ thuật số

được chứng minh có độ nhạy cao trong phát hiện các đột biến hiếm. ddPCR

được sử dụng để thẩm định kết quả giải trình tự NGS cho những đột biến ở

tần số thấp và xác định tỷ lệ của các cfDNA trong sinh thiết lỏng. ddPCR có

thể phát hiện đột biến có tần suất đột biến (MAF) xuống thấp đến mức

0,025% - 0,04% [69],[115]. Do vậy, để đánh giá được độ tin cậy của quy trình

NGS, chúng tôi sử dụng ddPCR để kiểm tra kết quả sinh thiết mô của 30 mẫu

mô đầu tiên thu được trong phát hiện ba đột biến chính của gen EGFR gồm

L858R, T790M, del19.

100

Khi so sánh với kết quả ddPCR, sự tương đồng giữa NGS mô u và

ddPCR là 96,7% (29/30 trường hợp) với chỉ số tương đồng Kappa ở mức độ

rất tốt (k= 0,86 ± 0,18). Trong 5 mẫu dương tính, 4 mẫu được xác định dương

tính tương đồng ở cả hai phương pháp NGS mô u và ddPCR. Tuy nhiên có 1

trường hợp âm tính với NGS nhưng dương tính với ddPCR. Đó là trường hợp

LBL021 dương tính với đột biến del19 bởi ddPCR nhưng bị bỏ sót bởi xét

nghiệm NGS. Trường hợp này có tần suất alen đột biến tương đối thấp (MAF

là 3,9%) dưới giới hạn phát hiện (LOD) của quy trình NGS (10%) nên được

ghi nhận là âm tính với NGS. Do đó, những kết quả này khẳng định rằng xét

nghiệm xác định trình tự bắt giữ mục tiêu của NGS đã đạt được xác định

chính xác các đột biến với MAF > 10% trong các mẫu mô FFPE.

Sự tương đồng cao giữa NGS mô u và ddPCR trong nghiên cứu phù

hợp với nghiên cứu của Jing và cộng sự (2018) trên 112 BN UTPKTBN cho

thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của NGS mô u so với ddPCR rất cao là 97,8% và

98,1% [45].

Tuy nhiên, chưa thể kiểm tra đối chứng tất cả các mẫu bằng ddPCR là

một giới hạn của nghiên cứu do khả năng kinh phí của đề tài.

4.3.2. So sánh sự tương đồng giữa NGS mô u và EGFR Cobas V2

Những tiến bộ hiện tại trong việc phân tích các bất thường phân tử đang

tăng lên nhanh chóng, khiến các bộ xét nghiệm được FDA chấp thuận khó

theo kịp và duy trì là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán, đặc biệt là trong các

lĩnh vực phát triển nhanh chóng như ung thư học. Tương tự đối với đột

biến EGFR trong UTPKTBN để điều trị bằng chất ức chế EGFR TKI. Xét

nghiệm EGFR Cobas V2 được FDA chấp thuận không bao gồm đầy đủ đột

biến trong miền tyrosine kinase dự đoán lợi ích tiềm năng từ liệu pháp TKI.

Tuy nhiên, việc phát hiện các đột biến không có trong các nghiên cứu về hiệu

101

quả của thuốc ban đầu đặt ra một tình huống khó trên lâm sàng cho các bác sĩ

điều trị. Với mong muốn không bỏ lỡ cơ hội mang lại cho bệnh nhân một liệu

pháp điều trị thành công, nhưng việc đưa ra quyết định lâm sàng để điều trị

hay không điều trị dựa trên một bất thường mới không nằm trong sự chấp

thuận ban đầu của FDA về thuốc là điều khó ứng dụng. Tuy nhiên điều quan

trọng vẫn là phải cung cấp dữ liệu toàn diện cho bác sĩ điều trị và cộng đồng

khoa học, chính vì thế ngày càng nhiều nghiên cứu về các phương pháp mới

được thực hiện.

Xét nghiệm đột biến cobas EGFR Cobas V2 là một xét nghiệm phản

ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực giúp xác định 42 đột biến ở exon

18, 19, 20 và 21 của gen EGFR, bao gồm cả đột biến kháng T790M. Xét

nghiệm đột biến gen EGFR Cobas V2 đã được xác nhận lâm sàng trong nhiều

nghiên cứu như một phương pháp quyết định điều trị cả liệu pháp EGFR TKI

thế hệ 1 và 2 ở những bệnh nhân UTPKTBN tiến triển. Xét nghiệm có thể

thực hiện đồng thời cả mẫu mô và huyết tương với thời gian cho kết quả

nhanh chóng với một bộ kit duy nhất. Thời gian cho kết quả xét nghiệm đối

với mô nhỏ hơn 8 giờ, với huyết tương nhỏ hơn 4 giờ. Các loại đột biến

EGFR có thể phát hiện bằng xét nghiệm đột biến EGFR Cobas V2 bao gồm:

exon 18 (G719X), exon 19 (29 loại del19), exon 20 (S768I, T790M, 5 loại

ins20), exon 21 (L858R, L861Q).

Khi so sánh xét nghiệm đột biến EGFR giữa NGS mô u với EGFR

Cobas V2, nghiên cứu ghi nhận sự tương đồng giữa 2 phương pháp là 92,5%

(135/146 trường hợp). Chỉ số tương đồng Kappa ở mức độ rất tốt (k= 0,84 ±

0,08).

Có 11 trường hợp không tương đồng giữa 2 phương pháp, trong đó 6

trường hợp Cobas ghi nhận âm tính nhưng được phát hiện dương tính với

NGS mô u và 5 trường hợp Cobas ghi nhận dương tính nhưng âm tính với

102

NGS mô u. Để giải thích sự không tương đồng, các trường hợp này được liệt

kê so sánh cụ thể ở bảng sau khi thực hiện đồng thời nhiều phương pháp.

Bảng 4.2: Phân tích các trường hợp không tương đồng giữa NGS mô u

và EGFR Cobas V2

NGS

ddPCR

Cobas mô u

Mẫu

Sinh thiết lỏng

Mô u FFPE

Mô u FFPE

Đột biến

LBL002 H773A L768C LBL008 (-) LBL013 ins20 LBL031 (-) LBL096 del19 LBL073 (-) LBL021 NA LBL105 (-) LBL072 NA TBL034 NA TBL080

MAF (%) 15 1.5 (-) 29 (-) 3 (-) NA (-) NA NA

Đột biến H773A L768C ins20 ins20 Ins20 Del19 (-) L858 (-) (-) (-)

MAF (%) 70 45 20 25 46 23 (-) 1 (-) (-) (-)

Sinh thiết lỏng MAF Đột (%) biến (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) NA NA NA NA del19 0.7 NA NA NA NA NA NA NA NA

Đột biến (-) (-) NA (-) NA NA del19 NA NA NA NA

MAF (%) (-) (-) NA (-) NA NA 3.94 NA NA NA NA

(-) (-) (-) (-) (-) (-) del19 L858R del19 L858R del19

6 trường hợp Cobas ghi nhận âm tính nhưng được phát hiện dương tính

với NGS mô u là các trường hợp LBL002, LBL008, LBL0013, LBL0031,

LBL096, LBL073. Loại đột biến trong 6 trường hợp này nằm ngoài 42 loại

đột biến có thể phát hiện bởi Cobas. Trong đó có 2 loại đột biến hiếm gặp là

H773A và L768C và các đoạn ins20 hay del19 là những đoạn mới ngoài vùng

phát hiện của EGFR Cobas V2. Như vậy với NGS mô u giúp phát hiện thêm

6/146 BN, tăng lên 4% BN được hưởng lợi từ liệu pháp điều trị đích trên đột

biến gen EGFR.

5 trường hợp Cobas ghi nhận dương tính nhưng âm tính với NGS mô u

là các trường hợp LBL021, LBL105, LBL071, TBL034, TBL080. Ở trường

hợp LBL021 phát hiện del19 ở Cobas và ddPCR sinh thiết lỏng cũng như

103

ddPCR mô u nhưng MAF rất thấp tương ứng là 0,7% và 3,94%. Các trị số

MAF này thấp hơn ngưỡng phát hiện (LOD là 10%) trong quy trình NGS mô

u. Ở trường hợp LBL105 ghi nhận có đột biến L858R ở Cobas đồng thời cũng

phát hiện được L858R ở NGS mô u nhưng vì MAF là 1% thấp hơn ngưỡng

phát hiện (10%) nên kết quả vẫn được ghi nhận là âm tính. 3 trường hợp còn

lại LBL072, TBL034, TBL080 có thể cũng do tần suất alen đột biến MAF

thấp tương tự 2 trường hợp trên, tuy nhiên không có kết quả ddPCR kiểm

chứng nên đây cũng là một hạn chế của đề tài.

4.3. SO SÁNH SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRONG PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN

GEN GIỮA NGS SINH THIẾT LỎNG VÀ NGS MÔ U, DIGITAL

DROPLET PCR VÀ EGFR COBAS V2.

Hiệp hội Ung thư Lâm sàng Hoa Kỳ (ASCO) đã tuyên bố rằng việc xác

định các đột biến gen là điều cần thiết để xây dựng các phác đồ điều trị tối ưu

cho bệnh nhân UTPKTBN [47]. Những hạn chế về kỹ thuật và lâm sàng của

sinh thiết mô truyền thống đòi hỏi sự phát triển của sinh thiết lỏng, là phương

pháp giúp phát hiện và định lượng các đột biến có nguồn gốc khối u từ

ctDNA được tìm thấy trong các mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư

.Việc lựa chọn nền tảng phân tích cho sinh thiết lỏng đòi hỏi phải đánh giá

thích hợp, có tính đến độ nhạy, độ lặp lại, khả năng phát hiện và tính khả thi

trong các cơ sở lâm sàng [57].

Việc phát hiện ctDNA từ cfDNA ở bệnh nhân ung thư gặp nhiều thử

thách lớn. Một thử thách lớn đó chính là phân biệt ctDNA từ cfDNA ở bệnh

nhân ung thư. Nếu ctDNA chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ trong tổng số cfDNA ở bệnh

nhân ung thư, gây khó khăn cho việc phát hiện đột biến sinh dưỡng từ huyết

tương. Trong nghiên cứu này áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới với độ

sâu lớn, tối thiểu 10.000X. Quy trình giải trình tự NGS với độ sâu lớn của

104

sinh thiết lỏng của nghiên cứu này cho phép phát hiện được đột biến ở cfDNA

với giới hạn phát hiện (LOD - Limits of Detection) là 1% (1 phân tử đột biến

trên 100 phân tử DNA), ngoại trừ gen EML4-ALK (phát hiện ở 2,5%).

4.3.1. So sánh tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và ddPCR trong phát

hiện đột biến gen EGFR

Bệnh nhân UTPKTBN có đột biến gen EGFR bao gồm xóa ở exon 19

(del19) hoặc đột biến điểm L858R ở exon 21 (L858R) cho thấy thời gian sống

sót không tiến triển lâu hơn sau khi được điều trị bằng gefitinib, một chất ức

chế tyrosine kinase (TKI). Tuy nhiên, những bệnh nhân được điều trị bằng

thuốc TKI thế hệ thứ nhất và thứ hai như afatinib và gefitinib thường phát

triển đột biến kháng TKI T790M ở EGFR exon 20 sau thời gian trung bình là

12 tháng. Trong những trường hợp như vậy, một loại thuốc TKI thế hệ thứ ba,

osimertinib, đã được chứng minh là có hiệu quả chống lại các tế bào mang đột

biến T790M [98]. Do đó việc phát triển sinh thiết lỏng là cực kỳ cần thiết

trong lâm sàng.

PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) đã được báo cáo là đạt được độ nhạy

và độ đặc hiệu cao để phát hiện các đột biến tần số thấp như đột biến trong

ctDNA từ huyết tương, với giới hạn phát hiện dưới 0,001% (1 bản sao DNA

đột biến trên 100.000 bản sao của nền DNA kiểu hoang dã) [43]. Sử dụng xét

nghiệm ddPCR (Bio-rad) có sẵn trên thị trường làm tiêu chuẩn tham chiếu,

chúng tôi đã tiến hành so sánh với NGS để phát hiện ba đột biến EGFR phổ

biến nhất (del19, L858R và T790M) trong 34 mẫu huyết tương thu được đầu

tiên của nghiên cứu. Tỉ lệ phù hợp giữa hai phương pháp là 97% (33/34 mẫu)

với chỉ số tương đồng Kappa ở mức độ rất tốt (k= 0,87 ± 0,17). Kết quả này

phù hợp với Stitz R (2021) khi phân tích so sánh các mẫu sinh thiết lỏng của

BN UTPKTBN, cho thấy sự phù hợp 91% giữa NGS và ddPCR [100]. Kết

105

quả này cho thấy NGS sinh thiết lỏng có thể được sử dụng để theo dõi ở bệnh

nhân đang điều trị EGFR TKI.

Trong đó có 4 trường hợp cả hai phương pháp đều thống nhất về đột

biến được xác định và 29 trường hợp nữa cũng đồng dạng khi không có bất kỳ

đột biến nào trong số 3 đột biến đích. Nên khi dùng ddPCR là một phương

pháp ngoại kiểm thì độ nhạy và độ đặc hiệu của NGS để phát hiện đột

biến EGFR trong mẫu huyết tương là 80% (4/5 mẫu), và độ đặc hiệu là 100%

(29/29 mẫu). Do đó cho thấy sự thống nhất tốt giữa hai phương pháp. Tổng

hợp lại, những kết quả này chứng minh rằng sinh thiết lỏng sử dụng giải trình

tự cực sâu đạt được sự đồng thuận tốt với ddPCR để phát hiện các đột biến từ

ctDNA trong các mẫu huyết tương.

Một trường hợp không tương đồng là trường hợp LBL021 dương tính

với đột biến del19 bởi ddPCR nhưng bị bỏ sót bởi xét nghiệm NGS do có tần

số alen biến thể tương đối quá thấp (MAF) tương ứng là 0,7% thấp hơn

ngưỡng phát hiện (LOD) của quy trình NGS sinh thiết lỏng (1%). Dữ liệu của

nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu trước đây báo cáo giá trị độ nhạy dao

động từ 70 đến 80% để phát hiện đột biến trong huyết tương của bệnh nhân

UTPKTBN tiến triển [25].

ddPCR đã được chứng minh là đạt được độ nhạy và độ chính xác cao

cho cả việc xác định và định lượng các đột biến trong ctDNA, cho phép đánh

giá sự tiến triển trong khối u của các dòng đột biến nhạy cảm với thuốc hoặc

kháng thuốc [105]. Tuy nhiên, công nghệ này chỉ cho phép phân tích một số

lượng hạn chế các đột biến cho mỗi phản ứng. Không giống như ddPCR,

NGS có khả năng phát hiện đột biến hoàn chỉnh của nhiều gen đồng thời.

Điều này mang lại lợi thế đặc biệt cho việc theo dõi sự tiến triển và tái phát

của khối u sau khi điều trị ban đầu, và có thể dẫn đến việc phát hiện ra các đột

106

biến mới có thể có ý nghĩa lâm sàng [118]. Với độ nhạy và độ chính xác

tương đương khi so sánh với ddPCR, chúng tôi tin rằng NGS là một phương

pháp đầy hứa hẹn có thể áp dụng cho sinh thiết lỏng.

4.3.2. So sánh sự tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và EGFR Cobas

V2 mô u trong phát hiện đột biến gen EGFR

Sinh thiết mô là tiêu chuẩn vàng phổ biến để chẩn đoán UTPKTBN ở

những bệnh nhân nghi ngờ bị UTP, và xét nghiệm khối u được sử dụng phổ

biến nhất để xác định các dấu ấn sinh học theo hướng dẫn điều trị. Tuy nhiên

khoảng 15 đến 40% các trường hợp UTPKTBN, xét nghiệm phân tử toàn diện

là không khả thi do không đủ mẫu mô và lấy mẫu một tổn thương đơn lẻ có

thể không phản ánh được toàn cảnh bộ gen do sự không đồng nhất về phân tử

của các khối u. Nguy cơ biến chứng cũng là một mối quan tâm khác, tăng lên

61% khi sử dụng sinh thiết kim qua lồng ngực, và tỷ lệ tràn khí màng phổi

cũng tăng đáng kể ở những bệnh nhân lớn tuổi bị bệnh phổi tắc nghẽn mạn

tính. Do đó sinh thiết lỏng thể hiện những ưu điểm của một kỹ thuật không

xâm lấn mà không gây khó chịu, có thể được lặp lại bất cứ khi nào cần thiết

trong quá trình điều trị của bệnh nhân.

Theo hướng dẫn của NCCN (National Comprehensive Cancer

Network: Mạng lưới ung thư quốc gia) khuyến cáo sinh thiết lỏng là tiếp cận

đầu tiên để xét nghiệm EGFR T790M ở những bệnh nhân đã phát triển đề

kháng với thuốc ức chế tyrosine kinase thế hệ thứ nhất, sinh thiết mô được

khuyến nghị trong trường hợp xét nghiệm huyết tương là âm tính. Sinh thiết

lỏng trong các trường hợp lâm sàng cụ thể khi bệnh nhân không đủ điều kiện

về mặt y tế để lấy mẫu mô xâm lấn hoặc khi mẫu mô khối u không đủ hoặc

không thể lấy được, sau khi xác nhận chẩn đoán bệnh lý. Điều này phù hợp

với Khuyến cáo mới nhất từ Hiệp hội Quốc tế về Nghiên cứu Ung thư Phổi

107

(IASLC) về sinh thiết lỏng cho UTPKTBN, trong đó sinh thiết lỏng được

khuyến cáo cho các trường hợp không có sẵn mẫu mô (phương pháp tiếp cận

“huyết tương đầu tiên”) hoặc trong các trường hợp nơi sinh thiết mô không đủ

để tiến hành định dạng gen mô toàn diện (phương pháp “bổ sung”). Hơn nữa,

theo các khuyến nghị của IASLC, đối với các trường hợp UTPKTBN tiến

triển sau liệu pháp nhắm trúng đích ban đầu, phương pháp tiếp cận “huyết

tương đầu tiên” nên được coi là tiêu chuẩn thực hiện đầu tiên.

Kết quả chẩn đoán giữa NGS sinh thiết lỏng và EGFR Cobas V2 mô u

cho thấy sự tương đồng 86,9% (53/61 trường hợp) với chỉ số tương đồng

Kappa ở mức độ tốt (k= 0,63 ± 0,12). Kết quả này phù hợp với Papadopoulou

E (2019) cho thấy tỉ lệ phù hợp 82% giữa cobas và NGS đối với đột biến nhạy

cảm EGFR (ở exons 18, 19, 21) [72].

Có 8 trường hợp không tương đồng giữa hai phương pháp, trong đó có

4 trường hợp Cobas mô u ghi nhận dương tính nhưng âm tính với NGS sinh

thiết lỏng và 4 trường hợp Cobas mô u ghi nhận âm tính nhưng được phát

hiện dương tính với NGS sinh thiết lỏng

Bảng 4.3: Phân tích các trường hợp không tương đồng giữa NGS sinh

thiết lỏng và EGFR Cobas V2 mô u

NGS

ddPCR

Cobas mô u

Mẫu

Sinh thiết lỏng

Mô u FFPE

Mô u FFPE

Đột biến

LBL002 H773A L768C LBL008 ins20 LBL031 del19 LBL073 (-) LBL021 (-) LBL026 (-) LBL030

MAF (%) 15 1.5 29 3 (-) (-) (-)

Đột biến H773A L768C ins20 Del19 (-) Del19 Del19

MAF (%) 70 45 25 23 (-) 23 18

Sinh thiết lỏng MAF Đột (%) biến (-) (-) (-) (-) (-) (-) NA NA del19 0.7 (-) (-) (-) (-)

Đột biến (-) (-) (-) NA del19 Del19 Del19

MAF (%) (-) (-) (-) NA 3.94 25,57 6,77

(-) (-) (-) (-) del19 del19 del19

LBL079

(-)

(-)

Del19

47

NA

NA

NA

NA

del19

108

Có 4 trường hợp không phát hiện đột biến với Cobas mô u nhưng được

phát hiện với NGS sinh thiết lỏng. Trong đó phát hiện các đột biến mới ngoài

danh mục các đột biến có thể phát hiện bằng Cobas như H773A (mẫu

LBL002), L768C (mẫu LBL008), 1 trường hợp ins20 mới (LBL031) và 1

del19 mới (LBL073). Do đó nếu như xem sinh thiết lỏng là phương pháp bổ

sung trong trường hợp không thể sinh thiết mô thì có thêm 6,5% (4/61) bệnh

nhân được hưởng lợi từ liệu pháp điều trị nhắm trúng địch trên đột biến

EGFR.

Có 4 trường hợp Cobas mô u ghi nhận dương tính nhưng âm tính với

NGS sinh thiết lỏng. Trường hợp LBL021 phát hiện del19 ở Cobas mô u và

ddPCR sinh thiết lỏng nhưng MAF rất thấp (0,7%) thấp hơn ngưỡng phát hiện

(1%) trong quy trình NGS sinh thiết lỏng. Các trường hợp còn lại nồng độ

cfDNA thấp dưới ngưỡng phát hiện của cả ddPCR và NGS sinh thiết lỏng.

4.3.3. So sánh sự tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng và sinh thiết mô

trong phát hiện 6 gen EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS.

Mục đích của nghiên cứu muốn khảo sát khả năng sinh thiết lỏng có thể

thay thế được sinh thiết mô nên sử dụng các mẫu có đồng thời huyết tương và

mô u để kiểm tra xem liệu sinh thiết lỏng có thể phát hiện các kiểu hình đột

biến được tìm thấy trong các mô khối u hay không.

Trong 61 mẫu giải trình tự cả mẫu huyết tương và mô khối u, kết quả

chẩn đoán giữa NGS sinh thiết lỏng và sinh thiết mô u cho thấy sự tương

đồng 86,9% (53/61 trường hợp) với chỉ số tương đồng Kappa ở mức độ tốt

(k= 0,73 ± 0,12). Sử dụng kết quả NGS mô u làm tiêu chuẩn tham chiếu,

109

chúng tôi ghi nhận được độ nhạy là 75,9%, độ đặc hiệu là 96,9% cho quy

trình sinh thiết lỏng với độ sâu lớn. Kết quả này phù hợp với Hanibuchi M

(2019) thực hiện NGS trên 45 BN UTPKTBN ở cả mô u và sinh thiết lỏng ghi

nhận sự tương đồng là 64%, độ nhạy là 67%, độ đặc hiệu là 98% [40]. Kết

quả này cũng phù hợp với tiêu chuẩn của bộ kit sinh thiết lỏng Cobas (Roche)

đã được FDA (Hoa Kỳ) chấp thuận và dữ liệu tổng hợp từ 27 nghiên cứu về

sinh thiết lỏng trên 3.110 bệnh nhân [83]. Đồng thời kết quả cũng tương tự

như Mok T (2015) nghiên cứu trên 238 BN có mẫu máu và mô ghép đôi, cho

thấy độ nhạy là 75% và độ đặc hiệu là 96% [60]. Nghiên cứu của Park S và

cộng sự (2021) thực hiện NGS trên 262 mẫu mô và huyết tương của BN

UTPKTBN cho kết quả sự tương hợp 77,6%, độ nhạy của NGS sinh thiết

lỏng so với mô u là 67,7% và độ đặc hiệu là 88,8% [71].

Bảng 4.4: Phân tích các trường hợp không tương đồng giữa NGS sinh

thiết lỏng và NGS mô u

NGS

ddPCR

Cobas mô u

Mẫu

Sinh thiết lỏng

Mô u FFPE

Mô u FFPE

Đột biến

Đột biến (-) (-) (-) (-) del19 (-) (-) G13

MAF (%) (-) (-) (-) (-) 0,5 (-) (-) 8

Đột biến del19 del19 del19 L858 del19 ins20 G12 (-)

MAF (%) 23 18 47 18 15 20 43 (-)

LBL026 LBL030 LBL079 LBL069 LBL087 LBL013 LBL083 LBL076

del19 del19 del19 L858R del19 (-) (-) (-)

Sinh thiết lỏng MAF Đột (%) biến (-) (-) (-) (-) NA NA NA NA NA NA (-) (-) NA NA NA NA

Del19 Del19 NA NA NA NA NA NA

MAF (%) 25,57 6,77 NA NA NA NA NA NA

Các trường hợp chỉ phát hiện đột biến trên mẫu mô u, nhưng lại không

quan sát thấy đột biến ở mẫu sinh thiết lỏng là do lượng ctDNA trong huyết

tương thấp dưới ngưỡng LOD như trường hợp LBL026, LBL030 đều dương

tính ở cả mô u bao gồm NGS, ddPCR và Cobas nhưng vì ctNDA thấp nên

110

NGS và cả ddPCR cũng không thể phát hiện đột biến trong mẫu sinh thiết

lỏng. Bên cạnh đó, trong số các đột biến phát hiện được, có 1 đột biến ở mẫu

sinh thiết lỏng có MAF <1% (mẫu LBL087), dưới giới hạn phát hiện của

chúng tôi (1%).

Ngược lại, một trường hợp phát hiện đột biến trên cfDNA nhưng không

tìm thấy ở mẫu mô u (LBL076). Điều này được giải thích do sự không đồng

nhất của khối u. Nhiều nghiên cứu cho thấy, khối u có đặc tính đa dạng di

truyền rất lớn do có nhiều dòng tế bào với những tập hợp đột biến khác nhau

được phân bố ở những vị trí khác nhau trên mô u. Vì vậy, sinh thiết lỏng có

khả năng phản ánh đặc tính di truyền của toàn bộ khối u tốt hơn so với phương

pháp sinh thiết mô u truyền thống (vì chỉ sinh thiết một phần nhỏ trên mô u).

Để giải quyết những vấn đề này, các hướng dẫn hiện tại của ASCO khuyến

nghị rằng kết quả xét nghiệm dương tính trong huyết tương sẽ cho phép đưa

ra kết luận cuối cùng về sự hiện diện của đột biến và kết quả xét nghiệm kiểu

hoang dã trong sinh thiết lỏng được kiểm tra lại bằng sinh thiết mô [57].

Với tỷ lệ phù hợp cao 88,5% (54/61 trường hợp) giữa sinh thiết lỏng và

mô, kết quả của nghiên cứu làm nổi bật ứng dụng tiềm năng của sinh thiết

lỏng như một xét nghiệm thường quy trong thực hành lâm sàng để phát hiện

các đột biến gen ở bệnh nhân UTPKTBN. Kết quả này cũng phù hợp với

nghiên cứu của Douillard công bố 2014 nghiên cứu trên 199 BN, tỷ lệ phù

hợp giữa sinh thiết lỏng và mô là 90% [32].

111

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu 146 bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn cuối (IIIB –IV) được

làm xét nghiệm đột biến 6 gen liên quan đến điều trị đích (EGFR, ALK,

ROS1, BRAF, KRAS, NRAS) tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch từ tháng 9/2018

đến tháng 9/2020 cho thấy kết quả như sau:

1. Tỉ lệ các đột biến gen liên quan đến điều trị đích (EGFR, ALK, ROS1,

BRAF, KRAS, NRAS) ở BN UTPKTBN

- 60,2% BN có ít nhất 1 đột biến gen

- EGFR là gen đột biến thường gặp nhất chiếm 41,7%; đột biến KRAS chiếm

12,3%; ALK chiếm 1,4%; BRAF chiếm 1,4%; đột biến kép EGFR và KRAS

chiếm 3,4%. Chưa tìm thấy đột biến gen ROS1 và NRAS trong nghiên cứu

này.

- Trong đột biến EGFR:

+ Chủ yếu được phát hiện ở exon 21 và exon 19. Đột biến ở exon 21 chiếm

tỉ lệ cao nhất với 42,6%. Đột biến ở exon 19 chiếm tỉ lệ 37,7%, exon 20

chiếm 14,7%. Ngoài ra, các đột biến ở exon 18 hiếm gặp hơn, chiếm tỉ lệ

4,9% và xuất hiện kết hợp với exon 20, exon 21.

+ Đột biến L858R chiếm tỉ lệ cao nhất là 42,6%. Đột biến del19 chiếm tỉ lệ

37,7%. Đột biến ins20 chiếm 11,5%. Ngoài ra, các đột biến hiếm gặp khác

cũng được phát hiện như H773A, L768C, G719A, G719C, S768I ,

G719D, L861Q với tỉ lệ lưu hành 1,6 đến 3,3%.

- Trong đột biến KRAS:

+ Đột biến ở exon 2 chiếm 88,9%, exon 3 chiếm 11,1%

+ Đột biến G12V chiếm tỉ lệ cao nhất (27,8%), đột biến G12C (22,2%) và

G12V (16,7%). Các đột biến hiếm khác trên exon 3 như Q61H, Q61R

chiếm tỷ lệ thấp nhất (5,6%).

112

- Đột biến BRAF xảy ra ở exon 11 (G649R) và exon 12 (K483N) với tỉ lệ

bằng nhau 50%.

- Tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nhóm BN nữ (62,5%) cao hơn nhóm BN nam

(31,6%) có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.

- Tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nhóm BN không hút thuốc lá (65,9%) cao hơn

nhóm BN hút thuốc lá (31,4%) có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.

- Tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nhóm BN UTBM tuyến (46,2%) cao hơn nhóm

BN UTBM vảy (15,4%) có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.

2. So sánh sự tương đồng trong phát hiện đột biến gen EGFR giữa NGS

mô u với ddPCR và EGFR Cobas V2

- Tỉ lệ tương đồng giữa NGS mô u với ddPCR trong phát hiện ba đột biến

chính của gen EGFR (L858R, del19, T790M) là 96,7% với chỉ số kappa là

0,86.

- Tỉ lệ tương đồng giữa NGS mô u với EGFR Cobas V2 trong phát hiện đột

biến EGFR là 92,5% với chỉ số kappa là 0,84.

3. So sánh sự tương đồng trong phát hiện các đột biến gen EGFR giữa

NGS sinh thiết lỏng với NGS mô u, ddPCR và EGFR Cobas V2

- Tỉ lệ tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng với ddPCR trong phát hiện ba

đột biến chính của gen EGFR (L858R, del19, T790M) là 97% với chỉ số

kappa là 0,87.

- Tỉ lệ tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng với EGFR Cobas V2 trong

phát hiện đột biến EGFR là 86,9% với chỉ số kappa là 0,63.

- Tỉ lệ tương đồng giữa NGS sinh thiết lỏng với NGS mô u trong phát hiện

đột biến EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS là 86,9% với chỉ số

kappa là 0,73. Sử dụng kết quả NGS mô u làm tiêu chuẩn tham chiếu,

NGS sinh thiết lỏng có độ nhạy 75,9%, độ đặc hiệu 96,9%.

113

KIẾN NGHỊ

1. Cần xét nghiệm tìm đột biến gen EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS để

định hướng điều trị đích bước 1 tốt nhất cho bệnh nhân UTPKTBN giai

đoạn muộn.

2. Nên sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới nhằm khảo sát đồng thời các

gen liên quan đến điều trị đích và giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh

nhân.

3. Nên sử dụng giải trình tự gen thế hệ mới từ sinh thiết lỏng khi không thể

sinh thiết mô u và theo dõi điều trị cho bệnh nhân.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ

NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1. Các tác giả (2020), “Áp dụng sinh thiết lỏng phát hiện đột biến gen

EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ” (2020), Y học

TP. Hồ Chí Minh, 24(2), tr.101-107..

2. Các tác giả (2020), “Khảo sát tỉ lệ đột biến gen ALK và ROS1 trên

bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ” (2020), Y học TP. Hồ Chí

Minh, 24(2), tr.108-113.

3. Authors (2020). “Actionable Mutation Profiles of Non-Small Cell

Lung Cancer patients from Vietnamese population.” Scientific reports,

10(1):2707. doi: 10.1038/s41598-020-59744-3.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Ngô Quý Châu (2008), Ung thư phổi, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

2. Nguyễn Minh Hà (2014), Xác định đột biến gen EGFR và gen KRAS

quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị bệnh ung thư phổi không tế

bào nhỏ, Luận văn tiến sĩ, Trường Đại học Y Hà Nội.

3. Nguyễn Minh Hà, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh (2014), "Đột biến

gen EGFR và KRAS ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ giai

đoạn cuối", Tạp chí Y dược lâm sàng 108, 9, tr. 82 –88.

4. Nguyễn Thị Thái Hòa (2021), "Kết quả điều trị ung thư phổi không tế

bào nhỏ có đột biến EGFR hiếm bằng thuốc ức chế tyrosine kinase

(TKIs) thế hệ 1 và 2", Tạp Chí Y học Việt Nam, 501(2).

5. Lê Hoàn (2010), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và bước

đầu áp dụng phân loại TNM 2009 cho ung thư phổi nguyên phát tại

khoa Hô hấp bệnh viện Bạch Mai, Luận văn Bác sĩ nội trú, Đại học Y

Hà Nội.

6. Mai Trọng Khoa, Trần Đình Hà, Phạm Cẩm Phương và cộng sự (2016),

"Xác định đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không tế

bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai”, Tạp chí Ung thư học Việt Nam, 3, tr.

271-277.

7. Nguyễn Thị Lựu (2013), Đánh giá hiệu quả phác đồ Paclitaxel phối

hợp Carboplatin trong điều trị ung thư phổi biểu mô tuyến giai đoạn IV

chưa di căn não. Luận văn Thạc sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.

8. Phạm Thị Mai, Nguyễn Văn Ba, Hồ Hữu Thọ và cộng sự (2021), "Đột

biến gen EGFR và mối liên quan với một số yếu tố lâm sàng ở bệnh

nhân ung thư biểu mô tuyến phổi", Tạp Chí Nghiên cứu Y học, 137(1),

tr. 111-117.

9. Nguyễn Hoài Nga, Bùi Diệu, Trần Văn Thuấn (2014), "Một số đặc

điểm dịch tễ, lâm sàng, cận lâm sàng ung thư phổi nguyên phát chẩn

đoán điều trị tại bệnh viện K trong 10 năm từ 2001 đến 2010", Tạp chí

Ung thư học Việt Nam, 2, tr. 71-80.

10. Nguyễn Hoài Nghĩa, Đỗ Đức Minh, Hoàng Anh Vũ (2020), “ Xây

dựng quy trình phát hiện đột biến gen từ mẫu sinh thiết lỏng bằng

công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới với ứng dụng trong chẩn đoán

và điều trị ung thư”, Trung tâm Thông tin và Thống kê khoa học và

công nghệ, URL: https://cesti.gov.vn/bai-viet/CTDS5/xay-dung-quy-

trinh-phat-hien-dot-bien-gen-tu-mau-sinh-thiet-long-bang-cong-nghe-

giai-trinh-tu-gen-the-he-moi-voi-ung-dung-trong-chan-doan-dieu-tri-

ung-thu-01010491-0000-0000-0000-000000000000.

11. Nguyễn Thị Băng Sương, Nguyễn Hữu Huy, Nguyễn Hoàng Bắc

(2020), "Nghiên cứu tỉ lệ đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi

không tế bào nhỏ tại bệnh viện Đại học y dược TP. Hồ Chí Minh", Tạp

chí y học thành phố Hồ Chí Minh, 24(2), tr. 126-131.

12. Phạm Văn Thái (2015), Nghiên cứu điều trị ung thư phổi di căn não

bằng hóa xạ trị, Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.

13. Trần Huy Thịnh, Lê Hoàn, Trần Vân Khánh (2022), "Tỷ lệ đột biến

gen EGFR và đột biến dung hợp gen EML4-ALK, ROS1 ở bệnh nhân

ung thư phổi không tế bào nhỏ", Tạp Chí Y học Việt Nam, 514(2), tr.

88-96.

14. Vũ Văn Thịnh (2014), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cân lâm sàng

của bệnh nhân ung thư phổi typ biểu mô tuyến điều trị tại Trung tâm

Hô hấp bệnh viện Bach Mai, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ đa khoa, Đại

học Y Hà Nội.

15. Hoàng Anh Vũ, Cao Văn Động, Ngô Thị Tuyết Hạnh và cộng sự

(2011), "Đột biến gen EGFR và KRAS trên bệnh nhân ung thư phổi

không tế bào nhỏ", Tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh, 15(4), tr.

166 - 172.

Tiếng Anh

16. AACR Project GENIE Consortium (2017), "AACR Project GENIE:

Powering Precision Medicine through an International Consortium",

Cancer Discov; 7(8), pp. 818-831.

17. Alvarez J. B. , Otterson G. A. (2019), "Agents to treat BRAF-mutant

lung cancer", Drugs Context, 8, pp. 212566 -212590.

18. Balak M. N., Gong Y., Riely G. J., et al. (2006), "Novel D761Y and

common secondary T790M mutations in epidermal growth factor

receptor-mutant lung adenocarcinomas with acquired resistance to

kinase inhibitors", Clin Cancer Res,12(21), pp. 6494-6501.

19. Bergethon K., Shaw A. T, Ou S. H., et al. (2012), "ROS1

rearrangements define a unique molecular class of lung cancers", J Clin

Oncol, 30 (8), pp. 863-870.

20. Birring S. S., Peake M. D. (2005), "Symptoms and the early diagnosis

of lung cancer", Thorax, 60, pp. 268–269.

21. Brown P. (2016), "The Cobas® EGFR Mutation Test v2 assay",

Future Oncol,12(4), pp. 451-2

22. Cai X., Sheng J., Tang C., et al. (2014), "Frequent mutations in EGFR,

KRAS and TP53 genes in human lung cancer tumors detected by ion

torrent DNA sequencing", PLoS One, 9(4), pp. 1-15.

23. Chin L. P., Soo R. A., Soong R., et al. (2012), "Targeting ROS1 with

anaplastic lymphoma kinase inhibitors: a promising therapeutic strategy

for a newly defined molecular subset of non-small-cell lung cancer", J

Thorac Oncol, 7 (11), pp. 1625-1630.

24. Couraud S., Vaca-Paniagua F., Villar S., et al. (2014), "Noninvasive

diagnosis of actionable mutations by deep sequencing of circulating

free DNA in lung cancer from never-smokers: a proof-of-concept study

from BioCAST/IFCT-1002", Clinical cancer research: an official

journal of the American Association for Cancer Research, 20, pp.

4613–24.

25. Crowley E., Di Nicolantonio F., Loupakis F., et al. (2013, "Liquid

biopsy: monitoring cancer genetics in the blood", Nat Rev Clin Oncol,

10(8), pp. 472-484.

26. Dang A. T. H., Tran V. U., Tran T. T., et al. (2020), "Actionable

Mutation Profiles of Non-Small Cell Lung Cancer patients from the

Vietnamese population", Sci Rep, 10, pp. 2707.

27. Davies K. D., Le A. T., Theodoro M. F., et al. (2012), "Identifying

and* targeting ROS1 gene fusions in non-small cell lung cancer", Clin

Cancer Res, 18(17), pp. 4570-4579.

28. Davies H., Bignell G. R., Cox C., et al. (2002), "Mutations of the

BRAF gene in human cancer", Nature, 417(6892), pp. 949-954.

29. Deprez L., Corbisier P., Kortekaas A. M., et al. (2016), "Validation of

a digital PCR method for quantification of DNA copy number

concentrations by using certified reference material", Biomol Detect

Quantif, 9, pp. 29-39.

30. Diehl F., Schmidt K., Choti M. A., et al. (2008), "Circulating mutant

DNA to assess tumor dynamics", Nature Medicine, 14, pp. 985.

31. Dogan S., Shen R., Ang D. C., et al. (2012), "Molecular epidemiology

of EGFR and KRAS mutations in 3026 lung adenocarcinomas", Clin.

Cancer Res, 18, pp. 6169–6177.

32. Douillard J. Y., Ostoros G., Cobo M., et al. (2014), "Gefitinib

treatment in EGFR mutated caucasian NSCLC: circulating-free tumor

DNA as a surrogate for determination of EGFR status", J Thorac

Oncol, 9(9), pp. 1345-1353.

33. Dunn G. P., Bruce A. T., Ikeda H., et al. (2002), "Cancer

immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape", Nat

Immunol, 3, pp. 991–998.

34. Edge S. B. , Compton C. C. (2010), "The American Joint Committee

on Cancer: the 7th edition of the AJCC cancer staging manual and the

future of TNM", Ann Surg Oncol, 17(6), pp. 1471-1474.

35. Fukuoka M., Wu Y. L., Thongprasert S., et al. (2011), "Biomarker

analyses and final overall survival results from a phase III, randomized,

open-label, first-line study of gefitinib versus carboplatin/paclitaxel in

clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer in

Asia (IPASS)", J Clin Oncol, 29(21), pp. 2866-2874.

36. Garrido P., Olmedo M. E., Gómez A., et al. (2017), "Treating KRAS-

mutant NSCLC: latest evidence and clinical consequences", Ther Adv

Med Oncol, 9, pp. 589–597.

37. Gedvilaitė V., Schveigert D., Cicėnas S., et al. (2017), "Cell-free DNA

in non-small cell lung cancer", Acta Med Litu, 24 (2), pp. 138-144.

38. Gurrola C., Gonzalez S., Troyo S., et al. (2009), "Lung cancer

histological types and diagnostic methods in a tertiary care facility",

Gaceta médica de México, 145, pp. 97-101.

39. Hallberg B., Palmer R. H. (2016), "The role of the ALK receptor in

cancer biology", Ann Oncol, 27 Suppl 3, pp. iii4-iii15.

40. Hanibuchi M., Kanoh A., Kuramoto T., et al. (2019), "Development,

validation, and comparison of gene analysis methods for

detecting EGFR mutation from non-small cell lung cancer patients-

derived circulating free DNA", Oncotarget, 10(38), pp. 3654-3666.

41. Harold L., Kundel , Marcia P. (2003), “Measurement of Observer

Agreement”, Radiology, 228, pp. 303–308.

42. Heitzer E., Ulz P., Geigl J. B. (2015), "Circulating tumor DNA as a

liquid biopsy for cancer", Clin Chem, 61 (1), pp. 112-123.

43. Hindson B. J,, Ness K. D., Masquelier D. A., et al. (2011), "High-

throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of

DNA copy number", Analytical chemistry, 83, pp. 8604–8610.

44. Horn L. (2009), "EML4-ALK: honing in on a new target in non-small-

cell lung cancer", J. Clin. Oncol, 26, pp. 4232–4235

45. Jing C., Mao X., Wang Z., et al. (2018), "Next-generation sequencing-

based detection of EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, PIK3CA, Her-2, and

TP53 mutations in patients with non-small cell lung cancer", Mol Med

Rep, 18(2), pp. 2191-2197.

46. Jordan E. J., Kim H. R., Arcila M. E., et al. (2017), "Prospective

Comprehensive Molecular Characterization of Lung Adenocarcinomas

for Efficient Patient Matching to Approved and Emerging

Therapies", Cancer Discov, 7(6), pp. 596-609.

47. Kalemkerian G., Narula N., Kennedy E. (2018), "Molecular Testing

Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With

Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors", Oncol. Pract, 14, pp. 323–327

48. Khozin S., Blumenthal G. M., Jiang X., et al. (2014), "U.S. Food and

Drug Administration approval summary: Erlotinib for the first-line

treatment of metastatic non-small cell lung cancer with epidermal

growth factor receptor exon 19 deletions or exon 21 (L858R)

substitution mutations", Oncologist, 19(7), pp. 774-779.

49. Kim H. R., Lim S. M., Kim H. J., et al. (2013), "The frequency and

impact of ROS1 rearrangement on clinical outcomes in never smokers

with lung adenocarcinoma", Ann Oncol, 24(9), pp. 2364-2370.

50. Kim S. S., Choi H. J., Kim J. J., et al. (2018), "Droplet digital PCR-

based EGFR mutation detection with an internal quality control index

to determine the quality of DNA", Scientific reports, 8:543,

pmid:29323170.

51. Kosaka T., Yatabe Y., Onozato R., et al. (2009), "Prognostic

implication of EGFR, KRAS, and TP53 gene mutations in a large cohort

of Japanese patients with surgically treated lung adenocarcinoma", J

Thor Oncol, 9;4(1), pp. 22.

52. Kris M. G., Johnson B. E., Kwiatkowski D. J., et al. (2011),

"Identification of driver mutations in tumor specimens from 1,000

patients with lung adenocarcinoma: The NCI’s Lung Cancer Mutation

Consortium (LCMC) ", J. Clin. Oncol, 29, pp. 7506-7525.

53. Lim S. M., Chang H., Cha Y. J., et al. (2017), "Validation of

ALK/ROS1 Dual Break Apart FISH Probe probe in non-small-cell lung

cancer", Lung Cancer, 111, pp. 79-83

54. Lo Russo G., Imbimbo M., Corrao G., et al. (2017), "Concomitant

EML4-ALK rearrangement and EGFR mutation in non-small cell lung

cancer patients: a literature review of 100 cases", Oncotarget, 8(35), pp.

59889–59900.

55. Mardis E. R. (2008), "The impact of next-generation sequencing

technology on genetics", Trends Genet, 24(3), pp. 133-41.

56. McCain J. (2013), "The MAPK (ERK) Pathway: Investigational

Combinations for the Treatment Of BRAF-Mutated Metastatic

Melanoma", P T, 38 (2), pp. 96- 108.

57. Meador C., Hu Y., Yang J. C. et al. (2018), "Refining the sensitivity

of plasma cell-free DNA (cfDNA) genotyping by controlling for

plasma tumor content", Journal of Clinical Oncology , 36, pp. 9071.

58. Mirsadraee S., Oswal D., Alizadeh Y., et al. (2012), "The 7th lung

cancer TNM classification and staging system: Review of the changes

and implications", World J Radiol, 4(4), pp. 128-34.

59. Mitsudomi T., Yatabe Y. (2010), "Epidermal growth factor receptor in

relation to tumor development: EGFR gene and cancer", FEBS J, 277,

pp. 301-308.

60. Mok T., Wu Y. L., Lee J. S., et al. (2015), "Detection and Dynamic

Changes of EGFR Mutations from Circulating Tumor DNA as a

Predictor of Survival Outcomes in NSCLC Patients Treated with First-

line Intercalated Erlotinib and Chemotherapy", Clin Cancer Res,

21(14), pp. 3196-203.

61. Morgensztern D., Campo M. J., Dahlberg S. E., et al. (2015),

"Molecularly targeted therapies in non-small-cell lung cancer annual

update 2014", J Thorac Oncol, 10 (1 Suppl 1), pp. 51-63.

62. Murakami S., Yokose T., Shinada K., et al. (2022), "Comparison of

next-generation sequencing and cobas® EGFR Mutation Test v2 in

detecting EGFR mutations", doi:10.21203/rs.3.rs-1584037/v2.

63. Nakajima E. C., Drezner N., Li X., et al. (2022), "FDA Approval

Summary: Sotorasib for KRAS G12C-Mutated Metastatic NSCLC",

Clin Cancer, 28(8), pp. 1482-1486.

64. Newman A., Bratman S., To J., et al. (2014), "An ultrasensitive

method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient

coverage", Nat Med, 20 (5), pp. 548- 554.

65. Nguyen K. S., Kobayashi S., Costa D. B. (2009), "Acquired resistance

to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in non-

small-cell lung cancers dependent on the epidermal growth factor

receptor pathway", Clin Lung Cancer, 10(4), pp. 281-289.

66. Nguyen-Ngoc T., Bouchaab H., Adjei A. A., et al (2015), "BRAF

Alterations as Therapeutic Targets in Non-Small-Cell Lung Cancer", J

Thorac Oncol, 10(10), pp. 1396-403.

67. Odogwu L., Mathieu L., Blumenthal G., et al. (2018), "FDA Approval

Summary: Dabrafenib and Trametinib for the Treatment of Metastatic

Non–Small Cell Lung Cancer", Oncologist, 6, pp. 740–745.

68. Ohashi K., Sequist L. V., Arcila M. E., et al. (2013), "Characteristics

of lung cancers harboring NRAS mutations", Clin Cancer Res, 19 (9),

pp. 2584-2591.

69. Oskina N., Oscorbin I., Khrapov E., et al. (2017), "Highly Sensitive

and Reliable Detection of EGFR Exon 19 Deletions by Droplet Digital

Polymerase Chain Reaction", Mol Diagn Ther, 21 (5), pp. 555-562.

70. Paik J. H., Choe G., Kim H., et al. (2011), "Screening of anaplastic

lymphoma kinase rearrangement by immunohistochemistry in non-

small cell lung cancer: correlation with fluorescence in situ

hybridization", J Thorac Oncol, 6(3), pp. 466-472.

71. Park S., Olsen S., Ku B. M., Lee M. S., et al. (2021), “High

concordance of actionable genomic alterations identified between

circulating tumor DNA-based and tissue-based next-generation

sequencing testing in advanced non-small cell lung cancer: The Korean

Lung Liquid Versus Invasive Biopsy Program”. Cancer. 15;127(16), pp

3019-3028.

72. Papadopoulou E., Tsoulos N., Tsantikidi K., et al. (2019), "Clinical

feasibility of NGS liquid biopsy analysis in NSCLC patients", PLoS

One, 14(12), pp. 0226853.

73. Pennell N., Arcila M., Gandara D., et al. (2019), "Biomarker Testing

for Patients With Advanced Non-Small Cell Lung Cancer", Am. Soc.

Clin. Oncol, , 39, pp. 531–542.

74. Pérez-Callejo D., Romero A., Provencio M., et al. (2016), "Liquid

biopsy based biomarkers in non-small cell lung cancer for diagnosis

and treatment monitoring", Transl Lung Cancer Res, 5 (5), pp. 455-465.

75. Pham T., Bui L., Kim G., et al. (2019), "Cancers in Vietnam-Burden

and Control Efforts: A Narrative Scoping Review", Cancer Control,

26(1), 1073274819863802.

76. Piperdi B., Perez-Soler R. (2012), "Role of erlotinib in the treatment

of non-small cell lung cancer: clinical outcomes in wild-type epidermal growth factor receptor patients", Drugs, 72 Suppl 1(1), pp. 11-9.

77. Pirker R., Filipits M. (2016), "Personalized treatment of advanced non- small-cell lung cancer in routine clinical practice", Cancer Metastasis Rev, 35, pp. 141-150.

78. Pourhoseingholi M.A., Vahedi M., Rahimzadeh M. (2013), “Sample size calculation in medical studies”, Gastroenterol Hepatol Bed Bench, 6(1):14-7.

79. Powrózek T., Krawczyk P., Jarosz B., et al. (2014), "The application

of real-time PCR technique to detect rare cell clones with primary

T790M Substitution of EGFR gene in metastases of non-small cell lung

cancer to the central nervous system in chemotherapy-naive patients",

Pathol Oncol Res, 20 (4), pp. 945-951.

80. Prabhakar C.N. (2015), "Epidermal growth factor receptor in non-

small cell lung cancer", Transl Lung Cancer Res, 4 (2), pp. 110-118.

81. Prager D., Cameron R. (2000), Bronchogenic carcinoma, Textbook of

respiratory medicine 3rd, Vol 2, WB Saunders Company, pp. 1415 –

1451.

82. Pruneri G., De Braud F., Sapino A., et al. (2021), “Next-Generation

Sequencing in Clinical Practice: Is It a Cost-Saving Alternative to a

Single-Gene Testing Approach?”, Pharmacoecon Open, 5(2), pp. 285-

298.

83. Qiu M., Wang J., Xu Y., et al. (2015), "Circulating tumor DNA is

effective for the detection of EGFR mutation in non-small cell lung

cancer: a meta-analysis", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 24 (1),

pp. 206-212.

84. Remon J., Lacroix L., Jovelet C. (2019), "Real-World Utility of an

Amplicon-Based Next-Generation Sequencing Liquid Biopsy for Broad

Molecular Profiling in Patients With Advanced Non-Small-Cell Lung

Cancer", JCO Precis Oncol, 3, PO.18.00211.

85. Rikova K., Guo A., Zeng Q., et al. (2007), "The global survey of

phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer",

Cell, 131(6), pp. 1190-203.

86. Román M., Baraibar I., López I., et al. (2018), "KRAS oncogene in

non-small cell lung cancer: clinical perspectives on the treatment of an

old target", Mol. Cancer, 17(1), pp. 33.

87. Sacher A. G., Dahlberg S. E., Heng J., et al. (2016), "Association

Between Younger Age and Targetable Genomic Alterations and

Prognosis in Non-Small-Cell Lung Cancer", JAMA Oncol, 2(3), pp.313-

320.

88. Sasaki H., Endo K., Konishi A., et al. (2005), "EGFR Mutation status

in Japanese lung cancer patients: genotyping analysis using

LightCycler", Clin Cancer Res,11(8), pp. 2924-2929.

89. Sato M., Shames D. S., Gazdar A. F., et al. (2007), "A translational

view of the molecular pathogenesis of lung cancer", J Thorac Oncol,

2(4), pp.327-343.

90. Sharma S. V., Bell D. W., Settleman J., et al. (2007), "Epidermal

growth factor receptor mutations in lung cancer", Nat Rev Cancer, 7(3),

pp.169-181.

91. Shaw A. T, Ou S. H, Bang Y. J., et al. (2019), "Crizotinib in ROS1-

rearranged advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC)", Ann.

Oncol, 30, pp.1121–1126.

92. Shi Y., Au J. S., Thongprasert S., et al. (2014), "A prospective,

molecular epidemiology study of EGFR mutations in Asian patients

with advanced non-small-cell lung cancer of adenocarcinoma histology

(PIONEER)", J Thorac Oncol, 9(2), pp.154-162.

93. Shigematsu H., Lin L., Takahashi T., et al. (2005), "Clinical and

biological features associated with epidermal growth factor receptor

gene mutations in lung cancers", J Natl Cancer Inst, 97(5), pp.339-346.

94. Shigematsu H., Gazdar A. F. (2006), "Somatic mutations of epidermal

growth factor receptor signaling pathway in lung cancers", Int J

Cancer, 118(20), pp.257-262.

95. Shim H. S.., Lee H., Park E. J., et al. (2011), "Histopathologic

characteristics of lung adenocarcinomas with epidermal growth factor

receptor mutations in the International Association for the Study of

Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society

lung adenocarcinoma classification", Arch Pathol Lab Med, 135,

pp.1329-1334.

96. Sholl L. M., Sun H., Butaney M., et al. (2013), "ROS1

immunohistochemistry for detection of ROS1-rearranged lung

adenocarcinomas", Am J Surg Pathol, 37(9), pp.1441-1449.

97. Soda M., Choi Y. L., Enomoto M., et al. (2007), "Identification of the

transforming EML4-ALK fusion gen in non-small-cell lung cancer",

Nature, 448(7153), pp.561-566.

98. Soria J. C., Ohe Y., Vansteenkiste J., et al. (2018), "Osimertinib in

Untreated EGFR-Mutated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer",

The New England journal of medicine, 378, pp.113–25.

99. Steendam C. M. J., Atmodimedjo P., de Jonge E., et al. (2019),

"Plasma Cell-Free DNA Testing of Patients With EGFR Mutant Non-

Small-Cell Lung Cancer: Droplet Digital PCR Versus Next-Generation

Sequencing Compared With Tissue-Based Results", JCO Precis Oncol,

3, pp.1-9.

100. Stitz R., Buder A., Silye R., Baumgartner B., et al. (2021), "Validation

of a next-generation sequencing assay for the detection of EGFR

mutations in cell-free circulating tumor DNA", Exp Mol Pathol,123,

pp.104685.

101. Sung H., Ferlay J., Siegel R. L., et al. (2021), "Global cancer statistics

2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for

36 cancers in 185 countries", CA Cancer J Clin, 71(3), pp.209-249.

102. Tafe L. J., Pierce K. J,. Peterson J. D., et al. (2016), "Clinical Genotyping of Non-Small Cell Lung Cancers Using Targeted Next- Generation Sequencing: Utility of Identifying Rare and Co-mutations in Oncogenic Driver Genes", Neoplasia, 18(9), pp. 577–583.

103. Tan A. C, Lai G. G. Y., Tan G. S., et al. (2020), “Utility of incorporating next-generation sequencing (NGS) in an Asian non-small cell lung cancer (NSCLC) population: Incremental yield of actionable alterations and cost-effectiveness analysis”, Lung Cancer, 139, pp. 207-

215.

104. Taylor R., Najafi F., Dobson A. (2007), "A meta-analysis of studies of

passive smoking and lung cancer: effects of study type and continent",

Int J Epidemiol, 36(5), pp.1048-1059.

105. Taylor S. C.., Laperriere G., Germain H. (2017), "Droplet Digital

PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant

targets: from variable nonsense to publication quality data", Scientific

reports, 7, pp.2409.

106. Thun M. J., Carter B. D., Feskanich D., el al. (2013), "50-year trends

in smoking-related mortality in the United States", N Engl J med, 368,

pp.351- 364.

107. Tiseo M.., Rossi G., Capelletti M., et al. (2009), "Predictors of gefitinib

outcomes in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC): study of a

comprehensive panel of molecular markers", Lung Cancer, 67(3), pp.355-

60.

108. Tomasini P., Walia P., Labbe C., et al. (2016), "Targeting the KRAS

Pathway in Non-Small Cell Lung Cancer", Oncologist, 21 (12),

pp.1450-1460.

109. Torres S., González Á., Cunquero Tomas A. J., et al. (2020), "A

profile on cobas® EGFR Mutation Test v2 as companion diagnostic for

first-line treatment of patients with non-small cell lung cancer", Expert

Rev Mol Diagn, 20(6), pp.575-582.

110. Travis W. D., Brambilla E., Nicholson A. G., et al. (2015), "The 2015

World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of

Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004

Classification", J Thorac Oncol, 10(9), pp.1243-1260.

111. Travis W. D., Brambilla E., Noguchi M., et al. (2011), "International

association for the study of lung cancer/American thoracic society/European

respiratory society international multidisciplinary classification of lung

adenocarcinoma", J Thorac Oncol, 6(2), pp. 244-285.

112. Wang R., Zhang Y., Pan Y., et al. (2015), "A comprehensive

investigation of oncogenic driver mutations in Chinese non-small cell

lung cancer patients", Oncotarget. 27; 6(33), pp. 34300-8.

113. Wong S. Q., Li J., Tan A. Y., et al. (2014), "Sequence artifacts in a

prospective series of formalin-fixed tumors tested for mutations in

hotspot regions by massively parallel sequencing", BMC Medical

Genomics, 13, pp. 7-23.

114. Wu J. Y., Wu S. G., Yang C. H., et al. (2011), "Comparison of

gefitinib and erlotinib in advanced NSCLC and the effect of EGFR

mutations", Lung Cancer. 72(2), pp. 205-12.

115. Yang X., Zhuo M., Ye X., et al. (2016), "Quantification of mutant

alleles in circulating tumor DNA can predict survival in lung cancer",

Oncotarget, (15), pp. 20810-24.

116. Yoshida T., Yoh K.., Niho S., et al. (2015), "RECIST progression

patterns during EGFR tyrosine kinase inhibitor treatment of advanced

non-small cell lung cancer patients harboring an EGFR mutation",

Lung Cancer, 90 (2), pp. 477-483.

117. Zehir A., Benayed R., Shah R. H., et al. (2017), "Mutational landscape

of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of

10,000 patients", Nat Med, 23(6):703-713.

118. Zhang H., Liu R., Yan C., et al. (2019), "Advantage of Next-

Generation Sequencing in Dynamic Monitoring of Circulating Tumor

DNA over Droplet Digital PCR in Cetuximab Treated Colorectal

Cancer Patients", Translational oncology, 12(3), pp. 426–31.

119. Zhang J., Chiodini R., Badr A., Zhang G., et al. (2011), "The impact of

next-generation sequencing on genomics", J Genet Genomics, 38(3),

pp. 95-109.

120. Zhang Y. L, Yuan J. Q, Wang K. F., et al. (2016), "The prevalence of

EGFR mutation in patients with non-small cell lung cancer: a

systematic review and meta-analysis", Oncotarget 7(48), pp. 78985–

78993.

121. Zhuang X., Zhao C., Li J., et al. (2019), "Clinical features and

therapeutic options in non-small cell lung cancer patients with

concomitant mutations of EGFR, ALK, ROS1, KRAS or BRAF", Cancer

Med, 8(6), pp. 2858–2866.

PHỤ LỤC 1

MẪU PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN BỆNH NHÂN

Mã số hồ sơ:……………………………….Khoa:………………………..

1. THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên: ………………………………………………………

Năm sinh:………………….Nam/Nữ:……….…………………

Hút thuốc lá: Có / không

2.ĐẶC ĐIỂM BỆNH UNG THƯ PHỔI

Chẩn đoán lâm sàng:……………………………………………

Giai đoạn (TNM):………………………………………………

Giải phẫu mô bệnh học:

+ Mã số GPB:…………………………………………………

+ Kết quả:……………………………………………………..

□ UTBM tuyến □ UTBM vảy

□ UTBM tuyến vảy □ UTBM tế bào lớn

□ Khác

3. XÉT NGHIỆM GEN

Kết quả của giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) từ mô u

EGFR :

Không đột biến

Đột biến: exon………. – loại đột biến………………….

ALK:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

ROS1:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

KRAS:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

NRAS:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

BRAF:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

Kết quả của giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) từ sinh thiết lỏng:

Nồng độ cfDNA:

EGFR:

Không đột biến

ALK:

Đột biến: exon………. – loại đột biến…………………. Không đột biến

Đột biến: …………………………………

ROS1:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

KRAS:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

NRAS:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

BRAF:

Không đột biến

Đột biến: …………………………………

Kết quả đột biến EGFR từ Cobas

EGFR :

Không đột biến

Đột biến: exon………. – loại đột biến………………….

Kết quả đột biến EGFR từ ddPCR

EGFR :

Không đột biến

Đột biến: exon………. – loại đột biến………………….

PHỤ LỤC 2

BẢN THÔNG TIN DÀNH CHO ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU

Tên nghiên cứu: Khảo sát đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới”

Nghiên cứu viên chính: Ths. Bs. Đặng Huỳnh Anh Thư.

Đơn vị chủ trì: Đại học Y dược TP.HCM.

I. THÔNG TIN VỀ NGHIÊN CỨU

Mục đích và tiến hành nghiên cứu

Ung thư phổi là một trong những bệnh ung thư phổ biến. 80-85% là ung thư phổi không tế bào nhỏ. Hiện nay có thể đẩy lùi ung thư phổi nhờ xét nghiệm đột biến gen. Các thuốc nhắm trúng đích có thể ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách tác động vào các gen đột biến và thu gọn khối u. Các thuốc này dùng đường uống giúp cải thiện chất lượng cuộc sống rõ rệt và kéo dài thời gian sống. Các loại đột biến gen khác nhau sẽ có thuốc điều trị khác nhau, do đó việc xét nghiệm tìm đột biến gen là rất cần thiết. Các đột biến gen có liên quan đến điều trị và tiên lượng bệnh thường gặp là EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF.

Bên cạnh xét nghiệm đột biến bằng mẫu mô u sinh thiết, đột biến còn có thể phát hiện thông qua xét nghiệm máu. Đây là phương pháp tốt để lập kế hoạch điều trị ung thư, khảo sát sự đáp ứng thuốc của khối u và chữa trị ung thư tái phát.

Giải trình tự gen thế hệ mới là phương pháp giải trình tự đa gen, cho phép giải trình tự đồng thời nhiều gen một lúc và tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân hơn so với xét nghiệm từng gen đơn lẻ. Vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Khảo sát đột biến gen ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới”

Nghiên cứu được tại Bệnh viện Lao và bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch từ 9/2017 đến 9/2019 với số lượng 140 ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn IIIB-IV chưa hóa trị, xạ trị.

Bản chất và mức độ tham gia của những người tham gia nghiên cứu:

+ Nghiên cứu viên chỉ thu thập mẫu mô đã sinh thiết của bệnh nhân hiện đang lưu trữ

ở khoa giải phẫu bệnh.

+ 30 bệnh nhân trong số 140 bệnh nhân được lấy máu một lần duy nhất 10ml để xét

nghiệm.

Các nguy cơ và bất lợi

Bệnh nhân không phải chịu bất kỳ nguy cơ hay bất lợi nào trong việc thu thập mẫu mô u vì mẫu mô sinh thiết của bệnh nhân đã có lưu trữ sẵn ở khoa giải phẫu bệnh.

Việc lấy máu tương tự như lấy máu xét nghiệm thông thường. Việc lấy máu này rất nhanh chóng và dễ dàng mặc dù có thể hơi khó chịu ban đầu. Hầu hết mọi người không có phản ứng nghiêm trọng nào khi lấy máu. Có thể có bầm máu nhẹ nơi lấy sau lấy máu, việc này có thể phòng ngừa bằng cách đè chặt bông gòn cầm máu.

Các lợi ích

Bệnh nhân sẽ được xét nghiệm các đột biến gen EGFR, ALK, ROS1, KRAS, NRAS, BRAF hoàn toàn miễn phí. ( Gía xét nghiệm mỗi gen từ 2-3 triệu)

Bệnh nhân sẽ được cung cấp kết quả từ nghiên cứu ngay khi có kết quả. Kết quả này có thể sẽ cần thiết trong quá trình điều trị bệnh về sau của bệnh nhân. Kết quả sẽ được trả về theo địa chỉ bệnh nhân cung cấp, nếu thất lạc bệnh nhân liên hệ nghiên cứu viên để lấy khi đến tái khám.

Người liên hệ

Ths. Bs. Đặng Huỳnh Anh Thư.

Số điện thoại: 0334892409

Sự tự nguyện tham gia

Bệnh nhân được quyền tự quyết định, không hề bị ép buộc tham gia

Bệnh nhân có thể rút lui ở bất kỳ thời điểm nào mà không bị ảnh hưởng gì đến việc điều trị và chăm sóc.

Tính bảo mật

Tất cả thông tin, kết quả của bệnh nhân đều được bảo mật.

II. CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU

Tôi đã đọc và hiểu thông tin trên đây, đã có cơ hội xem xét và đặt câu hỏi về thông tin liên quan đến nội dung trong nghiên cứu này. Tôi đã nói chuyện trực tiếp với nghiên cứu viên và được trả lời thỏa đáng tất cả các câu hỏi. Tôi nhận một bản sao của Bản Thông tin cho đối tượng nghiên cứu và chấp thuận tham gia nghiên cứu này. Tôi tự nguyện đồng ý tham gia.

Chữ ký của người tham gia:

Họ tên (viết tắt)___________________ Chữ ký___________________

Ngày tháng năm_________________

Chữ ký của Nghiên cứu viên/người lấy chấp thuận:

Tôi, người ký tên dưới đây, xác nhận rằng bệnh nhân/người tình nguyện tham gia nghiên cứu ký bản chấp thuận đã đọc toàn bộ bản thông tin trên đây, các thông tin này đã được giải thích cặn kẽ cho Ông/Bà và Ông/Bà đã hiểu rõ bản chất, các nguy cơ và lợi ích của việc Ông/Bà tham gia vào nghiên cứu này.

Họ tên ___________________ Chữ ký___________________

Ngày tháng năm_________________

PHỤ LỤC 3

Danh sách các loại đột biến gen EGFR có thể phát hiện được bằng xét

nghiệm EGFR Cobas V2

Nhóm đột biến EGFR 42 loại đột biến EGFR

G719X Ex19Del 2156G>C 2155G>A 2155G>T 2240_2251del12 2239_2247del9 2238_2255del18 2235_2249del15 2236_2250del15 2239_2253del15 2239_2256del18 2237_2254del18 2240_2254del15 2240_2257del18 2239_2248TTAAGAGAAG>C 2239_2251>C 2237_2255>T 2235_2255>AAT 2237_2252>T 2239_2258>CA 2239_2256>CAA 2237_2253>TTGCT 2238_2252>GCA 2238_2248>GC 2237_2251del15 2236_2253del18 2235_2248>AATTC 2235_2252>AAT 2235_2251>AATTC 2253_2276del24 Exon Exon 18 Exon 19

Exon 20 Exon 21 Đột biến L858R L861Q T790M Xóa đoạn G917C G719S G719A 2237_2257>TCT 2238_2252del15 2233_2247del15 2303G>T 2369C>T 2307_2308ins9GCCAGCGTG 2319_2320insCAC 2310_2311insGGT 2311_2312ins9GCGTGGACA 2309_2310AC>CCAGCGTGGAT 2573T>G 2573_2574TG>GT 2582T>A Biến đổi nucleotid 2537T > G 2582T > A 2369C > T c2235-2249del c2236-2250del c2237-2251del c2237-2255delinsT c2239-2248delinsC c2239-2251delinsC c2240-2254del c2240-2257del c2239-2256del c2239-2247del C2155G > T C2155G > A C2156G > C S768I T790M Ex20Ins L858R L861Q Exon 21 21 20 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 18 18 18

PHỤ LỤC 4

KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỜI TỪ MÔ U CHO 6 GEN EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS

NGS mô u

Mẫu

Gen

Đột biến

Kiểu gen

MAF (%)

LBL001

EGFR

ins20

insCAGCGTGGA

25

LBL002 LBL003 LBL004 LBL005 LBL006 LBL007 LBL008 LBL009 LBL011 LBL012

EGFR (-) (-) (-) (-) (-) EGFR (-) (-) (-)

H773 (-) (-) (-) (-) (-) L768 (-) (-) (-)

70 (-) (-) (-) (-) (-) 45 (-) (-) (-)

LBL013

EGFR

ins20

20

LBL014 LBL015

(-) (-)

H773A (-) (-) (-) (-) (-) L768C (-) (-) (-) TCCCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAAT ATTGTCTTTGTGT (-) L858R

(-) 65

LBL016

ALK

42300597

9

LBL017 LBL020 LBL021 LBL022 LBL023 LBL024 LBL025 LBL026

LBL027

EGFR (-) (-) (-) (-) KRAS (-) EGFR KRAS EGFR

L858R (-) (-) (-) (-) G12V (-) GGAATTAAGAGAAGC G12C NA

90 (-) (-) (-) (-) 22 (-) 23 23 2

LBL028

ALK

42299121

47

LBL029 LBL030

(-) EGFR

(-) L858 EML4- ALK L858 (-) (-) (-) (-) G12 (-) del19 G12 ins20 EML4- ALK (-) del19

(-) GAATTAAGAGAAGCA

(-) 8

LBL031 LBL037 LBL040 LBL041

EGFR (-) EGFR (-)

ins20 (-) L858 (-)

ACAACCCCC (-) L858R (-)

25 (-) 3 (-)

LBL053

EGFR

del19

17

LBL054 LBL055 LBL056 LBL057

(-) KRAS KRAS (-)

(-) G12 Q61 (-)

(-) 21 4 (-)

LBL061

EGFR

del19

5%

LBL063 LBL064 LBL065

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

LBL066

EGFR

del19

33

LBL068 LBL069 LBL071 LBL072

(-) EGFR (-) (-)

(-) L858 (-) (-)

(-) 8 (-) (-)

LBL073

EGFR

Del19

23

LBL074 LBL076 LBL077 LBL078

(-) (-) EGFR (-)

(-) (-) L858 (-)

(-) (-) 22 (-)

LBL079

EGFR

Del19

47

LBL081

EGFR

Del19

15

NC_000007.14:g.55174771_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) G12D Q61R (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) L858R (-) (-) NC_000007.14:g.55174775_55174789delATTA AGAGAAGCAAC (-) (-) L858R (-) NC_000007.14:g.55174777_55174795delTAAG AGAAGCAACATCTC NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC G12D

LBL083

KRAS

G12

43

LBL085

EGFR

L858

L858R

39

LBL087

KRAS

G12

G12C

47

LBL089

KRAS

G12

55

LBL095

EGFR

Del19

92

G12C NC_000007.14:g.55174773_55174787delGGAA TTAAGAGAAGCA

LBL096

EGFR

Ins20

NC_000007.14:g.55181328_55181330insGTG

46

LBL099

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL100

(-)

(-)

(-)

LBL101

EGFR

Del19

2

LBL102

EGFR

Del19

19

LBL103

(-)

(-)

(-) NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-)

(-)

LBL104

EGFR

L858

L858R

54

LBL105

EGFR

Del19

NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT

1

TAAGA

LBL106

EGFR

Del19

96

LBL107

EGFR

Del19

30

EGFR

Del19

1

LBL108

KRAS

G12

59

LBL109

EGFR

Ins20

44

EGFR

Del19

40

LBL110

EGFR

Del19

2

LBL111

KRAS

G12

NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA G12D NC_000007.14:g.55181309_55181317insCAGC GTGGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA G12D

22

TBL001

KRAS

G12

G12C

13

TBL002

EGFR

L858

L858R

32

TBL004

KRAS

G12

G12A

26

TBL007

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL008

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL009

EGFR

Del19

39

TBL010

EGFR

Del19

30

NC_000007.14:g.55174775_55174789delATTA AGAGAAGCAAC NC_000007.14:g.55174773_55174787delGGAA TTAAGAGAAGCA

TBL011

KRAS

G13

G13S

3

TBL013

EGFR

Del19

10

NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC

TBL014

KRAS

G12

G12S

29

TBL015

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL017

KRAS

G12

G12D

35

TBL018

EGFR

Del19

30

NC_000007.14:g.55174777_55174796delTAAG AGAAGCAACATCTC

TBL019

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL020

EGFR

L858

L858R

39

TBL022 TBL024

(-) EGFR

(-) L858

(-) L858R

(-) 11

EGFR

G719

G719C

25

TBL026

EGFR

S768

S768I

15

TBL027

EGFR

Del19

NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA

30

TTAAGAGAAGC

TBL029

TBL030

TBL032 TBL033

(-) EGFR KRAS (-) KRAS

(-) L858 G13 (-) G12

(-) L858R G13S (-) G12V

(-) 76 7 (-) 39

TBL034

(-)

-

-

-

TBL035

EGFR

L858

L858R

27

TBL036

EGFR

L858

L858R

67

TBL037

EGFR

L858

L858R

14

TBL038

EGFR

Del19

43

NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC (-) (-)

TBL039 TBL040

(-) (-)

(-) (-)

(-) (-)

TBL041

EGFR

L858

L858R

87

TBL042

TBL043 TBL045

EGFR KRAS EGFR (-)

L858 G12 L858 (-)

29 48 8 (-)

EGFR

Del19

47

TBL046

KRAS

G13

4

TBL047

EGFR

Ins20

62

L858R G12V L858R (-) NC_000007.14:g.55174774_55174788delGAAT TAAGAGAAGCAA G13S NC_000007.14:g.55181305_55181313insTGGC CAGCG

TBL048

EGFR

L858

L858R

73

TBL051

EGFR

L858

L858R

95

TBL052

BRAF

G469

G469R

4

TBL055

EGFR

L858

L858R

1 read (<2%)

TBL056

EGFR

L858

L858R

16

TBL057

EGFR

L858

L858R

80

TBL058

EGFR

L858

L858R

84

TBL059

EGFR

L858

L858R

(-)

(-)

(-)

1 read (<2%) (-)

TBL063

TBL064

EGFR

Ins20

69

NC_000007.14:g.55181309_55181317insCAGC GTGGA

TBL065

EGFR

L858

L858R

46

TBL066

EGFR

Del19

33

TBL068

EGFR

Del19

29

NC_000007.14:g.55174773_55174787delGGAA TTAAGAGAAGCA NC_000007.14:g.55174773_55174782delGAAT TAAGA

TBL069

EGFR

Del19

82

NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC

TBL070

EGFR

Del19

37

TBL071

EGFR

Del19

69

NC_000007.14:g.55174773_55174789delGGAA TTAAGAGAAGCAAC NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC

TBL072

EGFR

L858

L858R

49

TBL073

EGFR

G719

G719A

96

TBL074

KRAS

G12

G12V

26

TBL075

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL077

EGFR

Del19

20

TBL078

EGFR

Ins20

38

NC_000007.14:g.55174772_55174786delGGAA TTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55181309_55181317insCAGC GTGGA

TBL079

EGFR

L858

L858R

47

TBL080

KRAS

G12

G12C

4

EGFR

G719

G719A

54

TBL081

EGFR

L861

L861Q

49

TBL082

EGFR

L858

L858R

25

TBL083

KRAS

Q61

Q61H

7

TBL084

KRAS

G12

G12V

20

TBL085

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL086

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL087

EGFR

L858

L858R

85

TBL088

BRAF

K483

K483N

2

TBL089

EGFR

L858

L858R

83

EGFR

G719

G719A

25

TBL090

EGFR

L861

L861Q

23

TBL091

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL092

(-)

(-)

G12C

35

TBL093

KRAS

G12

L858R

43

TBL094

EGFR

L858

(-) G12C

(-) 63

TBL095 TBL096

(-) KRAS

(-) G12

PHỤ LỤC 5

KẾT QUẢ SO SÁNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỜI TỪ MÔ U VÀ EGFR COBAS V2 TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN EGFR

NGS mô u

Mẫu

Đột biến

Kiểu gen

EGFR Cobas V2

MAF (%)

LBL001

ins20

insCAGCGTGGA

ins20

25

LBL002

H773

H773A

70

(-)

LBL003 LBL004 LBL005 LBL006 LBL007 LBL008 LBL009 LBL011 LBL012

(-) (-) (-) (-) (-) L768 (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-) (-) 45 (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

20

(-)

LBL013

ins20

LBL014 LBL015 LBL016 LBL017 LBL020 LBL021 LBL022 LBL023 LBL024 LBL025 LBL026 LBL027

(-) L858 (-) L858 (-) (-) (-) (-) (-) (-) del19 ins20

(-) (-) (-) (-) (-) L768C (-) (-) (-) TCCCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCC AATATTGTCTTTGTGT (-) L858R (-) L858R (-) (-) (-) (-) (-) (-) GGAATTAAGAGAAGC NA

(-) 65 (-) 90 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 23 2

(-) L858R (-) L858R (-) del19 (-) (-) (-) (-) del19 (-)

LBL028

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL029

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL030

del19

GAATTAAGAGAAGCA

18

del19

LBL031 LBL037 LBL040 LBL041

ins20 (-) L858 (-)

25 (-) 3 (-)

(-) (-) (-) (-)

17

del19

LBL053

del19

ACAACCCCC (-) L858R (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786delG GAATTAAGAGAAGC

LBL054 LBL055 LBL056 LBL057

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

LBL061

del19

15

del19

LBL063 LBL064 LBL065

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

LBL066

del19

33

del19

LBL068 LBL069 LBL071 LBL072

(-) L858 (-) (-)

(-) 18 (-) (-)

(-) L858R (-) del19

LBL073

Del19

23

(-)

LBL074 LBL076 LBL077 LBL078

(-) (-) L858 (-)

(-) (-) 22 (-)

(-) (-) L858R (-)

LBL079

Del19

47

del19

LBL081

Del19

15

del19

LBL083

(-)

(-) (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786delG GAATTAAGAGAAGC (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786delG GAATTAAGAGAAGC (-) L858R (-) (-) NC_000007.14:g.55174775_55174789delAT TAAGAGAAGCAAC (-) (-) L858R (-) NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC (-)

(-)

(-)

LBL085

L858

L858R

39

L858R

LBL087

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL089

(-)

(-)

(-)

LBL095

Del19

92

del19

LBL096

Ins20

46

(-)

LBL099

(-)

(-) NC_000007.14:g.55174773_55174787delG GAATTAAGAGAAGCA NC_000007.14:g.55181328_55181330insGT G (-)

(-)

(-)

LBL100

(-)

(-)

(-)

LBL101

Del19

2

(-)

LBL102

Del19

19

del19

LBL103

(-)

(-) NC_000007.14:g.55174773_55174782delG AATTAAGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC (-)

(-)

(-)

LBL104

L858

L858R

54

L858R

LBL105

L858

1

L858R

LBL106

Del19

96

del19

L858R NC_000007.14:g.55174773_55174782delG AATTAAGA

LBL107

Del19

30

del19

LBL108

Del19

1

(-)

LBL109

Ins20

44

ins20

Del19

40

del19

LBL110

NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55174773_55174782delG AATTAAGA NC_000007.14:g.55181309_55181317insCA GCGTGGA NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55174773_55174782delG AATTAAGA (-)

Del19 (-)

2 (-)

LBL111

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL001

(-)

TBL002

(-)

L858R (-)

L858 (-)

32 (-)

TBL004

(-)

(-)

TBL007

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL008

(-)

(-)

(-)

TBL009

Del19

39

del19

TBL010

del19

Del19 (-)

NC_000007.14:g.55174775_55174789delAT TAAGAGAAGCAAC NC_000007.14:g.55174773_55174787delG GAATTAAGAGAAGCA (-)

30 (-)

TBL011

(-)

TBL013

del19

Del19 (-)

NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC (-)

10 (-)

TBL014

(-)

TBL015

(-)

(-) (-)

(-) (-)

(-) (-)

TBL017

(-)

TBL018

Del19

30

del19

NC_000007.14:g.55174777_55174796delTA AGAGAAGCAACATCTC

(-)

TBL019

(-)

(-)

(-)

L858R

TBL020

L858

39

L858R

(-) L858R

TBL022 TBL024

(-) L858

(-) 11

(-) L858R

G719C

G719

25

TBL026

S768

15

G719X S768I

TBL027

Del19

30

del19

TBL029 TBL030

(-) L858

S768I NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC (-) L858R

(-) 76

(-) L858R

(-) (-)

(-) (-)

(-) (-)

TBL032

(-) (-)

(-)

(-)

L858R

TBL033

(-)

L858R

27

L858R

TBL034

L858

L858R

67

L858R

TBL035

L858

L858R

14

L858R

TBL036

L858

43

del19

TBL037

Del19

(-) (-)

(-) (-) 2 18 (-)

(-) (-) (-)

TBL038 TBL039 TBL041 TBL043 TBL045

(-) (-) L858 L858 (-)

47

del19

TBL046

Del19

62

TBL047

Ins20

NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC (-) (-) L858R L858R (-) NC_000007.14:g.55174774_55174788delG AATTAAGAGAAGCAA NC_000007.14:g.55181305_55181313insTG GCCAGCG

Ins20

L858R

73

L858R

TBL048

L858

TBL051

L858R (-)

L858R (-)

95 (-)

L858 (-)

TBL052

L858R

(-)

TBL055

L858

1 read (<2%)

L858R

16

L858R

TBL056

L858

L858R

80

L858R

TBL057

L858

L858R

84

L858R

TBL058

L858

L858R

(-)

TBL059

L858

(-)

1 read (<2%) (-)

(-)

(-)

TBL063

TBL064

Ins20

69

NC_000007.14:g.55181309_55181317insCA GCGTGGA

Ins20

TBL065

L858

L858R

46

L858R

TBL066

Del19

33

del19

TBL068

Del19

29

del19

NC_000007.14:g.55174773_55174787delG GAATTAAGAGAAGCA NC_000007.14:g.55174773_55174782delG AATTAAGA

TBL069

Del19

82

del19

NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC

TBL070

Del19

37

del19

NC_000007.14:g.55174773_55174789delG GAATTAAGAGAAGCAAC

del19

TBL071

Del19

69

NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC

L858R

TBL072

L858

L858R

49

TBL073

G719

G719A

96

G719X

(-)

(-)

(-)

TBL074

(-)

TBL075

(-)

(-)

-

del19

TBL077

Del19

20

del19

TBL078

Ins20

38

Ins20

NC_000007.14:g.55174772_55174786delG GAATTAAGAGAAGC NC_000007.14:g.55181309_55181317insCA GCGTGGA

TBL079

L858

L858R

47

L858R

TBL080

(-)

(-)

-

del19

G719

G719A

54

G719X

TBL081

L861

L861Q

49

L861Q

TBL082

L858R

L858 (-)

L858R (-)

25 (-)

TBL083

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL084

(-)

TBL085

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL086

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL087

L858

L858R

85

L858R

TBL088

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL089

L858

L858R

83

L858R

G719

G719A

25

TBL090

L861

L861Q

23

G719X L861Q

TBL091

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL092

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL093

(-)

(-)

(-)

(-)

43

TBL094

L858

L858R

L858R

TBL095

(-)

(-)

(-)

(-)

TBL096

(-)

(-)

(-)

(-)

PHỤ LỤC 6

KẾT QUẢ SO SÁNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TỪ SINH THIẾT LỎNG VÀ EGFR COBAS V2 MÔ U TRONG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN EGFR

NGS Sinh thiết lỏng

Mẫu

Đột biến

Kiểu gen

EGFR Cobas V2 mô u

MAF (%)

LBL001

ins20

insCAGCGTGGA

ins20

1.5

LBL002 LBL003 LBL004 LBL005 LBL006 LBL007 LBL008 LBL009 LBL011 LBL012

H773 (-) (-) (-) (-) (-) L768 (-) (-) (-)

H773A (-) (-) (-) (-) (-) L768C (-) (-) (-)

15 (-) (-) (-) (-) (-) 1.5 (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

LBL013

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL014 LBL015

(-) L858

(-) L858R

(-) 89

(-) L858R

LBL016

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL017 LBL020 LBL021 LBL022 LBL023 LBL024 LBL025 LBL026 LBL027

L858 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

L858R (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

2 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

L858R (-) del19 (-) (-) (-) (-) del19 (-)

LBL028

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL029

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL030

(-)

(-)

(-)

del19

LBL031 LBL037 LBL040 LBL041

ins20 (-) (-) (-)

ACAACCCCC (-) (-) (-)

29 (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

LBL053

del19

20

del19

LBL054 LBL055 LBL056 LBL057

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

LBL061

del19

NA

del19

LBL063 LBL064 LBL065

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

LBL066

del19

NA

del19

LBL068 LBL069 LBL071 LBL072

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

(-) L858R (-) del19

LBL073

del19

3

(-)

LBL074 LBL076 LBL077 LBL078

(-) (-) L858 (-)

NC_000007.14:g.55174771_55174786 delGGAATTAAGAGAAGC (-) (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786 delGGAATTAAGAGAAGC (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174771_55174786 delGGAATTAAGAGAAGC (-) (-) (-) (-) NC_000007.14:g.55174774_55174789 delATTAAGAGAAGCAAC (-) (-) L858R (-)

(-) (-) 19 (-)

(-) (-) L858R (-)

LBL079

(-)

(-)

(-)

del19

LBL081

del19

1%

del19

LBL083

(-)

NC_000007.14:g.55174771_55174786 delGGAATTAAGAGAAGC (-)

(-)

(-)

LBL085

L858

31

L858R

LBL087

del19

0.5

(-)

LBL089

(-)

(-)

(-)

LBL095

del19

89

del19

L858R NC_000007.14:g.55174772_55174787 delGAATTAAGAGAAGCA (-) NC_000007.14:g.55174772_55174787 delGAATTAAGAGAAGCA

LBL096

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL099

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL100

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL101

(-)

(-)

(-)

(-)

PHỤ LỤC 7

KẾT QUẢ SO SÁNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TỪ SINH THIẾT LỎNG VÀ SINH THIẾT MÔ U CHO 6 GEN EGFR, ALK, ROS1, BRAF, KRAS, NRAS

Sinh thiết lỏng

Sinh thiết mô

Mẫu

Gen

Kiểu gen

Gen

Kiểu gen

Đột biến

MAF (%)

Đột biến

MAF (%)

LBL001 EGFR

ins20

1.5

EGFR

ins20

25

EGFR H773

(-) (-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-) (-)

EGFR L768

LBL002 EGFR H773 (-) LBL003 (-) LBL004 (-) LBL005 (-) LBL006 LBL007 (-) LBL008 EGFR LBL009 LBL011 LBL012

(-) (-) (-) (-) (-) L768 (-) (-) (-)

(-) (-) (-)

insCAGCGTGG A H773A (-) (-) (-) (-) (-) L768C (-) (-) (-)

15 (-) (-) (-) (-) (-) 1.5 (-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

70 (-) (-) (-) (-) (-) 45 (-) (-) (-)

LBL013

(-)

(-)

(-)

(-)

EGFR

ins20

20

(-)

(-)

(-)

LBL014 LBL015 EGFR

(-) L858R

(-) 89

insCAGCGTGG A H773A (-) (-) (-) (-) (-) L768C (-) (-) (-) TCCCAGTTGA GCAGGTACT GGGAGCCAA TATTGTCTTT GTGT (-) L858R

(-) 65

LBL016

ALK

42300597

6

ALK

42300597

9

EGFR L858 EML4 -ALK EGFR L858

(-) (-) (-) (-)

LBL017 EGFR LBL020 LBL021 LBL022 LBL023 LBL024 KRAS LBL025

(-)

(-) L858 EML4- ALK L858 (-) (-) (-) (-) G12 (-)

L858R (-) (-) (-) (-) G12V (-)

2 (-) (-) (-) (-) 5 (-)

(-) (-) (-) (-) KRAS (-)

(-) (-) (-) (-) G12 (-)

90 (-) (-) (-) (-) 22 (-)

23

LBL026

(-)

(-)

(-)

(-)

EGFR

del19

LBL027

4

L858R (-) (-) (-) (-) G12V (-) GGAATTAAG AGAAGC G12C NA

23 2

KRAS

G12C

KRAS EGFR

4

42299121

47

LBL028

ALK

42299121

ALK

G12 EML4- ALK

G12 ins20 EML4 -ALK

LBL029

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL030

(-)

(-)

(-)

(-)

EGFR

del19

18

(-) GAATTAAGA GAAGCA

ins20 ACAACCCCC

ins20 ACAACCCCC

LBL031 EGFR LBL037 LBL040 LBL041

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

29 (-) (-) (-)

EGFR (-) (-) (-)

(-) (-) (-)

25 (-) (-) (-)

LBL053 EGFR

del19

20

EGFR

del19

17

(-)

(-)

LBL054 LBL055 KRAS LBL056 KRAS LBL057

(-)

(-) G12 Q61 (-)

(-) NA KRAS KRAS 3 (-) (-)

(-) G12 Q61 (-)

(-) 21 4 (-)

LBL061 EGFR

del19

NA

EGFR

del19

5%

LBL063 LBL064 LBL065

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

(-) (-) (-)

LBL066 EGFR

del19

NA

EGFR

del19

33

-

(-)

EGFR L858

LBL068 LBL069 LBL071 LBL072

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) (-)

(-) (-)

(-) (-)

(-) 18 (-) (-)

LBL073 EGFR

del19

3

EGFR Del19

23

(-)

(-) (-)

(-) (-)

EGFR L858

(-) (-) (-) NC_000007.14: g.55174771_551 74786delGGAA TTAAGAGAA GC (-) G12D Q61R (-) NC_000007.14: g.55174771_551 74786delGGAA TTAAGAGAA GC (-) (-) (-) NC_000007.14: g.55174771_551 74786delGGAA TTAAGAGAA GC (-) (-) (-) (-) NC_000007.14: g.55174774_551 74789delATTA AGAGAAGCA AC (-) G13C L858R (-)

LBL074 LBL076 KRAS LBL077 EGFR LBL078

(-)

(-) G13 L858 (-)

(-) 8 19 (-)

(-)

(-)

(-) (-) 22 (-)

LBL079

(-)

(-)

(-)

(-)

EGFR Del19

47

(-) (-) (-) NC_000007.14: g.55174771_55 174786delGGA ATTAAGAGA AGC (-) G12D Q61R (-) NC_000007.14: g.55174771_55 174786delGGA ATTAAGAGA AGC (-) (-) (-) NC_000007.14: g.55174771_55 174786delGGA ATTAAGAGA AGC (-) L858R (-) (-) NC_000007.14: g.55174775_55 174789delATT AAGAGAAGC AAC (-) (-) L858R (-) NC_000007.14: g.55174777_55 174795delTAA GAGAAGCAA

CATCTC

LBL081 EGFR

del19

1%

EGFR Del19

15

LBL083

(-)

(-)

KRAS

G12

(-)

NC_000007.14: g.55174772_55 174786delGGA ATTAAGAGA AGC G12D

43

NC_000007.14: g.55174771_551 74786delGGAA TTAAGAGAA GC (-)

LBL085 EGFR

L858

L858R

EGFR L858

L858R

31

39

KRAS

G12

KRAS

G12

G12C

10

47

LBL087

EGFR

del19

0.5

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL089 KRAS

G12

10

KRAS

G12

55

LBL095 EGFR

del19

89

EGFR Del19

92

G12C NC_000007.14: g.55174772_551 74787delGAAT TAAGAGAAG CA G12C NC_000007.14: g.55174772_551 74787delGAAT TAAGAGAAG CA

LBL096

(-)

(-)

(-)

EGFR

Ins20

46

(-)

LBL099

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

G12C NC_000007.14: g.55174773_55 174787delGGA ATTAAGAGA AGCA NC_000007.14: g.55181328_55 181330insGTG (-)

(-)

(-)

LBL100

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

LBL101

(-)

(-)

(-)

EGFR Del19

2

(-)

(-) NC_000007.14: g.55174773_55 174782delGAA TTAAGA